RNA的疗效和毒性的评价基因或药物治疗靶向HIV-1的生产使用
2016年9月5日
描述了评估靶向 HIV-1 复制周期整合后步骤的 RNA 分子的疗效和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子和优化现有分子的格式。
该程序的总体目标是比较靶向 HIV-1 产生的新 RNA 的疗效和毒性。该方法可以帮助识别用于使用 HIV-1 基因或药物治疗的新 RNA 分子，例如短发夹或小干扰 RNA、核酶和 RNA 诱饵。该技术的主要优点是可以同时筛选几种新的 RNA 设计，周转时间短。
虽然这种方法旨在评估 HIV 的新 RNA 药物或基因疗法，但它也可以应用于其他系统，例如小分子或 CRISPR 任务。当我们进行实验以筛选大量核酶的抗 HIV 作用时，我们首先想到了这种方法。首先，在含有 10%FPS 和 1% 青霉素链霉素的 DMEM 中以每毫升 10 至第 5 个细胞的两倍制备人胚胎肾 293T 细胞悬浮液。
向 24、96 和 12 孔板的每个孔中加入 500、100 和 1， 000 微升细胞悬液，分别用于病毒生产、细胞活力和免疫激活测定。轻轻旋转板，并在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育过夜，直至 50% 至 70% 汇合。对于病毒生产测定，制备每微升 10 ng 的 HIV-1 表达质粒稀释液，并向每个测定管中加入 10 μL。
接下来，制备 5 微摩尔稀释的测试 RNA 和阴性对照 RNA。然后将 2.5 μL 或 10 μL 的每种测试 RNA 和阴性对照稀释液添加到相应的试管中，最终浓度为 25 纳摩尔或 100 纳摩尔。对于细胞活力测定，准备 5 微摩尔稀释的测试 RNA 和 10 毫克/毫升稀释的阳性对照 RNA、低分子量聚 （I：C） 将 2 微升测试 RNA 或阳性对照 RNA 稀释液添加到相应的试管中，最终浓度为 100 纳摩尔或 200 微克/毫升， 分别。
对于免疫激活测定，将 20 μL 测试 RNA 或阳性对照 RNA 稀释液（如为细胞活力测定制备）添加到相应的试管中，分别达到 100 纳摩尔或 200 μg/mL 的最终浓度。然后向每个转染管中加入 50、25 或 75 μL DMEM，分别用于病毒生产、细胞活力和免疫激活检测。对于病毒生产检测，在下一步之前，将细胞和准备好的转染管带到生物安全三级 （BSL-3） 实验室。
依次向转染管中加入 2 μL 转染试剂，孵育 15 至 20 分钟以形成复合物。将每个微管中的整个转染混合物逐滴添加到细胞培养板中的相应位置。轻轻旋转，并在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育板 48 小时。
为了进行病毒生产测定，从培养箱中取出 24 孔细胞培养板后，将它们转移到 BSL-3 细胞培养罩中。轻轻旋转板，然后将 150 微升上清液从每个孔转移到 96 孔平底板中的相应孔中，用于定量 HIV-1 的产生。将 5 μL 上清液转移到含有 25 μL 病毒干扰混合物的 96 孔板中的相应孔中。
在室温下孵育混合物 5 分钟后，将板转移到放射性工作站。接下来，制备放射性混合物，并向病毒上清液和干扰混合物的每个孔中加入 25 μL。将板在 37 摄氏度下孵育 2 小时。
将 5 微升反应混合物点在玻璃纤维/DEAE 滤垫纸中的相应方块上，并让斑点干燥 10 分钟。使用 2x SSC 缓冲液洗涤纸张 5 次，每次 5 分钟，然后用 95% 乙醇洗涤 2 次，每次 1 分钟。待试纸干燥后再密封在样品袋中。
将装有滤垫纸的样品袋夹入暗盒中，然后将暗盒插入微孔板闪烁计数器中。然后启动计数器。对于任何病毒定量方法，将每个测试 RNA 获得的值除以相邻的阴性对照，然后将该值乘以 100，得到每个测试 RNA 重复的 HIV-1 产生的抑制百分比。
为了进行细胞活力测定，从培养箱中取出 96 孔板后，向每个孔中加入 20 微升每毫升 5 毫克的 MTT 和 DPBS。然后将板在 37 摄氏度下孵育 3 小时。向每个孔中加入 150 微升含去污剂的酸化异丙醇，并在室温下孵育板 2 小时。
然后使用微孔板分光光度计测定 570 纳米处的吸光度。通过将每个样品获得的值除以其相邻的转染对照来计算每个阳性对照和测试 RNA 的相对 MTT 代谢。对于免疫激活测定，从培养箱中取出 12 孔板后，吸出培养基并使用 DPBS 轻轻洗涤细胞两次。
然后向每个孔中加入 70 μL 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的冷裂解缓冲液，并将板在冰上孵育 10 分钟。将细胞裂解物转移到微管中，并将试管浸入液氮中快速冷冻。让样品解冻后，再冻融两次，总共冻融三次。
接下来，将裂解物在 15， 700 x g 和 4 摄氏度下离心 15 分钟，以沉淀细胞碎片。然后，在电泳并转移到膜上，通过将膜在 丽春红 S 中孵育 1 分钟来揭示蛋白质条带。然后用双蒸水清洗。
使用条带和蛋白质分子量标准作为指南，在 80 和 55 道尔顿处切割膜。现在，使用含 0.05% 吐温 20 或 TBST 的 TBS 洗掉丽春红 S 染色。加入含 5% 脱脂牛奶的 TBST 以完全覆盖膜，并在室温下搅拌孵育 1 小时。
将膜转移到含有 3%BSA 的 TBST 中，抗体以 1：1， 000 稀释的 ADAR、磷-PKR 和磷-IRF3 分别用于膜的顶部、中间和底部。在 4 摄氏度下搅拌孵育过夜。第二天早上，使用 TBST 洗涤膜 5 次，每次 5 分钟，然后用 5% 脱脂牛奶和 1：5， 000 过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗转移到 TBST 中，持续 1 小时。
在胶片上观察蛋白质条带后，使用剥离溶液清洗膜的中间部分和底部部分 10 分钟，然后将膜的中间部分在 PKR 抗体中孵育，底部部分在 IRF3 抗体中孵育。作为阳性对照，根据文本方案用肌动蛋白抗体探测底膜。此处显示了检测的一般示意图，并带有三个测试 RNA 和一个对照 RNA 的示例转染计划。
