Name: 中的应用在体内评定组织的鼠胫骨前的功能测试工程化骨骼肌修复 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 了解大鼠胫骨前肌体内功能测试方法，通过腓神经刺激测量足背屈以评估肌肉病理状态。该技术为组织工程修复策略提供可靠的实验范式，助力肌肉再生医学研究。

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作者谨此感谢 Hannah Baker 博士在优化本实验方案过程中所做的大量工作。

所有动物均得到人道对待，所有实验方案均经弗吉尼亚大学动物护理与使用委员会（IACUC）批准。
1. 仪器设备准备
<ol>
	<li>确保所有设备均已正确连接。</li>
	<li>先打开计算机，然后依次开启高功率双相刺激器和双模式杠杆系统。</li>
	<li>此时，将动物放入通有2%异氟烷的麻醉舱中，并打开加热元件，使平台温度升至37 °C。</li>
	<li>将电极置于70%乙醇中，确保聚四氟乙烯（PTFE）涂层尖端完全浸没，以便在设置设备和软件的同时进行消毒。</li>
	<li>在桌面上找到并打开杠杆系统控制软件。 
	注意：该软件将用于执行功能测试。</li>
</ol>
2. 软件设置
<ol>
	<li>程序打开后（图1A），在“设置”菜单下将Instant Stim的参数更改为所需值。 
	注意：在本方案中，所有参数均保持预设值，仅将&#34;运行时间（s）&#34;更改为180秒（图1B）。</li>
	<li>在“设置”菜单下创建一个自动保存文件夹。</li>
	<li>找到标记为&#34;自动保存基础&#34;的可输入窗口。输入样品名称，例如&#34;Rat1-日期-时间点&#34;。在&#34;自动保存基础&#34;可输入窗口的正左侧，单击&#34;启用自动保存&#34;复选框。</li>
	<li>在控制界面顶部选择&#34;序列器&#34;。新窗口将打开。在新窗口底部选择&#34;打开序列&#34;。另一个新窗口将打开。选择预设序列并单击“确定”。包含频率、刺激持续时间和休息时间等序列参数的方案列表将在名为“序列编辑器”的窗口中显示（图1C）。单击&#34;加载序列&#34;-&#62; &#34;关闭窗口&#34;。</li>
	<li>要查看实时电流和刺激情况，请选择&#34;文件&#34;->“实时数据监控&#34;。新窗口将打开。</li>
	<li>在新的实时数据窗口中，使用自动缩放功能或手动输入屏幕上显示的y轴最大值和最小值，以设置测试界面。</li>
</ol>
3. 动物准备
注意：所有力的测量值均来自一只11周龄的Lewis大鼠。肌肉质量与力的产生（单位：牛顿）之间存在线性相关关系。因此，随着大鼠年龄的增长，其腿部产生的力值也应相应增加。
<ol>
	<li>在将动物从麻醉舱中取出之前，确保其已达到适当的麻醉平面。使用电动剃毛器，彻底去除实验侧腿部踝关节至骨盆外侧的所有毛发。 
	注意：当动物对脚趾夹捏无反应时，即达到适当的麻醉平面。必须遵循各机构动物护理与使用委员会（Animal Care and Use Committee）制定的指导原则。</li>
	<li>将动物置于仰卧位，并确保其鼻部牢固地置于麻醉鼻罩内，以维持足够的麻醉深度。</li>
	<li>通过三个独立的旋钮调节踏板装置的位置（图2）。使用旋钮（A 和 B）调节脚踏板，分别将踏板装置移至最左侧和最低位置。这将有助于正确固定动物足部，同时为后续操作留出空间。在此位置，使用轨道左侧的旋钮将装置向实验者方向或远离实验者方向移动，使动物腿部处于一条直线平面。</li>
	<li>用碘伏和酒精交替清洁腿部三次，每次更换消毒液。碘伏应在腿部停留30秒。</li>
	<li>调整动物或平台位置（图2A, D），使伸展的腿部确保足底与脚踏板完全接触。</li>
	<li>使用医用胶带将动物足部固定在脚踏板上（图2D）。必须确保足跟紧贴踏板底部，整个足部平贴于踏板，且在测试过程中不会松脱。</li>
	<li>找到夹紧装置以稳定腿部。将稳定销推入足够深度以减少腿部移动，并用内六角扳手将其锁定。</li>
	<li>在此位置，使用旋钮 C 将装置向实验者方向或远离实验者方向移动，使踝关节、胫骨和股骨处于一条直线（图2C）。确保腿部与脚踏板平行。调节装置背面的粗调和微调旋钮，缓慢移动踝关节，使足部与胫骨呈90°角。</li>
	<li>继续移动腿部，使股骨与胫骨成90度直角（图2B）。此时，动物已准备好进行电极连接。</li>
