Name: RNA的疗效和毒性的评价基因或药物治疗靶向HIV-1的生产使用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: 了解用于评估靶向HIV-1的RNA分子疗效与毒性的实验方法。该技术利用人胚肾293T细胞，可同时筛选多种RNA设计，快速识别有效的基因或药物候选分子。

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本研究工作由加拿大卫生研究院（CIHR）资助（资助号 DCB-120266、PPP-133377 和 HBF-348967，授予 A.G.）。

1. 细胞与转染
<ol>
	<li>在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中培养HEK 293T细胞。用细胞培养基制备浓度为2 × 105 个细胞/ml的细胞悬液。分别向24孔板、96孔板和12孔板的每个孔中加入500、100和1,000 µl细胞悬液，用于病毒生产、细胞活力和免疫激活检测（图2A）。</li>
	<li>轻轻摇匀培养板，在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。使细胞生长至50–70%融合度。</li>
	<li>根据转染方案，在1.5 ml微量离心管中配制待测RNA及其对照的稀释液（示例见图2B）。
	<ol>
		<li>对于病毒生产检测，配制浓度为10 ng/µl的HIV-1表达质粒溶液，并向每管中加入10 µl。随后配制浓度为5 µM的待测RNA和阴性对照RNA溶液。根据需要，向对应管中分别加入2.5或10 µl待测RNA或阴性对照RNA稀释液，使终浓度分别为25或100 nM。</li>
		<li>对于细胞活力检测，配制浓度为5 µM的待测RNA溶液和浓度为10 mg/ml的阳性对照RNA（低分子量Poly I:C）溶液。向对应管中分别加入2 µl待测RNA或阳性对照RNA稀释液，使终浓度分别为100 nM或200 µg/ml。</li>
		<li>对于免疫激活检测，向对应管中分别加入20 µl步骤1.3.2中配制的待测RNA或阳性对照RNA稀释液，使终浓度分别为100 nM或200 µg/ml。 
		注：若测试的是RNA表达质粒，则以10 ng/µl的质粒稀释液替代5 µM的待测RNA稀释液，在步骤1.3.1中终量分别为25和100 ng，在步骤1.3.2和1.3.3中终量均为100 ng。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分别向用于病毒生产、细胞活力和免疫激活检测的各转染管中加入50、25或75 µl DMEM。进行病毒生产检测时，在下一步操作前将细胞和已配制的转染管转移至生物安全三级（BSL3）实验室。</li>
	<li>依次向各转染管中加入2 µl转染试剂，室温孵育15至20分钟，使转染复合物形成。具体使用的转染试剂参见材料表。</li>
	<li>将每根微量离心管中的全部转染混合液逐滴加入对应细胞培养板的孔中。轻轻摇匀后，在37 °C、5% CO2条件下孵育48小时。</li>
	<li>在细胞培养板中检测HIV-1的产生（第2节）、细胞活力（第3节）和免疫激活情况（第4节）（图2C）。</li>
</ol>
2. 病毒产生检测
<ol>
	<li>从培养箱中取出24孔细胞培养板，在BSL3细胞培养罩内轻轻摇晃。从每个孔中转移150 µl上清液至96孔平底板的对应孔中，用于定量HIV-1的产生。 
	注意：常用的病毒定量方法包括通过酶联免疫吸附测定（ELISA）20检测HIV-1衣壳蛋白（p24）的表达、通过逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）21定量病毒RNA，以及检测HIV-1逆转录酶（RT）的活性。步骤2.2至2.5描述了定量HIV-1 RT活性的方法13,15,16。</li>
	<li>将5 µl上清液转移至含有25 µl病毒裂解液15（表1）的96孔板对应孔中。室温孵育5分钟，然后将板转移至放射性工作站。 
	注意：仅当BSL3实验室中无放射性工作站时，才需要执行步骤2.2。如果无需将板移出BSL3实验室，则直接进行步骤2.3，并用50 µl放射性/病毒裂解液（表1）替代25 µl放射性裂解液。</li>
	<li>配制放射性反应液15（表1），并向每孔病毒上清液与裂解液混合物中加入25 µl。将板在37 °C孵育2小时。</li>
	<li>取5 µl反应混合物点样于二乙氨基乙基（DEAE）玻璃纤维滤膜纸的对应方格中，静置干燥10分钟。点样时每隔一个方格点一次，确保任意两个样本之间不直接相邻。这有助于在步骤2.6测定每分钟计数（cpm）时避免样本间的交叉干扰。</li>
	<li>用2倍浓度的柠檬酸钠-氯化钠（SSC）缓冲液（表1）洗涤滤膜纸5次，每次5分钟，随后用95%乙醇洗涤2次，每次1分钟。让滤膜纸自然干燥，并将其密封于样品袋中。</li>
	<li>将装有滤膜纸的样品袋固定在样品盒中，插入微孔板闪烁计数器。将计数器设置为检测32P的每分钟计数（cpm），并输入实验中所用[32P]dTTP批次的参考日期。根据板图选择需读取的样品，启动计数器。</li>
