Name: 快速一步酶法合成海藻糖类似物的全净化水 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: 学习一步酶法合成海藻糖类似物的快速方法，采用全水相纯化工艺，实现高产率制备。该技术可用于结核分枝杆菌检测探针的生物医学研究，为疾病诊断提供高效环保的新途径。

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本工作由美国国立卫生研究院资助（R15 AI117670），资助对象为 B.M.S. 和 P.J.W.，同时由研究公司（Research Corporation）授予 P.J.W. 一项科特雷尔大学学者奖（Cottrell College Scholar Award，编号20185）。L.M.M. 获得了卡内基梅隆大学教务长奖学金的支持。

1. 从Top10 E. coli 中表达并纯化TreT
注意：请与作者联系以获取表达 TreT 的 E. coli 菌株（pBAD TreT 质粒，含有在 AraC 蛋白调控下的 T. tenax tret 基因，已转化至 Top10 E. coli19）及相关材料转移协议。以下实验方案通常可获得约 4 mg/L 的蛋白质产量。
<ol>
	<li>准备3 mL表达TreT的E. coli过夜培养物。
	<ol>
		<li>将转化了pBAD-TreT表达载体的Top10 E. coli在含有100 µg/mL氨苄青霉素的LB（Luria-Bertani）琼脂平板上划线。</li>
		<li>将平板在37 °C下培养约48小时。</li>
		<li>从平板上挑取单个菌落，接种至含有100 µg/mL氨苄青霉素的3 mL LB液体培养基中，置于培养管内。</li>
		<li>将培养管置于摇床培养箱中，在37 °C、175 rpm条件下振荡培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导表达TreT的E. coli中的蛋白表达。
	<ol>
		<li>向一个2,800 mL的Fernbach培养瓶中加入750 mL添加了100 μg/mL氨苄青霉素的优质肉汤（Terrific Broth），并从瓶中取出1 mL培养液转移至比色皿中，留作后续空白对照使用。</li>
		<li>将步骤1.1.4中获得的3 mL过夜培养物加入培养瓶中，将培养瓶放入培养箱，在37 °C、200 rpm条件下振荡培养。定期使用步骤1.2.1中收集的空白对照，检测培养物在600 nm处的吸光度。</li>
		<li>当600 nm处的吸光度达到0.5–1.0时，向培养物中加入750 µL的1 M阿拉伯糖溶液（终浓度为1 mM），以诱导TreT表达。将培养瓶放回培养箱，在37 °C、200 rpm条件下继续振荡培养过夜。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>收集并裂解表达TreT的E. coli细胞。
	<ol>
		<li>将培养物转移至聚丙烯瓶中，在4 °C、4000 × g条件下离心15分钟。</li>
		<li>弃去上清液，用15 mL磷酸盐缓冲液（PBS）重悬沉淀。</li>
		<li>将细胞悬液转移至50 mL锥形管中，在4 °C、4,000 × g条件下离心15分钟。弃去上清液，可立即进行细胞裂解（步骤1.3.4），或将沉淀在-80 °C长期保存。</li>
		<li>在50 mL锥形管中，将1片蛋白酶抑制剂小片溶解于20 mL洗涤缓冲液（50 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、20 mM 咪唑，pH 8.0）中。</li>
		<li>将含蛋白酶抑制剂的洗涤缓冲液转移至含有沉淀的锥形管中，涡旋振荡直至沉淀完全重悬。</li>
		<li>将重悬的细胞转移至100 mL烧杯中，通过超声处理裂解细胞（超声参数：开启45秒，关闭45秒，总运行时间2分15秒，振幅75%）。</li>
		<li>将裂解液转移至50 mL金属锥形管中，在4 °C、15,000 × g条件下离心60分钟。</li>
		<li>将裂解液通过0.2–0.45 μm的一次性针筒滤器过滤至50 mL锥形管中，以澄清裂解液。 
		NOTE: 通常获得的裂解液浓度为100 mg/mL。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用快速蛋白液相色谱（FPLC）从E. coli细胞裂解液中纯化TreT。
	<ol>
		<li>安装FPLC系统并连接镍亲和层析柱（5 mL柱床体积）。先用10 mL去离子水清洗层析柱，直至柱内无杂质残留。随后以1 mL/min的流速，使用20 mL洗涤缓冲液（50 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、20 mM 咪唑，pH 8.0）平衡层析柱。</li>
		<li>将步骤1.3.8获得的裂解液（20 mL）上样至层析柱，以1 mL/min的流速用洗涤缓冲液洗脱未结合的非标签蛋白，直至吸光度降至背景水平（通常需要80–100 mL洗涤缓冲液）。</li>