</ol>
4. 电极的放置
<ol>
	<li>通过点击标有 &#34;Instant Stim&#34; 的橙色按钮，激活 &#34;Instant Stim&#34; 功能。</li>
	<li>将两个电极浅表地放置在胫骨前肌近端，并移动电极尖端，直到实时监测器上出现尖峰信号。理想情况下，尖峰信号应约为 0.4 N。 
	注意：电极应紧邻腓总神经走行平面并与其垂直。腓总神经从膝部外侧发出，与胫骨垂直走行。</li>
	<li>将一根针电极插入至足够穿透真皮层并轻微进入肌肉层的位置。移动另一电极，直到实时监测器上出现约 0.6 N 的尖峰信号。插入针电极后，使用 hobby 夹或医用胶带将其固定。</li>
	<li>调节粗调和微调旋钮，以找到最大收缩力输出。</li>
	<li>在高功率双相刺激器上，中央有两个旋钮。一个标为 &#34;RANGE&#34;，另一个标为 &#34;ADJUST&#34;。将 &#34;RANGE&#34; 旋钮调至所需的最大电流值。 
	注意：峰值将逐渐增大，最大电流值的确定标准是连续三次刺激产生相同的收缩反应。避免将电流调得过高；最大电流可使整块肌肉完全收缩，但更高的电流会引发邻近肌肉甚至拮抗肌的参与。</li>
	<li>旋转 &#34;ADJUST&#34; 旋钮，设定用于刺激肌肉的 &#34;RANGE&#34; 百分比。此时，测得的力应约为 1.0 N。这可能需要适当增加或减少电流。</li>
	<li>重新检查电极，确保其固定牢固。停止 Instant Stim。</li>
	<li>在 &#34;Live Data&#34; 窗口中，点击 &#34;Start Sequence&#34;。</li>
	<li>返回控制界面，点击橙色 &#34;Instant Stim&#34; 按钮上方的 &#34;Analysis&#34; 按钮，继续监测曲线变化。强直收缩曲线应在 60 Hz 刺激时开始成形。</li>
</ol>
5. 结束刺激与清理
<ol>
	<li>序列结束后，取下电极并用70%酒精擦拭干净。将电极放入保护套中。</li>
	<li>松开膝部夹具并关闭麻醉。将动物移出麻醉气体环境，仍置于加热垫上，呈俯卧位。维持大鼠吸入100%氧气2 异氟烷气体关闭后，继续供氧几分钟以维持大鼠的氧合状态。&#160;动物在最初可能会移动，但在其恢复意识之前不得将其放回笼中。如果在恢复期间出现肌肉酸痛，应根据动物护理指南给予指定剂量的非甾体抗炎药（NSAID）&#160;委员会&#160;</li>
	<li>关闭步骤1.2中列出的所有设备，关闭软件，然后继续进行数据分析。</li>
	<li>擦拭平台和脚踏板。</li>
</ol>
6. 数据分析
注意：数据分析需根据本实验室设计的序列及实验室操作规程进行。分析参数、关键数据点及其他操作步骤将根据用户的实验目的而有所调整。
<ol>
	<li>打开数据分析软件。</li>
	<li>点击高通量（High Throughput）菜单，以同时分析多个数据文件（样品）。选择 &#34;Force Frequency&#34; 分析。</li>
	<li>点击 &#34;Pick Files&#34; 按钮，打开任意数量的已保存数据文件。</li>
	<li>在光标放置方法（Cursor Placement Method）框中选择 &#34;Manual&#34;。 
	注意：这将允许用户分析指定时间戳范围内的所有数据，而不是由程序自动选择分析位置。</li>
	<li>将结束光标（End Cursor）时间戳值更改为 2。点击 &#34;Analyze&#34; 按钮（图 1D）。</li>
	<li>如需保存表格并使用电子表格软件分析数据，请点击 &#34;Save Table to ACSII 按钮。这将保存文件，之后可用电子表格程序打开。</li>
	<li>在电子表格中打开已保存的数据文件。</li>
	<li>创建一个额外的列，标记为 &#34;Absolute Maximum&#34;，并计算每个样品的基线值与最大值之间的差值。这将提供在每个频率下产生的最大总力。</li>
	<li>为计算扭矩，将每个力值乘以杠杆臂的长度。 
	注意：在此情况下，该长度由动物足部长度表示。本方案采用实验测定的平均值 30 mm。此时，用户已获得在各频率下产生最大扭矩的数值。</li>
	<li>将这些数值绘制成扭矩-频率曲线，即动物在所有刺激频率下产生的最大扭矩。 
	注意：该曲线可作为样品间比较的单一参考点进行识别和使用。</li>
</ol>