	<li>对于任何病毒定量方法，将每个测试RNA所得数值除以其相邻的阴性对照值，再将结果乘以100，即可得到各测试RNA重复样本对HIV-1产生的抑制百分比。不同浓度下不同测试RNA的比较结果示例见图3。</li>
</ol>
3. 细胞活力检测
<ol>
	<li>从培养箱中取出96孔板，向每孔加入20 µl用Dulbecco's磷酸盐缓冲液（DPBS）稀释的5 mg/ml MTT（3-[4,5-二甲基-2-噻唑基]-2,5-二苯基-2H-四氮唑溴盐）。于37 °C孵育3小时。</li>
	<li>向每孔加入150 µl含去污剂的酸性异丙醇溶液（含1% NP-40和4 mM HCl的异丙醇），于室温孵育2小时。</li>
	<li>使用微孔板分光光度计测定570 nm处的吸光度。</li>
	<li>通过将每个阳性对照和待测RNA样品的测定值除以其相邻转染对照的值，计算相对MTT代谢率。不同待测RNA与阳性对照的比较结果示例见图4。</li>
</ol>
4. 免疫激活检测
<ol>
	<li>从培养箱中取出12孔板，吸除培养基。用DPBS轻轻洗涤细胞两次，每孔加入70 µl冷裂解缓冲液22（包含蛋白酶和磷酸酶抑制剂，表1）。将板置于冰上孵育10分钟。</li>
	<li>将细胞裂解物转移至微量离心管中，通过将管子浸入液氮中快速冷冻。待样品完全解冻后，重复冻融循环2次，共进行3次冻融循环。</li>
	<li>在4 °C、15,700 × g条件下离心裂解物15分钟，以沉淀细胞碎片。将上清液转移至新的微量离心管中，使用考马斯亮蓝（Bradford）法23,24测定蛋白浓度。</li>
	<li>取每个样品75 µg蛋白，在10%变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，并如前所述将蛋白转移至硝酸纤维素膜25,26。</li>
	<li>电泳完成后并转移至膜上，将膜在Ponceau S染色液（表1）中孵育1分钟以显色蛋白条带，随后用双蒸水洗涤。利用可见的蛋白条带和蛋白分子量标记作为参考，在80 kDa和55 kDa处裁剪膜。 
	注意：在步骤4.4中，样品可在16 × 18 cm2的凝胶上电泳至34 kDa，便于在指定位置裁剪膜而不切断目标蛋白条带。或者，也可使用多个相同样品的凝胶以避免裁剪膜。</li>
	<li>用含0.05% Tween 20的Tris缓冲盐水（TBST，表1）洗去Ponceau S染色。加入含5%脱脂奶粉的TBST完全覆盖膜，室温下振荡孵育1小时。</li>
	<li>将膜在含3%牛血清白蛋白（BSA）的TBST中与一抗抗体共同孵育过夜（O/N），一抗稀释比例为1:1,000，分别针对ADAR1（110和150 kDa）、磷酸化PKR（62 kDa）和磷酸化IRF3（47 kDa），对应膜的上、中、下三部分。</li>
	<li>用TBST洗涤膜5次，每次5分钟，然后在含5%脱脂奶粉的TBST中加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗（稀释比例为1:5,000），室温孵育1小时。</li>
	<li>用TBST洗涤膜5次，每次5分钟，随后加入化学发光（ECL）检测试剂，按照制造商说明在X光片上显影蛋白条带。</li>
	<li>在X光片上观察到蛋白条带后，用抗体 stripping 溶液对膜的中、下部分各洗涤10分钟。随后将膜在含3% BSA的TBST中与一抗抗体过夜（O/N）孵育，一抗分别为总PKR抗体（稀释比例1:500）和IRF3抗体（稀释比例1:1,000），分别对应膜的中、下部分。重复步骤4.8和4.9，针对PKR膜（中部）使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗替代抗兔二抗。</li>
	<li>用TBST洗涤膜的下部5次，每次5分钟，然后在含3% BSA的TBST中加入抗肌动蛋白（actin）抗体（稀释比例1:5,000），室温孵育1小时。重复步骤4.8和4.9，使用辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠二抗替代抗兔二抗。不同测试RNA与阳性对照的实验结果示例见图5。具体所用抗体详见材料表。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述的 HIV-1 产生检测使用 HEK293T 细胞（图 2）进行，类似于用于筛选有效核酶13、shRNA10,29、siRNA30 和 U1i RNA11,31 靶位点的 HIV-1 RNA 检测方法。大多数研究采用不同的方法定量 HIV-1 产生量，通常在将 HIV-1 表达质粒与候选 RNA 共转染后 48 小时测量病毒产量。HIV-1 产生后，未成熟的病毒颗粒通过 HIV-1 蛋白酶对其多蛋白进行蛋白水解切割，转变为具有感染新细胞能力的成熟病毒颗粒。在步骤 2.2 至 2.5 所述的 HIV-1 逆转录酶（RT）活性检测中，同时评估了病毒的产生和成熟过程，因为 RT 酶仅在成熟病毒颗粒中具有活性。相比之下，衣壳蛋白和病毒 RNA 可能同时存在于成熟和未成熟的病毒颗粒中。因此，通过 p24 ELISA 或 RT-PCR 定量 HIV-1 产生量可能会遗漏作用于 HIV-1 复制周期成熟阶段的治疗性 RNA 的效应，例如定位于 HIV-1 病毒颗粒的核酶32，以及除抑制 HIV-1 蛋白表...