		<li>以洗脱缓冲液（50 mM NaH2PO4、500 mM NaCl、250 mM 咪唑，pH 8.0）进行线性梯度洗脱（1%至100%），流速为1 mL/min，持续60分钟，洗脱His标签的TreT蛋白。收集每4 mL的洗脱组分，直至TreT完全洗脱且吸光度恢复至基线水平。 
		&#8203;NOTE: 通常需要约60 mL洗脱缓冲液才能完全洗脱蛋白，蛋白主要在60–100%洗脱缓冲液范围内洗脱。可获得约10–15 mL纯化的TreT溶液（溶于洗脱缓冲液中）。</li>
		<li>使用洗脱缓冲液作为空白对照，测定280 nm处的吸光度，以确定TreT的浓度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过透析将TreT置换至三(羟甲基)氨基甲烷（Tris）缓冲液中。
	<ol>
		<li>按照制造商说明制备透析袋，并先用去离子水冲洗，再用Tris缓冲液（50 mM Tris、300 mM NaCl，pH 8.0）预处理透析袋。</li>
		<li>使用注射器和钝头针将TreT样品装入透析袋中，置于2 L Tris缓冲液中透析过夜。</li>
		<li>使用透析过程中收集的空白缓冲液作对照，测定280 nm处的吸光度，以确定TreT的浓度。</li>
		<li>将TreT溶液转移至50 mL锥形管中，进入海藻糖类似物合成步骤（步骤2），或在4 °C保存酶液。 
		&#8203;NOTE: TreT是一种热稳定蛋白。该酶在Tris缓冲液中于4 °C保存数月，未观察到显著活性损失。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 利用TreT酶一步合成海藻糖类似物
注意：以下方案描述的反应体系体积为 4 mL，根据反应效率和产物的分子量不同，可获得约 15–30 mg 的海藻糖类似物。如需更多或更少产物，可按比例调整反应组分的用量。
<ol>
	<li>将葡萄糖类似物（0.080 mmol，质量取决于分子量）、UDP-葡萄糖（0.160 mmol，97.6 mg）和 MgCl2（0.080 mmol，16.3 mg）加入一个 15 mL 圆底离心管中。这些组分的终浓度分别为 20 mM、40 mM 和 20 mM。</li>
	<li>加入在 Tris 缓冲液中的 TreT 酶（来自步骤 1.5.4），必要时加入适量 Tris 缓冲液（50 mM Tris，300 mM NaCl，pH 8.0），使终酶浓度为 300 μg/mL，终体积为 4 mL。轻轻吹打混合液或倒置试管以溶解固体。</li>
	<li>在 70 °C、300 rpm 振荡条件下孵育反应体系 1 小时，然后将试管置于冰上冷却。</li>
</ol>
3. 从粗酶反应混合物中纯化海藻糖类似物
<ol>
	<li>通过向离心过滤装置中加入 3 mL 去离子水，并在 3,000 × g 条件下离心至所有液体透过滤膜进入收集管（约 20 分钟），预清洗离心过滤装置（标称分子量截留值（NMWL）为 10 kDa），以去除膜中残留的微量甘油。重复此步骤两次。该步骤应在反应前或反应过程中立即进行（见步骤 2.3）。</li>
	<li>将酶促反应混合物（来自步骤 2.3）冷却后，转移至已预清洗的离心过滤装置中。用 1 mL 去离子水冲洗反应管，并将冲洗液转移至离心过滤装置中。重复冲洗反应管，以最大程度回收产物。</li>
	<li>在 3,000 × g 条件下离心离心过滤装置，直至所有液体透过滤膜进入收集管（约 20 分钟）。用 3 mL 去离子水冲洗离心过滤装置的上层腔室，并在 3,000 × g 条件下再次离心至所有液体进入收集管（约 20 分钟）。重复冲洗步骤，以最大程度回收产物。</li>
	<li>弃去离心过滤装置的上层腔室。将混合型离子交换树脂（3 g）加入收集管底部的滤出液中（典型滤液体积为 8–15 mL，取决于冲洗次数）。在室温下使用磁力搅拌子搅拌 1 小时，搅拌速度应足以使树脂珠在溶液中保持悬浮状态。</li>
	<li>倾析上清液并过滤以去除树脂。加入 5 mL 去离子水冲洗残留树脂。再次倾析上清液并过滤，将滤液与第一次倾析所得产物溶液合并。重复冲洗树脂，以最大程度回收产物。</li>
	<li>通过薄层色谱法（TLC）或高效液相色谱法（HPLC）分析反应，以确定葡萄糖类似物起始原料是否完全转化为海藻糖类似物产物。TLC 分析参见步骤 4.1，HPLC 分析参见步骤 4.2。</li>
	<li>通过冷冻干燥或旋转蒸发去除水分，得到干燥产物。若 TLC 或 HPLC 分析未检测到未反应的葡萄糖类似物，则无需进行色谱纯化。称重产物以计算反应产率，并进行核磁共振（NMR）波谱分析（见步骤 4.3），以确认产物结构和纯度。</li>
	<li>若 TLC 分析中检测到未反应的葡萄糖类似物，则使用凝胶过滤柱将其与海藻糖类似物分离。
	<ol>
		<li>根据制造商说明，制备一根 1 × 100 cm 的色谱柱，内含经去离子水饱和的超细 P2 聚丙烯酰胺凝胶过滤介质。 
		&#8203;注意：凝胶过滤柱在用去离子水清洗后可重复使用。</li>
		<li>将干燥的酶促反应产物（来自步骤 3.7）重新溶解于 0.5 mL 去离子水中。手动或使用柱流适配器将产物溶液上样至凝胶过滤柱。用另外 0.5 mL 去离子水冲洗盛装粗产物的样品瓶，并将冲洗液也上样至凝胶过滤柱。</li>