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作者声明无利益冲突。

本方案展示了一种相对简单的方法，用于执行 体内 大鼠后肢前肌室肌肉功能测试。其他形式的肌肉功能测试，包括 离体 和 原位 方案还可以提供有关肌肉生理学的重要信息。然而，其意义在于 体内 功能测试的优势在于其非侵入性，以及能够最准确地重现肌肉刺激的内源性机制。对于两者而言 离体 和 原位 测试过程中，肌腱和/或肌肉会暴露在外，因此必须保持湿润或浸没。 41,42. 体内 检测可消除由手术操作引起的创伤和炎症等混杂变量 原位 肌肉功能测试；如果实验目的是研究炎症和细胞过程，这一点尤为重要43此外， 体内 测试 对外科技术要求较低，因为肌肉无需从周围组织中分离，也不需要打精确的结来减少肌肉/肌腱滑脱（而后者在 原位 或 离体 测试）41此外，经过足够的练习，操作者能够快速准确地放置电极，并迅速调整以实现肌肉最大力量输出，从而确保该方案在同一只动物体内以及不同操作者使用相同设备时均能快速、可重复地完成。39建议在切除较难获取的协同肌（EDL 和 HL）之前，先按照图示对整个前胫骨肌群进行评估，以便更直接地研究 TA 肌肉。采用这种方法，操作者可以相对较快地掌握该技术。尽管本文所述的操作流程重点展示并强调了使用力-频率刺激方案诱导强直收缩并测定肌肉最大收缩力的实用性，但使用者应根据自身具体的实验设计和研究目标，确定最适合的功能检测类型。
为了确保实验结果的最佳性和可重复性，即肌肉对各种刺激参数产生一致的最大力量，有几个关键步骤需要仔细操作。这些关键特征在图2中进行了概述。然而，刺激电极的正确放置和稳定性是可重复地实现腓总神经最大刺激的绝对前提。在这方面，电极应浅表放置；也就是说，如果电极插入过深，可能会直接电刺激到拮抗肌，从而降低前小腿肌群收缩反应的幅度。此外，两个电极应尽可能靠近放置，以减少周围皮肤和结缔组织的电阻。通常，将电极置于靠近膝关节、小腿内侧，沿胫骨前肌边缘直至其与腓肠肌交汇处的位置，往往能够获得足够的力量输出。这种位置还能确保电极紧邻并垂直于腓总神经的走行平面，而该神经从膝部出发，垂直于胫骨并向小腿外侧下行。然而，由于动物个体间解剖结构存在天然差异，必须持续保持警惕，以确保针对每个个体优化电极位置。因此，电极放置过程中不可避免地存在一定试错成分，但操作者的经验可显著减少此类试错。应尽量减少电极穿刺皮肤的次数，以避免肿胀和炎症，这些因素会降低测得的肌肉力量。这取决于针头初始放置的位置，但建议特别是在髌骨周围区域，穿刺次数不超过两次。最后，当电极插入动物腿部后，可对肢体位置以及通过电极施加的电流进行微调。此过程应同时监测单次刺激引发的肌肉收缩力。除了调整电极位置外，也可调节施加在电极间的电压。但在本实验所描述的设置中，需谨慎通过提高电压来增加力量输出，因为电压升高会刺激支配拮抗肌的神经。
为确保电极放置位置始终处于最佳状态，必须关注三个关键的技术问题。首先，必须将麻醉动物的足部牢固地固定在足踏板装置上，该装置用于测量肌肉产生的力量（图2）。如果足部未牢固固定，肌肉实际产生的力量可能无法完全传递至力传感器。足部固定不稳还会带来电极位置偏移的风险，因为超出正常肌肉收缩范围的运动（例如足部脱离脚踏板）可能导致电极从浅表位置移位甚至完全脱落。上述任何一种情况都会降低测得的力量值。其次，动物身体应完全仰卧，并保持在一条直线平面上（图2）。正确摆放动物体位可防止腿部因呼吸而产生轻微移动，同时最大限度减少腿部和骨盆的扭转，从而有助于刺激电极的准确定位并维持持续接触。第三，膝关节的正确摆放和固定至关重要，以确保腿部保持稳定，进而帮助维持刺激电极的最佳位置，实现腓总神经的稳定激活。
有几个额外要点需要强调。首先，商用肌肉杠杆系统设计用于左后肢的检测，但也可对装置进行调整，以用于右后肢的检测。其次，应根据实验动物的体型选择合适的肌肉杠杆系统，因此使用者需确保所用平台足以测量并承受所选动物模型产生的力量。该设备平台可检测的肌肉仅限于能够引起足部跖屈或背屈的肌肉。第三，需要再次强调，电极放置具有挑战性，需要耐心和反复练习才能掌握该技术。此外，电极在常规使用过程中会迅速变钝，因此建议准备多套备用电极，以便在难以实现皮肤浅层穿刺时更换。第四，本报告中描述的实验方案采用了特定的刺激序列和数据分析流程。肌肉杠杆系统的控制软件及数据分析软件所提供的数据可用于回答多种其他实验问题，因此其应用范围远不止本文所述内容。使用者应积极探索本文所列软件协议之外的其他功能。尽管存在这些微小局限性，in vivo 肌肉功能检测仍是一种强大的方法，可用于评估骨骼肌的健康状况和收缩能力，因其具有微创性，可在长时间内对同一动物进行多次重复检测。总之，这种实用且可靠的功能使该系统特别适用于检测新型疗法对中国台湾地区大鼠后肢骨骼肌损伤或疾病的影响。