目前人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）治疗的一个局限性在于，必须长期给药以防止疾病进展。移植对HIV-1具有抗性的T淋巴细胞或造血干细胞，有望在无需药物治疗的情况下长期控制HIV-1的复制1,2，并可能成为实现HIV-1治愈的有效策略3。使细胞获得HIV-1抗性的一种方法是在自体移植过程中，将编码抗HIV-1 RNA或肽类的一个或多个基因插入患者自身的细胞中4。目前已设计出多种候选抗HIV-1基因，其中部分基因已进入临床试验，采用两种5或三种6基因联合使用的方式，以防止HIV-1对单一基因产生耐受性。
由于抗HIV-1 RNA引发免疫反应的潜力较低，且由非常短的基因序列转录而来，因此是联合基因治疗的主要候选分子之一。一些抗HIV-1 RNA被设计用于靶向病毒进入和整合过程。然而，大多数抗HIV-1 RNA靶向的是病毒生命周期中的整合后阶段（图1）。整合后抑制剂包括诱饵RNA（decoy RNAs），用于靶向HIV-1调控蛋白Tat或Rev1；以及基于反义RNA的分子，用于靶向HIV-1 RNA中不同位点，例如核酶7、shRNA8和U1i RNA9。用于比较抗HIV-1 RNA有效性的方法包括：监测转导了编码候选RNA基因的细胞中病毒的复制情况，以及检测瞬时转染了表达候选RNA的质粒和HIV-1表达质粒的细胞中病毒的产生情况10-13。我们此前曾使用HIV-1病毒产量检测法来筛选HIV-1 RNA中新的核酶靶位点13-15。此后，这些方法得以优化，以改进从质粒DNA表达为shRNA或以合成siRNA形式递送的RNA干扰分子的实验形式16。该检测法通过测量人胚肾（HEK）293T细胞中成熟病毒的产生量，可用于比较靶向HIV-1复制周期中整合后步骤的抑制剂的作用效果（图1）。对于靶向整合前步骤的抑制剂，则需要使用其他检测方法，例如TZM-bl细胞感染性检测法17，以评估其抗病毒效力。
在临床中递送抗HIV-1 RNA的主要安全问题包括对人类RNA或蛋白质的潜在脱靶效应，以及对天然免疫感受器的激活。为了评估抗HIV-1 siRNA的毒性，我们已在不同细胞系中使用了细胞活力检测16。我们还检测了双链RNA免疫感受器——RNA激活的蛋白激酶R（PKR）和Toll样受体3（TLR3）的激活情况，以及干扰素刺激基因ADAR1 p150的表达水平。这些检测可用于确认抗HIV-1 RNA的疗效并非源于对细胞活力或免疫感受器激活的间接影响，同时也有助于排除具有潜在毒性的候选RNA，避免其进入后续开发阶段。
在以下方案中，描述了识别新型治疗性RNA以及优化现有RNA形式的方法。这些方法可用于筛选基于RNA的HIV-1复制后期整合抑制剂，也可加以改造用于筛选其他类型的后期整合抑制剂，例如靶向Rev介导的病毒RNA输出的小分子18，或设计用于靶向整合型HIV-1 DNA的CRISPR/Cas系统19。