		<li>用去离子水进行重力流洗脱，收集约 2 mL 的馏分。</li>
		<li>通过 TLC（见步骤 4.1）分析各馏分，合并含有纯海藻糖类似物的馏分。</li>
		<li>通过冷冻干燥或旋转蒸发去除水分，得到干燥产物。称重产物以计算反应产率，并进行 NMR 分析（见步骤 4.3）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 海藻糖类似物产物的分析
<ol>
	<li>对TreT反应进行薄层色谱（TLC）分析。 
	注意：该步骤也可用于分析尺寸排阻色谱柱的洗脱组分。在进行薄层色谱分析前，可能需要对反应混合物或柱洗脱组分进行浓缩，以便在薄层色谱板上观察到化合物的染色结果。
	<ol>
		<li>用铅笔在薄层色谱板表面标记泳道，并将待测样品及相应的标准品点样至对应泳道，包括葡萄糖类似物标准品、海藻糖类似物标准品（如有）、反应混合物（或尺寸排阻柱纯化后收集的组分）以及共点样样品。每一点样后，待薄层色谱板自然干燥。 
		注意：进行反应分析时，通常将 2 µL 样品点在薄层色谱板上。</li>
		<li>使用展开剂展开薄层层析板 n正丁醇/乙醇/去离子水（5:3:2）</li>
		<li>干燥已展开的薄层色谱板，然后将其浸入5% H2SO4 在乙醇（糖染色）中，于加热板高温设置下加热，直至可观察到含糖斑点（通常为5分钟）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用任何能够分离和检测碳水化合物的高效液相色谱（HPLC）系统，对TreT反应混合物进行HPLC分析。本方案采用氨基丙基HPLC柱分离碳水化合物，并通过示差折光检测器进行检测。
	<ol>
		<li>将含有预柱保护柱的氨基丙基柱（4.6 × 250 mm）连接至高效液相色谱仪。</li>
		<li>使用去离子水配制的80%乙腈溶液以0.4 mL/min的流速平衡氨基丙基柱。</li>
		<li>将反应产物（或标准品）溶液上样至氨基丙基柱。</li>
		<li>用去离子水配制的80%乙腈溶液，以0.4 mL/min的流速和50 °C的柱温洗脱产物（或标准品）。通常运行时间为40 min。 
		注意：葡萄糖类似物起始原料和海藻糖类似物产物均可通过折光指数检测，也可采用其他方法如蒸发光散射检测（ELSD）。在所述条件下，葡萄糖类似物通常在10-15分钟之间洗脱，海藻糖类似物通常在15-25分钟之间洗脱。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>纯化海藻糖类似物的核磁共振分析
	<ol>
		<li>将纯化的海藻糖类似物溶解于D2O（700 μL）并转移至核磁共振管中。</li>
		<li>获取 1H 和 13根据相应的核磁共振设施操作规程进行碳-13核磁共振（13C NMR）谱图测定。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 海藻糖类似物在分枝杆菌检测中的应用
<ol>
	<li>合成、纯化并施用6-TreAz至M. smegmatis（Msmeg）。
	<ol>
		<li>将6-叠氮-6-脱氧葡萄吡喃糖（6-GlcAz，0.020 mmol，4.1 mg）、UDP-葡萄糖（0.040 mmol，24.4 mg）和MgCl2（0.020 mmol，4.1 mg）加入一个15 mL锥形管中。</li>
		<li>加入溶于Tris缓冲液的TreT酶（来自步骤1.5.4），使终浓度为300 μg/mL，终体积为1 mL。轻轻吹打混合液或倒置试管以溶解固体。</li>
		<li>在70 °C下振荡孵育反应体系15分钟。</li>
		<li>用3 mL去离子水稀释酶反应混合物，并转移至预清洗的离心过滤装置（截留分子量10 kDa）。在3,000 × g下离心，直至大部分液体滤入收集管中，约需10分钟。</li>
		<li>弃去离心过滤装置的上层腔室。向收集管中加入混合型离子交换树脂（0.75 g），室温下搅拌或振荡25分钟。倾出上清液，并过滤以去除树脂。 
		&#8203;注：步骤5.1.1–5.1.5可在不到1小时内获得浓度约为5 mM的6-叠氮海藻糖（6-TreAz）水溶液。该浓度是基于底物到产物的定量转化以及纯化过程中的稀释倍数估算得出，假设此过程中产物损失极小。如需，可在加入生物样品前对该溶液进行无菌过滤。</li>
		<li>将适量的6-TreAz产物溶液加入处于对数生长期的M. smegmatis（Msmeg）培养物中，通常使终体积为100–1,000 μL，6-TreAz终浓度约为25 μM。在37 °C下孵育细胞所需时间，通常为60分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行点击化学反应，将荧光染料偶联至叠氮标记的细胞。本方案中，采用铜催化的叠氮-炔烃环加成反应（CuAAC），将荧光染料递送至Msmeg细胞表面的叠氮基团。
	<ol>
		<li>在3,900 × g下离心细胞5分钟，然后用含0.5%牛血清白蛋白的PBS洗涤细胞，重复两次。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于含4%对甲醛的PBS中以固定细胞。孵育10分钟后，重复步骤5.2.1洗涤细胞。</li>