骨骼肌在应对损伤或疾病时具有显著的内在修复能力1,2。在实验上，这种再生反应的强度已在动物模型中得到充分证实，例如通过研究施用肌毒素（如，心脏毒素）后骨骼肌损伤、修复和再生的时间进程3-7。更具体而言，在心脏毒素引起的大范围肌肉损伤（38–67%的肌纤维8）之后，再生过程由卫星细胞介导，这些驻留的干细胞会成熟并最终形成功能性肌纤维4,9-13。最终结果是损伤后健康、可产生力量的肌肉组织实现功能性再生增强14-16。尽管其具体机制远超出本报告的范围，但肌肉再生的机制基础反映了来自多个谱系的多种细胞类型通过经典信号通路协同作用的精密调控过程，这些信号通路对组织发育和形态发生均至关重要5,17-21。重要的是，肌毒素诱导的再生得以实现，是因为在心脏毒素引起的肌肉损伤后，细胞外基质、神经支配和血管灌注在结构上仍保持完整3,8,22。与此形成鲜明对比的是，在VML（体积性肌肉损失）损伤情况下，这些关键的组织结构和组分按定义完全缺失；由于多种原因导致的组织实质性丧失，会造成永久性的功能和外观缺陷23-25。
尽管与由肌毒素引起的肌肉损伤相比，VML损伤后的肌肉修复和再生面临更多额外挑战，但通过结合生物学相关的动物模型以及对相关功能指标进行纵向评估，将有助于更深入地理解骨骼肌再生与修复的机制基础。如本文所述，大鼠后肢的研究为此提供了极佳的模型系统。更具体而言，前小腿间室的肌肉（胫骨前肌、趾长伸肌（EDL）和拇长伸肌（HL）），负责足部背屈，易于识别和操作。此外，这些肌肉由主要血管（髂动脉及其分支）供血，并由沿下肢走行的神经（坐骨神经及其分支，包括腓神经）支配。26-28因此，可利用大鼠后肢模型直接评估骨骼肌功能/病理状态 体内，或评估病理相关的血管或神经改变对相应骨骼肌功能的间接影响。在这两种情况下，均可通过肌肉力量输出（力矩）及相应的足部运动来确定疾病的严重程度以及治疗效果。29-34.
理想情况下，力的测量应结合组织学研究和基因表达分析，以更严格地评估骨骼肌的结构和分子状态。例如，基础组织学和免疫组织化学可用于回答有关肌肉大小、肌纤维排列、细胞外基质成分、细胞核位置、细胞数量以及蛋白质定位等问题。而基因表达分析则对于识别可能影响或调节肌纤维成熟度、疾病状态及代谢活性的分子机制至关重要。尽管这些方法提供了关键信息，但通常代表终点性检测指标，更重要的是，它们无法直接反映骨骼肌的功能能力，因此仅具有相关性而非因果性。然而，当组织学研究和基因表达分析与功能测定相结合进行评估时，便能最准确地识别出力量产生及功能再生的机制。
在这方面，可以测量肌肉的产力能力 体外, 原位，或 体内三种方法均各有优缺点。在一项 体外 例如，在实验中，肌肉被完全分离并从动物体内取出。通过去除供应肌肉的血管和神经的影响，可在严格控制的外部环境中测定该组织的收缩能力35. 原位 肌力测试可实现对肌肉的单独评估，如同 体外 然而，这些制备过程中神经支配和血液供应保持完整。其优势在于 原位 实验模型的优势在于，它能够在神经支配和血液供应受到最小干扰的情况下，对单个肌肉进行研究36在两者中 体外 和 原位 实验中，可更直接地应用药理学处理，而无需考虑周围组织的影响或循环系统对所测收缩反应的作用。37。然而， 体内 功能测试如本文所述，是在肌肉天然环境中评估其功能的侵入性最小的技术38，并且可以在一段时间内重复进行（即，沿纵向）。因此，它将成为下文讨论的重点。
在这方面，将经皮电极插入目标肌肉附近或其支配神经处，可向肌肉提供电刺激信号。随后，传感器根据预设的定制化软件程序，测量被激活肌肉的长度或力的变化。通过这些数据，可以确定肌肉的物理特性，包括力-频率关系、最大强直收缩力、力-速度关系、刚度、长度-张力关系以及疲劳特性。也可将肌肉长度或力保持恒定，以实现等长或等张收缩。重要的是，这些实验方案可在动物处于麻醉状态下快速完成，易于重复且可灵活定制，实验后动物恢复时间仅需数小时至数天。单只动物可多次接受体内力学测试，从而实现对疾病模型的纵向研究或对治疗平台/技术的评估。
如本文所述，采用商用肌肉杠杆系统结合高功率双相刺激器，通过刺激腓神经来评估大鼠后肢胫骨前肌（tibialis anterior muscle）在足背屈中的作用，从而进行体内肌肉功能测试。我们已开发出一种专门用于评估再生医学/组织工程技术在大鼠胫骨前肌遭受创伤性VML（体积性肌肉缺损）损伤后修复效果的实验方案。需要注意的是，为了特异性地评估胫骨前肌功能，必须将趾长伸肌（EDL）和跟腱（HL）从胫前室中解剖分离（因为在刺激腓神经后测得的总胫骨前肌力矩中，这两者约占15–20%（Corona et al., 2013））。由于该方法可对肌肉生理学/功能进行系统的纵向分析，因此也可为多种其他类型的生理学研究以及各类疾病或治疗领域提供重要的机制性见解39。例如，体内肌肉功能测试适用于运动生理学、缺血/再灌注研究、肌病、神经损伤/神经病变和血管病变、肌肉减少症以及肌营养不良症等研究40。