<table><tbody><tr><td>DMEM HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>FBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素 Gibco</td><td>Thermo Fisher</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>细胞培养板，96 孔、24 孔、6 孔</td><td>Corning</td><td>353075, 353047, 353043</td><td></td></tr><tr><td>微量离心管 Axygen</td><td>Corning</td><td>311-08-051</td><td></td></tr><tr><td>低分子量 Poly I:C</td><td>InvivoGen</td><td>3182-29-6</td><td></td></tr><tr><td>DharmaFECT-1</td><td>Dharmacon</td><td>T-2001-01</td><td>合成 RNA 转染试剂</td></tr><tr><td>TransIT-LT1</td><td>Mirus</td><td>MIR 2300</td><td>RNA 表达质粒转染试剂</td></tr><tr><td>Nonidet P40 (NP-40)</td><td>USB</td><td>19628</td><td></td></tr><tr><td>[&lt;sup&gt;32&lt;/sup&gt;P]dTTP</td><td>Perkin Elmer</td><td>BLU505H</td><td></td></tr><tr><td>poly(A) RNA 模板&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10108626001</td><td></td></tr><tr><td>oligo(dT)&lt;sub&gt;12-18&lt;/sub&gt; DNA 引物</td><td>Thermo Fisher</td><td>18418-012</td><td></td></tr><tr><td>DEAE 滤膜纸&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-522</td><td></td></tr><tr><td>微孔板闪烁计数器</td><td>Perkin Elmer</td><td>1450-024</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-2128</td><td></td></tr><tr><td>DPBS HyClone</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>微孔板分光光度计</td><td>Bio-rad</td><td>1706930</td><td></td></tr><tr><td>裂解缓冲液片剂</td><td>Roche</td><td>4693159001, 4906837001</td><td>蛋白酶和磷酸酶抑制剂</td></tr><tr><td>微量离心机</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>Bradford 试剂</td><td>Bio-rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>凝胶电泳槽</td><td>Hoefer</td><td>SE600</td><td></td></tr><tr><td>半干式转膜仪</td><td>Bio-rad</td><td>1703940</td><td></td></tr><tr><td>蛋白分子量标准 EZ-Run</td><td>Thermo Fisher</td><td>BP3603-500</td><td></td></tr><tr><td>硝酸纤维素膜</td><td>Bio-rad</td><td>162-0094</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9647-1006</td><td></td></tr><tr><td>抗体 stripping 溶液</td><td>Millipore</td><td>2504</td><td></td></tr><tr><td>ECL - Pierce</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp;</td><td>PI32106</td><td></td></tr><tr><td>ADAR1 抗体</td><td></td><td></td><td>来自 Dr. B.L. Bass</td></tr><tr><td>磷酸化-T446-PKR 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab32036</td><td></td></tr><tr><td>磷酸化-S396-IRF3 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>4947</td><td></td></tr><tr><td>PKR 抗体</td><td></td><td></td><td>来自 Dr. A. Hovanessian</td></tr><tr><td>IRF3 抗体</td><td>Cell Signaling</td><td>11904</td><td></td></tr><tr><td>肌动蛋白抗体</td><td>Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔抗体</td><td>KPL</td><td>474-1506</td><td></td></tr><tr><td>辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠抗体</td><td>KPL</td><td>474-1806</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6226-79-5</td><td></td></tr></tbody></table>