		<li>将细胞沉淀重悬于138 μL PBS中。</li>
		<li>加入3 μL浓度为1 mM的炔基-羧基罗丹明110（Alkyne-488）DMSO储备液。</li>
		<li>加入3 μL新配制的浓度为60 mM的抗坏血酸钠水溶液。</li>
		<li>加入3 μL浓度为6.4 mM的Tris[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺（TBTA）在叔丁醇/二甲基亚砜（DMSO）4:1混合溶剂中的储备液。</li>
		<li>加入3 μL浓度为50 mM的CuSO4水溶液。</li>
		<li>轻轻吹打细胞悬液，然后在避光条件下室温孵育30分钟。</li>
		<li>重复步骤5.2.1洗涤细胞，最后将细胞重悬于150 μL PBS中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>进行细胞荧光分析。本方案中，使用荧光显微镜观察标记后的Msmeg细胞的荧光信号。
	<ol>
		<li>取10 μL PBS悬浮的细菌细胞滴加至显微镜载玻片上，用盖玻片边缘轻轻铺展成薄层，避光自然干燥。</li>
		<li>在干燥样本上滴加10 μL封片剂，然后盖上盖玻片，并使用粘合剂（例如，指甲油）固定。</li>
		<li>使用荧光显微镜在100倍放大倍数下观察载玻片样本。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Tornøe, C. W., Christensen, C., Meldal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptidotriazoles+on+solid+phase%3A+%5B1%2C2%2C3%5D-triazoles+by+regiospecific+copper%28I%29-catalyzed+1%2C3-dipolar+cycloadditions+of+terminal+alkynes+to+azides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Peptidotriazoles on solid phase: [1,2,3]-triazoles by regiospecific copper(I)-catalyzed 1,3-dipolar cycloadditions of terminal alkynes to azides.</a> J. Org. Chem. 67, 3057-3064 (2002).</li>
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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

海藻糖类似物在多个领域具有潜在应用价值，从食品和药品的保存到微生物感染的诊断与治疗6。现有的多步化学合成方法可用于制备在多个位点发生修饰的复杂海藻糖类似物（例如，天然存在的复杂分枝杆菌糖脂）。然而，即使用于合成相对简单的单取代海藻糖类似物，这些方法也 invariably 耗时较长且效率低下9, 13, 14。因此，亟需开发替代性的合成策略，以快速、高效地制备各类在上述领域具有应用潜力的海藻糖类似物。利用自然界中海藻糖合成酶的生物催化方法最具前景。尽管自然界中存在多种海藻糖合成途径，但我们认为来自T. tenax18的TreT酶是用于海藻糖类似物合成的理想酶，原因如下。
T. tenax 来源的 TreT 具有热稳定...

海藻糖是一种对称的非还原性二糖，由两个葡萄糖单元通过1,1-α,α-糖苷键连接而成（图1A）。尽管人类及其他哺乳动物体内不存在海藻糖，但它广泛存在于细菌、真菌、植物和无脊椎动物中1。在大多数生物体中，海藻糖的主要功能是抵御环境胁迫，例如干燥1。此外，某些人类病原体的致病性依赖于海藻糖，包括引起结核病的Mycobacterium tuberculosis，该菌利用海藻糖作为细胞包膜生物合成的媒介物，以及构建免疫调节性糖脂的结构单元2。
<img alt="海藻糖及其类似物的结构图；用于提高稳定性或检测效果的化学修饰。" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1： 海藻糖及海藻糖类似物。 （A）天然海藻糖与非天然海藻糖类似物的结构，其中 X 为结构修饰位点。（B）文献报道的具有生物保存和生物成像应用潜力的海藻糖类似物示例。
由于其独特的结构和生理功能，海藻糖在生物（技术）学和生物医学应用中受到了广泛关注 3在自然界中观察到的海藻糖的保护特性——例如，其显著的能力有助于维持“复苏植物”在经历极度脱水后的生命存活 4—推动了其在生物保存领域的广泛应用。海藻糖已被用于保存多种生物样本，如核酸、蛋白质、细胞和组织 3例如，海藻糖作为一种稳定添加剂，已被用于市场上多种药品中，包括多种抗癌单克隆抗体。 3此外，海藻糖在食品工业中被用作甜味剂，并广泛应用于食品和化妆品行业的商品保鲜。最初，由于无法从天然来源或通过化学合成获得大量高纯度的海藻糖，其在这些商业领域的应用受到限制。然而，近年来已开发出一种高效的酶法工艺，可经济地从淀粉生产海藻糖，从而推动了海藻糖的广泛应用 5.