对于病毒生产和细胞活力测定，将每个测试构建体的读数标准化为阴性对照。在转染表达 HIV-1 菌株 NL4-3 的质粒的细胞中使用 HIV-1 生产测定，计算与用长 Dicer 底物无义 siRNA 转染的细胞相比，与用长 Dicer 底物无义 siRNA 转染的细胞相比，用此处显示的 siRNA 共转染细胞中的 RT 活性百分比，以确定靶向 HIV-1 RNA 中保守位点的 RNA 干扰分子的最佳长度。使用鉴定出的最有效 siRNA，确定转染细胞的 MTT 代谢百分比。
沿着双链 RNA，poly （I：C） 仅在最高剂量下降低细胞活力。无论其长度如何，在 HIV-1 RNA 中靶向 1498 位点的 siRNA 均未观察到细胞活力显著降低。正如 Western blot 所示，在免疫激活测定中评估了同一组 RNA。
在 poly （I：C） 激活 ADAR1-p150 的表达并诱导 PKR 和 IRF3 磷酸化的条件下，对于任何测试 RNAs，均未观察到对任何灭活标志物的显着影响。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在 7 天内完成。在尝试此程序时，使用高质量的 RNA 和 DNA 制备物进行转染非常重要。
此外，包括适当的阴性和阳性对照。在此程序之后，其他方法（如转导细胞的 HIV 感染）可用于评估潜在抗 HIV 候选药物的长期疗效和毒性。开发后，这项技术使我们能够在 HIV RNA 中识别出一个可接近且保守的靶位点，并优化靶向它的核酶、shRNA 和 siRNA 的格式。
观看本视频后，您应该对如何使用病毒产生检测快速筛选靶向 HIV 生产的新 RNA 候选 RNA 以及使用免疫激活和细胞活力检测潜在毒性有很好的了解。不要忘记，使用 HIV 和放射性标记的核苷酸可能非常危险。执行此程序时，应始终采取预防措施，例如使用经过认证的生物安全和放射性实验室。
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概述
本文描述了评估针对HIV-1生产的RNA分子的有效性和毒性的方法。这些技术有助于筛选新的RNA设计并优化现有的RNA。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 病毒学
- 分子生物学
背景
- RNA分子可用于HIV-1的基因或药物治疗。
- 短发夹RNA、小干扰RNA、核酶和RNA诱饵是潜在的候选者。
- 该方法允许同时筛选多个RNA设计。
- 最初为针对HIV的核酶开发。
研究目的
- 比较新RNA分子的有效性和毒性。
- 识别HIV-1治疗的有效RNA候选者。
- 为RNA设计提供快速筛选方法。
使用的方法
- 人胚肾293T细胞悬液的制备。
- 使用含10%FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM。
- 针对HIV-1生产的RNA分子筛选。
- 评估RNA设计的治疗潜力。
主要结果
- 识别具有潜在抗HIV效果的新RNA分子。
- 证明该方法在筛选多个设计方面的效率。
- 潜在适用于其他治疗系统。
- 结果快速反馈。
结论
- 该方法对评估针对HIV-1的RNA分子是有效的。
- 它可以适应其他治疗应用。
- 需要进一步研究来优化RNA设计。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables rapid screening of RNA-based therapeutics targeting HIV-1 production, supporting early-stage target validation and lead identification in antiviral drug discovery. By integrating efficacy and toxicity readouts, it provides predictive confidence for prioritizing candidates with favorable therapeutic indices. The approach accelerates preclinical de-risking by identifying RNA constructs that inhibit viral replication without triggering innate immune activation or compromising cell viability.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying HIV-1 production inhibition as a functional readout of target engagement.
- Operational Value: Supports rapid identification of potent RNA inhibitors targeting conserved sites in HIV-1 RNA, facilitating target confirmation.
- Predictive Value: Percent inhibition of HIV-1 production, normalized to negative controls, provides a quantitative metric for ranking lead candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers standardized, reproducible assays for evaluating RNA efficacy (viral production) and toxicity (cell viability, immune activation) in parallel.
- Operational Value: Uses transient transfection in 293T cells with BSL-3-compatible workflows to enable high-throughput screening of RNA libraries.