评估靶向hiv-1产生的rna在基因或药物治疗中的有效性和毒性

Evaluation of the Efficacy And Toxicity of RNAs Targeting HIV-1 Production for Use in Gene or Drug Therapy

针对HIV-1复制周期整合后步骤的小RNA疗法是当前基因治疗的首要候选方案之一，同时也具有作为HIV-1感染药物治疗的潜力。整合后抑制剂包括核酶、短发夹（sh）RNA、小干扰（si）RNA、U1干扰（U1i）RNA以及RNA适配体。其中许多抑制剂是通过瞬时共转染实验结合HIV-1表达质粒筛选获得的，部分已进入临床试验阶段。除了评估其有效性外，小RNA还被系统评价了对人类RNA表达的影响、对细胞生长和/或分化的作用，以及是否可能激活先天免疫反应。本文所述的实验方案包含一系列瞬时转染检测方法，旨在评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子的有效性与毒性。我们已利用这些方法鉴定出新的核酶，并优化了靶向HIV-1 RNA的shRNA和siRNA的结构形式。这些方法提供了一套快速有效的检测体系，可用于筛选新型抗HIV-1 RNA分子，也可根据需要调整用于筛选其他HIV-1复制整合后抑制剂。

实验流程的总体示意图见图2，其中图2B提供了针对三种测试RNA和一种对照RNA的转染方案示例。在进行病毒产生和细胞活力检测时，每种测试载体的结果均相对于阴性对照进行归一化处理。重复实验以组为单位进行转染，使得每种测试RNA均以其相邻的阴性对照为基准进行归一化。这样做是为了避免因复合物形成与转染之间的时间差异而导致的数据偏差，例如若所有阴性对照先被转染就可能产生此类偏差。由于HIV-1可能影响免疫反应27,28，在进行细胞活力和免疫激活检测时，不加入表达HIV-1的质粒。
为了确定靶向HIV-1 RNA中保守位点（HIV-1 NL4-3株，位置1498-1519）的RNA干扰分子的最佳长度13，设计了一组siRNA（图3A）。利用HIV-1产生检测法，计算了共转染不同量待测siRNA与100 ng表达HIV-1...