海藻糖的化学修饰衍生物（本文中称为海藻糖类似物）因其多种应用而受到越来越多的关注（通式结构见图1A；具体海藻糖类似物示例见图1B）6。例如，乳糖基海藻糖（lacto-trehalose）是一种海藻糖类似物，其中一个葡萄糖单元被半乳糖取代，因此其4位羟基具有相反的立体化学构型。乳糖基海藻糖具有与海藻糖相同的稳定特性，但对肠道酶的降解具有抗性，因此作为非热量食品添加剂具有良好的应用前景6, 7。
本研究团队对海藻糖类似物的兴趣主要源于其作为分枝杆菌特异性探针和抑制剂的价值。Barry 和 Davis 研究组开发了一种荧光素偶联的酮基海藻糖类似物，命名为 FITC-酮基海藻糖，该探针可对活体M. tuberculosis的细胞壁进行代谢标记，从而通过荧光显微镜实现检测8。Bertozzi 实验室则开发了更小的叠氮基海藻糖（TreAz）类似物，这类分子同样可通过代谢标记细胞壁，并利用点击化学结合荧光分析进行后续检测9。这些进展表明，海藻糖类探针有望作为结核病诊断性成像试剂加以应用。此外，由于海藻糖类似物可能干扰结核分枝杆菌中对存活和毒力至关重要的代谢通路，因此也被探索用作M. tuberculosis的抑制剂10,11,12。
迄今为止，开发海藻糖类似物用于生物（技术）学及生物医学应用的主要障碍在于缺乏高效的合成方法。目前制备海藻糖类似物的两种传统途径均依赖于化学合成（图2）。其中一种途径是对天然海藻糖进行去对称化或修饰，另一种则是以适当官能团化的单糖为构建单元，通过化学糖基化反应构建1,1-α,α-糖苷键。这些方法在近期的综述文章中已有讨论13, 14，已被证明可用于多步合成少量复杂的含海藻糖天然产物，例如来自结核分枝杆菌（M. tuberculosis）的硫酸脂-115。然而，这两种方法通常效率较低、耗时较长，非化学专业人员难以操作，且被认为对环境不友好。因此，在合成某些类型的海藻糖类似物时，这些策略并不理想。
<img alt="海藻糖类似物的化学合成与酶法合成；包含反应路径和修饰的示意图。" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 2"> 
图2： 海藻糖类似物合成的策略。 如左侧所示，海藻糖类似物的化学合成方法采用多步反应流程，涉及复杂的保护/去保护、去对称化和/或糖基化步骤。如右侧所示，酶法合成则利用一种或多种酶在水溶液中立体选择性地将简单且未保护的底物转化为海藻糖类似物。本文报道的酶法方案使用一种海藻糖合酶（TreT）将葡萄糖类似物与UDP-葡萄糖一步转化为海藻糖类似物。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54485/54485fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
一种高效的生物催化途径将有助于这类有前景分子——海藻糖类似物的生产、评估与应用。尽管目前已有商业化酶法用于海藻糖的生产5 由于该方法以淀粉为底物，无法适用于合成类似物，但自然界中存在其他可用于海藻糖类似物合成的生物合成途径。然而，该领域的研究最近已有综述 6，一直有限。有一项研究采用了一种受启发的方法 大肠杆菌 海藻糖生物合成途径可从相应的氟代葡萄糖制备单一氟代海藻糖类似物。然而，该方法需要一个三酶系统，其效率和普适性有限 8另一种已被探索的方法是利用海藻糖磷酸化酶（TreP）的逆向反应，理论上可通过葡萄糖类似物与葡萄糖-1-磷酸一步合成海藻糖类似物。 6, 16, 17尽管这一方法未来可能具有应用前景，但目前翻转型和保留型TrePs在模拟物合成方面均存在缺陷。例如，翻转型TrePs需要使用价格高昂的供体分子（β-D-葡萄糖-1-磷酸），而保留型TrePs则存在酶表达产率低、稳定性差以及底物广谱性有限等问题。显著改进（例如在TreP介导的类似物合成具备实用性之前，还需进行酶工程等方面的改进。
目前，酶法合成海藻糖类似物最实用的方法是使用海藻糖合酶（TreT），该酶可在单步反应中将葡萄糖和尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-葡萄糖）转化为海藻糖6。我们近期报道了利用Thermoproteus tenax TreT——一种耐热且单向的酶18——从葡萄糖类似物和UDP-葡萄糖合成海藻糖类似物的方法（图3）19。该酶仅在合成方向发挥作用，避免了TreP系统中存在的海藻糖降解问题。该单步反应可在1小时内完成，并以高收率（通过高效液相色谱法（HPLC）测定，最高可达&gt;99%）获得多种结构多样的海藻糖类似物，起始原料为易得的葡萄糖类似物底物（参见代表性结果部分的表1）。
<img alt="在70°C下利用TreT酶将UDP-葡萄糖转化为海藻糖类似物的糖基化示意图" src="/files/ftp_upload/54485/54485fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3： TreT酶催化的海藻糖类似物一步合成。 来自T. tenax的TreT酶能够立体选择性地将易得的葡萄糖类似物与UDP-葡萄糖结合，一步合成海藻糖类似物。R1-R4 = 可变的结构修饰，例如叠氮基、氟代、脱氧、硫代、立体化学或同位素标记修饰；Y = 可变杂原子，例如氧或硫，或同位素标记的杂原子。
本文提供了TreT合成过程的详细方案，包括从大肠杆菌（E. coli）中表达和纯化TreT、优化的TreT反应条件，以及一种完全在水相中进行的改进型纯化方法。该改进方案可实现多种海藻糖类似物在半制备规模（10–100 mg）下的快速高效合成与纯化。我们还展示了利用该方案在不到1小时内制备并施用基于海藻糖的探针至分枝杆菌，从而实现对分枝杆菌细胞的快速荧光检测。