<table><tbody><tr><td>异氟醚麻醉剂</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>05260-04-04</td><td></td></tr><tr><td>异氟烷蒸发器-漏斗加注型</td><td>Vet Equip</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>蒸发器进气适配器</td><td>Vet Equip</td><td>911124</td><td></td></tr><tr><td>蒸发器出气适配器</td><td>Vet Equip</td><td>911125</td><td></td></tr><tr><td>台式麻醉机</td><td>Vet Equip</td><td>901801</td><td></td></tr><tr><td>压缩氧气气体</td><td>Praxair</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>VaporGuard 活性炭过滤器</td><td>Vet Equip</td><td>931401</td><td></td></tr><tr><td>T/Pump Professional 水加热器</td><td>Stryker</td><td>N/A</td><td>设置为连续治疗模式，温度设定为 38/100</td></tr><tr><td>透透气外科胶带</td><td>3M</td><td>1527S-1</td><td>撕成两半以制成更细的条状</td></tr><tr><td>A5 Golden 动物电推剪</td><td>Oster</td><td>078005-050-002</td><td></td></tr><tr><td>聚维酮碘溶液</td><td>Aplicare</td><td>82-227K</td><td></td></tr><tr><td>酒精棉片</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 proof 乙醇</td><td>Decon labs</td><td></td><td>用去离子水稀释至 70%</td></tr><tr><td>棉签式涂抹棒</td><td>Puritan</td><td>836-WC</td><td></td></tr><tr><td>特氟龙涂层电极-单极针状电极</td><td>Chalgren Enterprises</td><td>111-725-24TP</td><td></td></tr><tr><td>伺服电机</td><td>Cambridge Technology</td><td>Model 6650LR</td><td></td></tr><tr><td>双模式杠杆系统</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 305C-LR-FP</td><td>联系制造商订购</td></tr><tr><td>信号接口</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 604A</td><td></td></tr><tr><td>高功率双相刺激器</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>Model 701C</td><td></td></tr><tr><td>数据分析软件</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>DMAv5.110 software</td><td></td></tr><tr><td>肌肉杠杆系统控制软件</td><td>Aurora Scientific Inc</td><td>DMCv5.400 software</td><td></td></tr></tbody></table>

应用 在体 内 用于评估组织工程骨骼肌修复的大鼠胫骨前肌功能测试

Applications of In Vivo Functional Testing of the Rat Tibialis Anterior for Evaluating Tissue Engineered Skeletal Muscle Repair