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

靶向HIV-1复制周期整合后步骤的小RNA疗法是基因治疗的主要候选方案之一，具有……的潜力

本实验的总体目标是比较靶向 HIV-1 产生的新型 RNA 在疗效和毒性方面的差异。该方法有助于筛选可用于 HIV-1 基因或药物治疗的新型 RNA 分子，例如短发夹 RNA 或小干扰 RNA、核酶以及 RNA 诱饵。该技术的主要优势在于，可在短时间内同时筛选多种新型 RNA 设计。尽管该方法最初旨在评估用于 HIV 的新型 RNA 药物或基因治疗，但它也可应用于其他系统，例如小分子或 CRISPR 实验。我们最初萌生该方法的想法是在建立实验以筛选大量具有抗 HIV 效果的核酶时。首先，用含 10% FPS 和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 将人胚胎肾 293T 细胞重悬，制备成每毫升含 2 × 10⁵ 个细胞的细胞悬液。分别向24孔板、96孔板和12孔板的每个孔中加入500、100和1,000微升细胞悬液，用于病毒产生、细胞活力和免疫激活检测。轻轻摇动培养板，在37°C、5% CO₂条件下孵育过夜，直至细胞融合度达到50%至70%。对于病毒产生检测，配制10纳克/微升的HIV-1表达质粒稀释液，并向每个检测管中加入10微升。接下来，配制测试RNA和阴性对照RNA的5微摩尔稀释液。然后，根据所需的终浓度为25纳摩尔或100纳摩尔，分别向相应试管中加入2.5微升或10微升的各测试RNA及阴性对照稀释液。对于细胞活力检测，配制测试RNA的5微摩尔稀释液以及阳性对照RNA——低分子量poly(I:C)——的10毫克/毫升稀释液。根据终浓度分别为100纳摩尔或200微克/毫升，分别向相应试管中加入2微升的测试RNA或阳性对照RNA稀释液。进行免疫激活实验时，将细胞活力实验所配制的待测RNA或阳性对照RNA稀释液各20微升分别加入相应离心管中，使终浓度分别为100纳摩尔或200微克/毫升。然后，分别向用于病毒生产、细胞活力和免疫激活实验的转染管中加入50、25或75微升DMEM培养基。对于病毒生产实验，在下一步操作前需将细胞和已准备好的转染管转移至生物安全三级（BSL-3）实验室。依次向转染管中加入两微升转染试剂，孵育15至20分钟，使复合物形成。将每根微量管中的全部转染混合液逐滴加入细胞培养板中对应的孔内。轻轻摇晃，然后将培养板在37°C和5%二氧化碳条件下孵育48小时。进行病毒增殖检测时，从培养箱中取出24孔细胞培养板后，将其转移至BSL-3级细胞培养生物安全柜中。轻轻摇晃培养板，然后从每孔中吸取150 µL上清液，转移至对应的96孔平底板孔中，用于定量检测HIV-1的产生。另取5 µL上清液，转移至含有25 µL病毒裂解液的96孔板对应孔中。将混合物在室温下孵育5分钟后，将培养板转移至放射性工作台。接着，配制放射性混合液，并向每孔病毒上清液和裂解混合液中各加入25 µL。将培养板在37 °C条件下孵育2小时。将5微升反应混合物点样至玻璃纤维/DEAE滤膜纸上的相应方格中，让斑点干燥10分钟。使用2×SSC缓冲液洗涤滤纸5次，每次5分钟，随后用95%乙醇洗涤2次，每次1分钟。待滤纸干燥后，将其密封于样品袋中。将装有滤膜纸的样本袋剪下并放入样品盒中，然后将样品盒插入微孔板闪烁计数器中，启动计数器。对于任何病毒定量方法，将每个测试RNA所得数值除以相应的阴性对照值，再将结果乘以100，得到每个测试RNA重复样本对HIV-1产生的抑制百分率。进行细胞活力检测时，从培养箱中取出96孔板后，向每个孔中加入20微升浓度为5毫克/毫升的MTT和DPBS。随后在37摄氏度下孵育3小时。向每个孔中加入150微升含去垢剂的酸化异丙醇，并在室温下孵育2小时。然后使用微量板分光光度计测定570纳米处的吸光度。通过将每个阳性对照和待测RNA样品所获得的数值除以其对应的相邻转染对照值，计算相对MTT代谢率。对于免疫激活实验，在从培养箱中取出12孔板后，吸除培养基，并用DPBS轻柔洗涤细胞两次。然后向每个孔中加入 70 µL 含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的预冷裂解缓冲液，将培养板置于冰上孵育 10 分钟。将细胞裂解液转移至微量离心管中，并通过将管子浸入液氮中快速冷冻。待样品解冻后，再进行两次冻融循环，总共完成三次冻融循环。接下来，在 15,700 × g 和 4 °C 条件下离心裂解液 15 分钟，以沉淀细胞碎片。然后，在电泳并转膜后，将膜在 Ponceau S 溶液中孵育 1 分钟以显色蛋白条带，随后用双蒸水洗涤。根据蛋白条带和蛋白分子量标记，将膜在 80 和 55 千道尔顿处进行切割。接着使用含 0.05% TWEEN 20 的 TBS 缓冲液（TBST）洗去 Ponceau S 染色。加入含 5% 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液完全覆盖膜，并在室温下轻轻摇动孵育一小时。将膜分别转移至含3% BSA的TBST中，针对膜的上、中、下三部分，分别加入稀释比例为1:1,000的ADAR、phospho-PKR和phospho-IRF3一抗。4摄氏度下振荡孵育过夜。次日早晨，用TBST洗涤膜5次，每次5分钟，随后转移至含5%脱脂奶粉和1:5,000辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗的TBST中，室温孵育1小时。在胶片上显影蛋白条带后，使用洗脱液对膜的中部和底部条带进行洗涤，持续10分钟，随后将膜的中部条带与PKR抗体孵育，底部条带与IRF3抗体孵育。作为阳性对照，根据文本方案使用Actin抗体探测底部膜。此处显示了实验的总体示意图，并附有三个测试RNA和一个对照RNA的示例转染方案。在病毒产生和细胞活力检测中，每种测试构建体的结果均相对于阴性对照进行归一化处理。利用转染了表达HIV-1 NL4-3株系质粒的细胞进行HIV-1产生检测，通过计算共转染本图所示的某一种siRNA的细胞相对于转染长链Dicer底物无关siRNA的细胞的逆转录酶（RT）活性百分比，以确定靶向HIV-1 RNA保守位点的RNA干扰分子的最佳长度。基于所鉴定出的最有效siRNA，测定转染细胞对MTT的代谢百分比。在双链RNA中，聚肌胞苷酸（poly(I:C)）仅在最高剂量下降低了细胞活力。对于靶向HIV-1 RNA中1498位点的小干扰RNA（siRNA），无论其长度如何，均未观察到细胞活力的显著降低。如本图所示，通过蛋白质印迹（Western blot）检测，对同一组RNA在免疫激活实验中进行了评估。在poly(I:C)激活ADAR1-p150表达并诱导PKR和IRF3磷酸化的条件下，任何测试RNA均未显示出对失活标志物的显著影响。一旦掌握，若操作得当，该技术可在七天内完成。在进行该实验时，使用高质量的RNA和DNA转染样品至关重要。此外，需设置适当的阴性对照和阳性对照。通过该流程，还可采用其他方法，如转导细胞的 HIV 感染实验，以评估潜在抗 HIV 候选物的长期有效性和毒性。该技术建立后，使我们能够鉴定出 HIV RNA 中一个易于接近且高度保守的靶位点，并优化了靶向该位点的核酶、shRNA 和 siRNA 的设计形式。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用病毒产生实验快速筛选靶向 HIV 产生的新型 RNA 候选分子的抑制效果，并通过免疫激活和细胞活力实验评估其潜在毒性。请务必注意，操作 HIV 和放射性标记的核苷酸可能具有极高危险性。在执行本实验时，必须始终采取相应防护措施，例如在经认证的生物安全实验室和放射性实验室中进行操作。