<table><tbody><tr><td>LB 琼脂</td><td>Research Products International</td><td>L24021</td><td></td></tr><tr><td>氨苄青霉素钠盐</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9518</td><td></td></tr><tr><td>LB 肉汤</td><td>Research Products International</td><td>L24045</td><td></td></tr><tr><td>优质肉汤（Terrific Broth）</td><td>Research Products International</td><td>T15050</td><td></td></tr><tr><td>L-(+)-阿拉伯糖</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3256</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30256</td><td></td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5513</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>BDH</td><td>BDH9286</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钠</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>注射器滤器，0.45 &amp;micro;m</td><td>Fisher Scientific</td><td>09719D</td><td></td></tr><tr><td>蛋白酶抑制剂迷你片剂，不含 EDTA</td><td>Thermo Scientific</td><td>88666</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap HP 镍亲和层析柱，5 mL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5248-02</td><td></td></tr><tr><td>TRIS 碱，超纯</td><td>Research Products International</td><td>T60040</td><td></td></tr><tr><td>透析袋，截留分子量 12&amp;ndash;14,000</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-152-16</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖类似物</td><td>CarboSynth, Sigma Aldrich, Santa Cruz Biotechnology, American Radiolabeled Chemicals</td><td></td><td>提供多种葡萄糖类似物的供应商示例</td></tr><tr><td>6-叠氮-6-脱氧葡萄糖（6-GlcAz）</td><td>CarboSynth</td><td>MA02620</td><td></td></tr><tr><td>UDP-葡萄糖</td><td>abcam Biochemicals</td><td>ab120384</td><td></td></tr><tr><td>六水合氯化镁&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-15 离心过滤装置</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rex RG 501-X8 混合床离子交换树脂</td><td>Bio-Rad</td><td>444-9999</td><td></td></tr><tr><td>超细 Bio-Gel P2 层析介质</td><td>Bio-Rad</td><td>150-4118</td><td></td></tr><tr><td>玻璃背衬硅胶薄层层析板</td><td>EMD Millipore</td><td>1056280001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;n&lt;/em&gt;-丁醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25310A</td><td></td></tr><tr><td>硫酸</td><td>Fisher Scientific</td><td>A300</td><td></td></tr><tr><td>乙腈</td><td>EMD Millipore</td><td>AX0145</td><td></td></tr><tr><td>氘代水，99.8%</td><td>Acros