尽管骨骼肌具有再生能力，但仍可能出现永久性的功能和/或美容缺陷（例如，由创伤性损伤、疾病以及多种先天性、遗传性和获得性状况导致的体积性肌肉丧失（VML）十分常见。组织工程与再生医学技术在提供治疗方案方面具有巨大潜力。然而，将生物学相关的动物模型与相关功能指标的纵向评估相结合，对于开发改善VML类损伤的再生治疗手段至关重要。在这方面，可使用商用肌肉杠杆系统来测量骨骼肌的长度、张力、力和速度参数。我们结合使用该系统与高功率双相刺激器，以测量 体内 通过刺激大鼠后肢前肌室来评估其在激活后产生的力量。我们此前已利用该设备评估了肌肉体积缺失（VML）损伤对胫骨前肌（TA）功能的影响，以及采用组织工程肌肉修复（TEMR）技术治疗受损TA肌肉后功能恢复的程度。在此类研究中，将麻醉后的大鼠左足牢固固定于连接伺服电机的足板上，并通过两个经皮针电极刺激腓总神经，以诱发肌肉收缩及足部背屈。通过在一系列刺激频率（1–200 Hz）下测量腓总神经刺激所引发的肌肉收缩，确保力量输出达到平台期，从而准确测定最大强直收缩力。除用于评估VML损伤程度及治疗后的功能恢复水平外，该方法还可广泛应用于肌肉生理学与病理生理学多个方面的研究。该技术手段将有助于更系统地推动肌肉修复与再生治疗策略的优化与发展。

强直收缩曲线可用于区分最佳结果与次优结果。该曲线通常在60 Hz频率时开始形成。获得良好结果的关键在于能够有效刺激肌肉，使其产生最大收缩力，并在强直收缩期间维持该力量。理想的曲线应在刺激开始时呈现连续、陡峭的垂直上升，随后为波动极小的平坦平台期，刺激终止时则表现为连续、陡峭的垂直下降。图4）。偏离理想曲线表明肌肉已疲劳（图 5D）或肌肉未受到适当刺激以产生最大力量（图 5B-C）。后者通常是由于电极放置不当，导致刺激期间肌肉纤维无法实现最大程度的募集。一个关键的区分特征是，研究者可通过强直收缩曲线是否完整（完全融合）或不完整（未融合），来判断非理想曲线是由电极放置不当还是肌肉的病理性改变所致。若强直收缩曲线未融合且不完整，则表明电极位置错误，导致肌肉未产生最大收缩。肌肉病理性改变的一个示例表现为与对照组相比，最大收缩力下降，或收缩反应更快出现疲劳。
本实验过程中获得的三种不同类型的峰代表不同的电极和腿部位置，如图3所示。第一类峰约为0.4 N，出现在电极在皮肤表面准确定位时（图3A）。第二组峰的振幅更高，通常在0.5–0.6 N之间（图3B），出现在电极穿入真皮层时。获得这些峰后，需调整腿部和足部位置以最大化力量输出，此时峰振幅可增至约1 N或更高（图3C）。达到此状态后，可关闭Instant Stim并开始实验序列。这些指导原则可确保结果的准确性和可重复性，是整个实验方案中的关键检查点。
最终结果的呈现方式取决于用户从力测试中提取的信息以及实验设计。在本方案中，测量的是在所有刺激频率下产生的最大力，但其他数据点可能对特定研究者或应用具有重要意义。例如，强直收缩曲线开始成形时的刺激频率即为一个关键参数。这些数据可与同一动物先前或后续实验所得结果进行比较，也可用于不同处理组之间的比较。可通过将力输出归一化至体质量来计算等长力，从而更客观地评估年龄对所观察到的最大收缩力的影响。尽管不同体质量和年龄的动物会产生不同的最大力，但在操作正确的情况下，各组之间的强直收缩曲线形状应保持一致。
<img alt="带有数据分析设置的光谱学软件界面；瞬态吸收和发射选项。" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图1：用于分析的杠杆系统控制与数据分析软件概览。（A）启动程序时控制软件的界面概览。（B）“瞬时刺激”参数设置。（C）力-频率刺激的示例序列。（D）分析软件中高通量力-频率分析的代表性数据。需注意，本示例中的序列与数据分析流程仅针对本实验方案，不代表该软件所能提供的全部序列类型与输出结果。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="在加热平台上使用异氟烷麻醉进行实验操作的大鼠外科手术装置。" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2： 大鼠体位及足部在装置中放置的关键要点。（A）大鼠呈仰卧位，左足牢固地固定在足板上。图中圈出了足部、小腿和大腿所形成的角度，均为直角。（B）突出显示踝关节处形成的直角。（C）从足部到躯干，腿部应保持在一条直线平面上。（D）电极的放置方向与腓总神经平面平行且正交。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="显示力和位置图的肌电图数据，描绘随时间变化的信号峰值。" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 代表性峰值展示正确电极放置对最大力量产生的关键作用。（A）电极放置过浅时观察到的基础峰值强直反应。（B）电极置于正确位置时出现更大的峰值。（C）随着腿部和足部位置的优化调整，信号峰值从较大值转变为最佳预序列峰值幅度。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="静力平衡图，包含力、位置随时间变化的分析；动态响应研究结果。" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4：100 Hz 下的最佳强直收缩曲线。 该曲线迅速上升和下降，并具有平坦的平台期。本示例表明电极放置正确且实现了最大力量刺激。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光谱学研究中光学激发分析的瞬态吸收光谱图" src="/files/ftp_upload/54487/54487fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5：在 100 Hz 条件下获得的次优强直收缩曲线的代表性示例。 （A）在舒张后，该曲线低于基线，提示存在拮抗肌的刺激。（B–D）这些图形是电极放置不当和肌纤维募集不均所致。平台期表现出显著振荡（B）、上升趋势（C）或下降趋势（D）。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54487/54487fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