- Assay Readiness: Generates normalized readouts (percent inhibition, relative MTT metabolism, phosphor-PKR/IRF3 signaling) suitable for hit-to-lead progression.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Identified RNA candidates can advance to long-term efficacy studies in transduced cell models, supporting IND-enabling research.
- Mechanistic De-risking: Lack of ADAR1-p150, phosphor-PKR, or phosphor-IRF3 activation indicates reduced innate immune stimulation, a key safety consideration for in vivo application.
- Risk-Adjusted Advancement: Cell viability data (MTT assay) at 100 nM RNA concentrations inform dose-dependent toxicity profiles for lead optimization.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the antiviral discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical profiling, enabling seamless handoff between biology, assay development, and translational teams.
- Discovery Biology: Tests target engagement via HIV-1 suppression in a physiologically relevant expression system (NL4-3 plasmid).
- Screening: Delivers assay-ready outputs with Z'-factor potential due to internal controls and normalized signal windows.
- Analytics: Provides quantifiable, normalized endpoints—percent viral inhibition, relative cell viability, and immune marker phosphorylation—for comparative analysis across RNA designs.
- Translational Research: Connects short-term screening outcomes to long-term safety and efficacy evaluation in transduced cells.
- Enterprise Reuse: Platform-adaptable to other post-integration inhibitors or nucleic acid therapeutics beyond HIV-1, including siRNAs, shRNAs, and ribozymes for diverse targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking RNA sequence to functional antiviral activity and cellular safety profiles.
- Operational Value: Standardized transfection, incubation, and readout protocols ensure reproducibility across laboratories and campaigns.
- Strategic Value: Enables data-driven go/no-go decisions early in discovery, minimizing investment in ineffective or toxic candidates.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by balancing efficacy (HIV-1 suppression) with safety (no viability loss, no immune activation).
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid transfection, BSL-3 virology, and radioactivity-based quantification.
- Dependent on access to scintillation counters, microplate readers, and Western blot infrastructure for immune profiling.
- Necessitates standardized RNA purification and quantification to ensure consistent dosing across test conditions.
- Adaptation to primary cells or in vivo models may require optimization of delivery methods and assay readouts.
- Practical limitation: Radiolabeled assay steps increase complexity and regulatory burden; non-radioactive alternatives may be needed for broader adoption.