Organics</td><td>351430075</td><td></td></tr><tr><td>氨基丙基 HPLC 柱</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58338</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>对苯二甲醛</td><td>Ted Pella</td><td>18505</td><td></td></tr><tr><td>炔烃-488</td><td>Sigma Aldrich</td><td>761621</td><td></td></tr><tr><td>抗坏血酸钠</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>三[(1-苄基-1H-1,2,3-三氮唑-4-基)甲基]胺（TBTA）</td><td>Click Chemistry Tools</td><td>1061</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tert&lt;/em&gt;-丁醇</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360538</td><td></td></tr><tr><td>二甲基亚砜</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W387520</td><td></td></tr><tr><td>硫酸铜(II)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1297</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G 封片剂</td><td>Southern Biotechnology</td><td>10001</td><td></td></tr></tbody></table>

一步快速酶法合成及全水相纯化海藻糖类似物

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

化学修饰的海藻糖或海藻糖类似物在生物学、生物技术、药物科学等领域具有广泛应用。例如，带有可检测标记的海藻糖类似物已被用于检测 结核分枝杆菌 并可作为结核病诊断成像试剂。由于海藻糖的水解稳定型版本具有用作非热量甜味剂和生物保护剂的潜力，相关研究也正在开展。尽管此类化合物在多种应用中颇具吸引力，但因其缺乏高效可靠的合成途径，其潜力尚未得到充分实现。本文报道了一种快速、高效的一步法生物催化合成海藻糖类似物的详细方案，该方法避免了化学合成中存在的问题。通过利用来自 Thermoproteus tenax，海藻糖类似物可通过葡萄糖类似物与尿苷二磷酸葡萄糖在15–60分钟内一步高效生成（转化率可达定量水平）。一种简单快速的非色谱纯化方案，包含离心透析和离子交换步骤，可在短短45分钟内获得多种已知浓度的海藻糖类似物水溶液。若反应后仍有未反应的葡萄糖类似物残留，可对海藻糖类似物产物进行色谱纯化。总体而言，该方法提供了一种 &#34;绿色&#34; 用于快速合成与纯化海藻糖类似物的生物催化平台，具有高效且易于非化学专业人员操作的特点。为展示该方法的适用性，我们描述了一种针对分枝杆菌的海藻糖基点击化学探针的合成、全水相纯化及给药的实验方案，整个过程耗时不足1小时，并实现了分枝杆菌的荧光检测。未来，我们设想该方案可应用于结核病诊断用海藻糖基探针的快速合成。例如，短半衰期放射性核素修饰的海藻糖类似物（例如, 18F修饰的海藻糖）可用于正电子发射断层扫描-计算机断层扫描（PET-CT）等先进的临床成像技术。

T. tenax TreT 通过标准的蛋白质表达与纯化技术从 E. coli 中获得，产率约为 4 mg/L。仅需一步镍亲和层析即可从 E. coli 裂解液中纯化 TreT（典型的 FPLC 色谱图见图4）。根据我们此前关于 TreT 合成过程的首次报道，重组的 T. tenax TreT 能够高效地将多种葡萄糖类似物（其中许多为市售可得）转化为相应的海藻糖类似物19。表1列出了采用我们最初报道的实验方案时，多种起始葡萄糖类似物经 HPLC 测定的反应产率，展示了 TreT 对底物的广泛兼容性及其在合成应用中的适用性。野生型酶可耐受糖环不同位置上的多种结构修饰，包括氟代、脱氧、叠氮、硫代以及立体化学修饰，主要例外是 4 位的修饰。
<img alt="色谱紫外数据图...

海藻糖类似物正逐渐成为生物（技术）学和生物医学应用中的重要分子。本文介绍了一种优化的酶法合成与纯化海藻糖类似物的实验方案，该方法简便、高效、快速且环境友好。文中展示了该方法在快速制备和使用一种用于检测分枝杆菌的探针中的应用。

海藻糖的化学修饰衍生物，或称海藻糖类似物，在生物学、生物技术、药物科学及其他领域具有广泛应用。