我们描述一种 体内 测量坐骨神经腓肠支刺激后大鼠后肢胫前肌群收缩所引发的足背屈的实验方案。此类测量是评估骨骼肌病理及肌肉修复与再生组织工程技术的不可或缺的转化研究工具。

尽管骨骼肌具有再生能力，但仍可能出现永久性功能和（或）外观缺陷（例如，因……导致的体积性肌肉丧失（VML））

体内肌肉功能检测的目的是准确评估目标肌肉的功能状态，以研究年龄、疾病、损伤及修复性治疗的影响。该方法是多学科研究的关键组成部分，有助于更好地理解在多种情况下骨骼肌修复与再生的时间进程及其相关机制。该技术的主要优势在于，能够在同一动物个体上随时间进行多次肌肉功能测量。这为在优化的生理条件下评估肌肉损伤与恢复提供了一种强有力的实验范式。该技术的应用前景涉及损伤肌肉的治疗，因为对肌肉功能恢复程度的准确评估对于开发和评价促进肌肉再生的新疗法至关重要。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为电极放置位置在不同动物之间存在可变性，而电极位置对于实验的成功至关重要。进行这些实验时，建议使用11周龄的Lewis大鼠。但需注意，肌肉质量与力量之间存在线性相关性，因此应关注大鼠的体型大小。在麻醉大鼠后，彻底去除计划用于实验的腿部从踝关节到骨盆之间外侧的毛发。现在，调整踏板装置的位置。使用两个控制装置将脚踏板调节至仪器允许的最左侧和最低位置。从该位置开始，通过第三个控制装置按需移动整个装置，以实现踏板的适当定位。现在，用碘伏和酒精各更换三次清洁腿部。每次使用碘伏的时间应持续约30秒。接下来，调整动物的位置，使其腿部伸展时，足底能完全接触足踏板。然后，使用医用胶带将足部固定在踏板上。足跟必须紧贴踏板，整个足底保持平直，这一点至关重要。同时，必须确保足部牢固固定。为稳定腿部，使用可调节的固定销将其锁定到位。现在，调整腿部使其与脚踏板平行。首先，使用粗调和微调旋钮缓慢移动踝关节，直至足部与胫骨呈90度位置。然后，继续移动腿部，直至股骨与胫骨呈90度直角。此时，动物已准备好连接电极。在电极控制软件中，点击明确标注的橙色按钮，启动即时刺激。现在，将第一个刺激电极置于髌骨稍外侧且紧邻胫骨外侧的位置，使其与从膝部向外走行的阴部神经平面相邻并呈正交，且与胫骨垂直。持续调整电极在浅层的位置，直至在约 0.4 牛顿时观察到峰电位。然后，将第二个针电极非常浅表地插入胫骨前肌与腓肠肌交界处，仅刚刚进入肌肉层即可。调整位置，直至电极读数接近0.6牛顿时出现峰值。调整到位后，使用 hobby 夹子或医用胶带将电极固定。随后微调装置，以确定腿部的最大输出力。在高功率双相刺激器上找到量程和调节旋钮。首先，调节量程旋钮以获得所需的最大电流强度。最大电流强度是指连续三次或以上的刺激产生相同收缩反应的水平。接下来，转动调节旋钮以调整刺激肌肉所需的范围百分比。进行调节，直至肌肉产生的力读数约为 1.0 牛顿。在继续操作前，请检查电极是否仍然固定牢固。现在在软件中停止即时刺激，然后转到实时数据窗口并点击“开始序列”。通过返回控制界面并点击橙色即时刺激按钮上方的“分析”按钮，继续监测曲线。在60赫兹刺激时，强直收缩曲线应开始呈现成形。强直曲线可用于区分最佳结果与次优结果。该曲线通常在60赫兹左右的频率开始形成，在100赫兹时完全成形，并在高于100赫兹的频率下持续保持完整形态。理想的曲线应在刺激开始时呈现连续、陡峭的垂直上升，随后为波动极小的平坦平台期，并在刺激终止时出现连续、陡峭的垂直下降阶段。获得良好结果的关键在于能够刺激肌肉产生最大力量，并在强直收缩期间维持该力量。与理想曲线相比的正常偏离可能表明肌肉已疲劳。导致曲线不完整的偏离通常是由于电极放置不当，造成刺激期间肌肉纤维未能充分募集，从而引起收缩未达最大。观看本视频后，您应能充分掌握如何专业地进行活体肌肉功能检测，以更好地理解各种损伤和疾病对肌肉功能的影响，并评估潜在修复性治疗的效果。一旦熟练掌握，若操作得当，该技术可在30分钟内完成。在完成该操作后，还可进一步开展组织学分析和基因表达研究等其他方法，以深入理解肌发生过程、肌纤维及基质形成，以及揭示肌肉修复与再生的分子机制。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