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RNA的疗效和毒性的评价基因或药物治疗靶向HIV-1的生产使用

目前的HIV-1治疗策略旨在抑制病毒生命周期，但无法有效根除感染。本文中，我们证明了一种经过基因工程改造的重组酶能够高效地从感染细胞的基因组中切除整合的HIV-1前病毒DNA。...

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基于DNA载体的RNA干扰技术用于研究癌症中的基因功能

来源： Scarborough, R. J., et al. 针对HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中应用的疗效与毒性评估。 J. Vis. Exp.

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本文介绍了细胞毒性及单周期感染性检测方法，可用于快速、准确地筛选化合物，以确定其对野生型和耐药型 HIV-1...

快速筛选HIV逆转录酶和整合酶抑制剂

本文介绍了一种利用高通量RNA干扰筛选来发现可被调控以增强溶瘤病毒治疗效果的宿主靶点的实验方案，特别是针对弹状病毒和痘苗病毒治疗，但该方法也可轻松适用于其他溶瘤病毒平台，或用于发现普遍调控病毒复制的宿主基因。...

全基因组RNA干扰筛选鉴定调控溶瘤病毒治疗的宿主因子

本文描述并应用了一种高通量方案，用于功能性评估高效激活HIV并清除潜伏前病毒的效果，通过检测干预措施对HIV转录和剪接的影响来实现。文中提供了潜伏期逆转剂对LTR驱动的转录和剪接作用的代表性结果。...

高通量体外评估潜伏逆转剂对HIV转录与剪接的影响

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用于阴道内HIV暴露及HIV感染治疗研究的人源化NOG小鼠

本文介绍了一种用于建立和验证良好实验室规范的方案，通过数字液滴式聚合酶链式反应法对人体泪液中的腺相关病毒载体进行合规性检测，以支持基因治疗载体的临床开发。...

一种可验证的微滴数字聚合酶链式反应检测方法用于腺相关病毒载体在泪液生物脱落研究中的检测

本研究采用in-silico策略，鉴定出利匹韦林为一种具有前景的HIV治疗药物。我们关于分子相互作用与动力学的研究结果，支持合理设计新型非核苷类逆转录酶抑制剂（NNRTIs），作为可能的HIV治疗替代方案。...

非核苷类逆转录酶抑制剂的定量构效关系、活性预测及分子动力学

了解用于评估靶向HIV-1的RNA分子疗效与毒性的实验方法。该技术利用人胚肾293T细胞，可同时筛选多种RNA设计，快速识别有效的基因或药物候选分子。

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