本方法的总体目标是快速合成并纯化海藻糖类似物，这些类似物在病原菌检测到生物材料保存等方面具有潜在应用。该方法快速且产率高，可获得海藻糖这一二糖的多种类似物。这些化合物在生物医学和生物技术研究中具有多种已确立及新兴的应用。 该方法包括一步酶促合成和全水相纯化。这些步骤共同克服了传统化学合成海藻糖类似物的一些缺点，后者通常耗时较长、产率较低且对环境不友好。该方法的应用前景可能延伸至结核病的研究与诊断，因为经修饰的海藻糖类似物已被用于对结核分枝杆菌（结核病的致病因子）进行成像。该方法还有助于加速海藻糖类似物的合成与评估，以用于其他潜在用途，例如生物制品的保存以及作为非热量型甜味剂。在开始实验前，需制备一管表达TreT的埃希氏大肠杆菌（E.coli）过夜培养物。开始TreT表达实验时，将750毫升TB培养基加入一个2,800毫升的费恩巴赫（Fernbach）培养瓶中，并进行高压灭菌处理。加入氨苄青霉素至肉汤中，使其终浓度为 100 微克/毫升。准备用于紫外-可见光谱分析的比色皿，并用一个烧瓶中的肉汤填充一支比色皿作为空白对照。接着，将 3 毫升已制备的表达 TreT 的大肠杆菌过夜培养物加入烧瓶中。将锥形瓶在37摄氏度、200 rpm振荡条件下孵育。定期以培养基空白对照在600纳米处检测培养液的吸光度。当600纳米处的吸光度值介于0.5至1.0之间时，向锥形瓶中加入750微升阿拉伯糖以诱导TreT表达。将培养物在37摄氏度下振荡培养过夜，转速为200 rpm。接着，将培养物转移至一个1升的聚丙烯离心瓶中，在4摄氏度条件下以4,000 × g离心15分钟。弃去上清液，并将沉淀重悬于15毫升磷酸盐缓冲液中。将悬液转移至锥形离心管中，在相同条件下离心。弃去上清液，必要时将沉淀在-80摄氏度保存。将一片蛋白酶抑制剂小片溶解于20毫升洗涤缓冲液中。向沉淀中加入蛋白酶抑制剂溶液，涡旋混匀以重悬沉淀。将悬液转移至100毫升烧杯中。接着进行超声处理以裂解细胞，将探头置于距烧杯底部约1厘米处。将裂解液置于金属锥形管中，在 4 °C 条件下以 15,000 × g 离心 60 分钟。使用注射器滤器过滤裂解液。通过快速蛋白液相色谱法纯化 TreT，并采用 SDS-PAGE 检测其纯度。然后在4摄氏度下通过透析过夜将TreT置换至Tris缓冲液中，以制备用于海藻糖类似物合成的TreT溶液。收集透析洗涤液中的空白样品。使用透析空白样品作为对照，通过紫外-可见光谱法测定TreT浓度。为了使用TreT在20至30毫克规模上开始合成6-叠氮基海藻糖，将0.08毫摩尔的6-叠氮基葡萄糖、0.16毫摩尔的UDP-葡萄糖和0.08毫摩尔的氯化镁二水合物加入一个15毫米的锥形管中。加入TreT和Tris缓冲液。根据需要以Tris缓冲液稀释混合物，使最终体积为4毫升，酶浓度达到每毫升300微克。盖上管盖并倒置以溶解固体。将反应混合物在70摄氏度孵育1小时，同时以300 rpm振荡。孵育期间，取3毫升去离子水加入10千道尔顿离心过滤装置中，于3,000 × g离心至液体全部进入管中。重复洗涤两次，以确保充分冲洗滤膜装置。反应完成后，将混合物置于冰上冷却至室温。然后将反应产物混合物转移至离心滤膜装置中。用一毫升去离子水冲洗反应管三次，每次冲洗液均转移至离心过滤装置中。在3,000 ×g条件下离心，直至所有液体完全滤入收集管。向滤膜装置中加入三毫升去离子水，在相同条件下再次离心。根据需要重复冲洗，以最大程度回收产物。向滤液中加入3克混合床离子交换树脂。使用搅拌子在室温下搅拌混合物1小时。搅拌后，倾析并过滤上清液。用五毫升去离子水冲洗树脂，并将冲洗液过滤。根据需要重复操作以最大程度回收产物，并合并所有滤液。合并滤液并浓缩。随后，为检测未反应的6-GlcAz前体，制备硅胶薄层层析板，点样6-GlcAz、6-TreAz、浓缩产物及共点样品。使用正丁醇、乙醇与去离子水的混合液展开层析板。待板干燥后，将板浸入5%硫酸的乙醇溶液中，随后在高温设置的电热板上加热约五分钟，以显色斑点。若观察到未反应的前体物质，需将产物混合物通过凝胶过滤柱进行纯化，并重复薄层色谱分析。获得纯化的海藻糖类似物后，除去水分，得到干燥的6-TreAz产物。TreT酶以立体选择性方式将葡萄糖类似物与UDP-葡萄糖连接，生成相应的海藻糖类似物。该反应适用于立体化学上的脱氧氟代、硫代和叠氮修饰。然而，环上四号位的取代基耐受性较差。通过该方法，葡萄糖类似物 6-GlcAz 在 60 分钟内被定量转化为海藻糖类似物 6-TreAz，薄层色谱（TLC）结果证实了这一点。采用非色谱旋转透析离子交换纯化法分离得到纯品，并通过核磁共振（NMR）和高效液相色谱（HPLC）进行表征。随后，将纯化的 6-TreAz 溶液用于模式细菌耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）的叠氮标记实验。通过点击化学反应对细胞表面叠氮化物进行后续荧光标记显示，具有功能性海藻糖转运蛋白的耻垢分枝杆菌成功被叠氮化物标记，而缺失该转运蛋白的菌株则未被标记。一旦掌握该技术，TreT催化的反应及后续纯化步骤可在1至4小时内完成，具体时间取决于为最大化产物回收所采用的洗涤步骤次数。在进行该实验时，需注意始终通过核磁共振（NMR）以及薄层色谱（TLC）或高效液相色谱（HPLC）对反应产物进行分析，以确认其纯度和结构。通过该方法，合成的海藻糖类似物可用于细菌成像探针、代谢示踪剂、酶抑制剂或生物分子稳定剂的评估或应用。该方法为研究人员提供了制备带有稳定同位素或放射性同位素标记等修饰的海藻糖类似物的途径。总体而言，通过该方法可获得的化合物在结核病研究及其他生物医学研究领域中应具有重要用途。观看本视频后，您应能够充分理解如何表达并纯化 TreT 酶，如何利用 TreT 一步合成海藻糖类似物，以及如何纯化海藻糖类似物产物。

rapid-one-step-enzymatic-synthesis-all-aqueous-purification-trehalose

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