中的应用<em&gt;在体内</em&gt;评定组织的鼠胫骨前的功能测试工程化骨骼肌修复

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测量啮齿类动物骨骼肌的收缩功能是一种有用的工具，可用于追踪疾病进展以及评估治疗干预的效果。本文描述了一种非侵入性的、可在活体（in...

小鼠背屈肌功能的非侵入性评估

本方案概述了一种从大鼠骨骼肌中分离纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）和肌源性祖细胞（MPs）的方法。在肌肉损伤模型中使用大鼠可提供更多的萎缩肌肉组织用于分析，并具备更丰富的已验证方法，用于评估自由活动动物的肌肉力量和步态。...

大鼠骨骼肌中纤维脂肪生成祖细胞（FAPs）与肌源性祖细胞（MPs）的鉴定、分离与表征

运动功能恢复的评估仍然是实验性周围神经研究中的基准结局指标。通过测定大鼠胫骨前肌的等长强直收缩力，是评估坐骨神经缺损修复后功能结局的重要工具。本文详细介绍了该方法及其技术细节。...

大鼠胫骨前肌最大等长强直力测定

量化膝伸肌最大肌力对于理解衰老、疾病、损伤及康复过程中的功能适应至关重要。我们提出了一种新方法，用于重复测量体内膝关节伸展的等长峰值强直性扭矩。...

活体小鼠膝伸肌功能的测量

本方案详细描述了评估与解读的简明实验步骤 体内 获得的扭矩数据 通过...

体内测定猪后肢背屈肌的等长力矩

本文详细介绍了如何在啮齿类动物腓肠肌上进行体内（使用表面电极和针式电极阵列）和离体（使用介电细胞）的电阻抗肌图检测。文章将在小鼠和大鼠中演示该技术，并详细说明可采用的各种改进方法（例如，用于肥胖动物、幼鼠）。...

执行 在体 内 和 离体 啮齿类动物的电阻抗肌电图

本方案提供了生成三维工程化心肌和骨骼肌组织的方法，并描述了其在临床前药物筛选中的应用。所述方法利用磁感应系统，可同时平行评估24个组织。...

可扩展的三维工程化肌肉组织中的临床前药物测试

体积性肌肉丧失（VML）损伤超出了机体自身的再生能力，导致永久性功能缺损。目前的 VML 研究主要集中在四肢和躯干肌肉。为了将 VML 的机制研究扩展到颅面肌肉，本文描述了一种用于在 VML 损伤前后对咬肌功能进行纵向评估的 in vivo...

大鼠咀嚼肌在容积性肌肉缺损失伤（VML）手术构建后的体内功能评估

本文介绍了一种用于安装和制备肌内电极的方案，以及一种可安装在动物身上、微型化的肌电图（EMG）测量装置，适用于运动研究中的EMG分析。该系统能够无线传输实时EMG数据，用于研究脑卒中模型大鼠的运动功能恢复。...

一种用于小型动物的实时可穿戴肌电测量系统

了解大鼠胫骨前肌体内功能测试方法，通过腓神经刺激测量足背屈以评估肌肉病理状态。该技术为组织工程修复策略提供可靠的实验范式，助力肌肉再生医学研究。

应用在体内用于评估组织工程骨骼肌修复的大鼠胫骨前肌功能测试

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