Name: 斑马鱼胚胎的倍性操作与热休克治疗2 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: 学习利用热休克处理斑马鱼胚胎以诱导细胞分裂停滞，从而实现二倍体化并促进遗传学研究。该方法操作简便，适用于基因功能鉴定及近交系构建。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，资助项目编号为 R21 HD068949-01 和 RO1 GM065303。

所有动物实验均按照威斯康星大学麦迪逊分校及机构动物护理与使用委员会（IACUC）的指南进行（威斯康星大学麦迪逊分校认证编号 A3368-01）。
1. 通过中断交配选择雌性进行卵收集
注意：基于体外受精（IVF）的实验方案依赖于通过手动施压使雌鱼排出成熟卵子9。以往的方案直接使用来自养殖缸中的雌鱼或进行配对交配的雌鱼，而未观察其是否表现出排卵行为，但这些雌鱼中仅有少数（约20%或更低，具体比例取决于斑马鱼品系）在手动施压后能够排出具有发育能力的卵子。在改进的操作流程中，首先通过直接视觉观察对具有产卵行为的雌鱼进行预筛选，随后立即中断交配过程。该方法效果显著，因为几乎所有经过此中断交配步骤预选的雌鱼，在手动施压后均能排出具有发育能力的卵子。
<ol>
	<li>实验前一天下午，将所需斑马鱼品系的配对亲鱼放入标准斑马鱼交配盒中。使雄鱼与雌鱼处于同一腔室，但通过交配盒隔板或在产卵插件下方放置雄鱼、在插件内部放置雌鱼的方式，实现物理隔离。</li>
	<li>实验当天早晨，移除物理隔板，将雄鱼和雌鱼一同放入同一产卵插件中，以启动交配过程。</li>
	<li>目视检查含有配对亲鱼的鱼缸，观察自然交配过程中是否有产卵行为。一旦发现产卵迹象，立即分离雄鱼和雌鱼以中断繁殖。与雄鱼分离后，将预先选定的雌鱼单独饲养或合并置于同一鱼缸中。根据所需胚胎数量使用多条雌鱼（通常每条雌鱼可获得 50–150 枚卵）。</li>
</ol>
2. 精子溶液的制备
注意：体外受精（IVF）依赖于将成熟卵子暴露于精子溶液中。该溶液可以未经处理，以产生二倍体合子（经HS2处理后成为四倍体胚胎），或经紫外线（UV）处理，以产生单倍体合子（经HS2处理后成为纯合二倍体胚胎）。先前的精子制备方案建议使用毛细管从活体雄鱼肛门区域采集精液，但该方法效果不佳，因为仅有少数雄鱼能够成功排出精液9。以下所述方案则改用剪碎并解剖的睾丸组织进行精子制备，可获得更可靠的结果。
<ol>
	<li>提前配制汉克氏溶液的预混液，包含除碳酸氢钠溶液（溶液6）外的所有组分（溶液1、2、4和5）。实验当天早晨新鲜配制溶液6，并将其加入预混液中。表1）。为配制Hanks液（最终溶液，于体外受精实验当天早晨配制），将990 µl Hank's Premix与10 µl 新鲜配制的Solution 6混合。</li>
	<li>通过将三卡因以0.016%溶液形式溶于条件化水中进行过量暴露，处死雄性个体。
	<ol>
		<li>配制0.2%的三卡因储备液：将三卡因溶于水中，并用1 M Tris（pH 9.0）缓冲至pH 7.0，4 °C保存。在烧杯中每100 ml水中加入8 ml三卡因储备液，用网将雄鱼转移至三卡因溶液中。</li>
		<li>每窝需要受精的雄性个体，取其等效睾丸组织，置于与每只雄性对应的100 µl Hank's溶液中例如 10只雄性的睾丸置于1 ml Hank's溶液中收集，用于使10窝卵受精，每窝使用100 µl。</li>
		<li>通过观察鳃部运动停止15分钟确认安乐死。安乐死后，用勺子将雄鱼从烧杯中取出。用预处理水短暂冲洗雄鱼，并将其短暂放置在纸巾的不同位置上轻轻吸干。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为去除睾丸，首先使用解剖剪或剃须刀片将已处死的雄性个体断头，然后用解剖剪沿腹部做纵向切口。在配有反射光源的解剖显微镜下，用解剖镊去除内部器官。用镊子取出每一块睾丸组织，并将其放入含有Hank's溶液的微量离心管中。 
	注意：睾丸可被识别为沿体壁两侧分布的两个细长、半透明结构，在泄殖腔附近汇聚。解剖后，睾丸可在培养皿表面放置2-3分钟，再移入Hank's溶液中。</li>
	<li>用窄 spatula 剪切睾丸，和/或使用 1,000 µl 吸头移液器在溶液中轻轻吹打睾丸 5–6 次，使精子释放到溶液中，注意避免产生气泡。静置，使睾丸碎片沉淀。</li>
	<li>将精子溶液置于冰上保存，其活性可维持2-3小时。若需进行精子溶液的紫外照射处理，应将溶液转移至洁净的微量离心管中，弃去睾丸组织碎片。</li>
</ol>
3. 紫外线处理
注意：紫外线（UV）处理用于交联精子DNA，使其在胚胎中失活。此步骤仅在制备雌核发育单倍体或纯合雌核发育二倍体胚胎时使用。用于UV处理的精子溶液应去除睾丸组织碎片（步骤2.4），因为较大的组织碎片可能遮挡精子，影响UV处理效果。
<ol>
	<li>将精子溶液转移至置于冰浴上的洁净干燥凹玻片孔中（例如 培养皿中的冰块）。每个玻璃板孔使用最多1 ml的精子溶液。</li>
	<li>将凹面载玻片置于冰床上并放置在紫外灯下，使精子溶液暴露于紫外线下。使用115 V（60 Hz，0.68 A）的紫外灯，在19 cm（7.5英寸）距离下处理精子溶液90秒。在紫外线处理期间，每隔30秒用移液器吸头末端轻轻混匀溶液（每30秒更换一次新的无菌移液器吸头）。</li>
	<li>使用干净的移液枪头和微量移液器，将处理后的精子溶液转移至新的微量离心管中。置于冰上保存，待体外受精（IVF）时使用（从提取后不超过2-3小时）。</li>
</ol>
4. 成熟卵子的手动挤出
注意：通过中断自然交配获得的雌性个体在麻醉和手动施压条件下可轻松获取卵子。在此操作过程中，应严格控制三卡因（tricaine）处理时间，避免过度暴露导致雌性个体无法恢复。
<ol>
	<li>通过短暂暴露于三卡因溶液中麻醉雌鱼：用网将雌鱼转移至含三卡因的条件化水中（将8 ml 0.2%三卡因储备液加入100 ml条件化鱼水中制得），持续约2–5分钟，直至鱼停止鳃部运动。</li>
	<li>一旦雌鱼停止鳃部运动，立即用勺子将其捞出，并在条件化水中短暂冲洗。仍用勺子转移鱼体，将其在纸巾多个位置上短暂反复轻压，以轻微吸干水分，随后转移至洁净干燥的直径10 cm培养皿中。操作时应从鱼体头部向尾部方向接近，避免可能损伤鳃盖。</li>
	<li>使用实验室擦拭纸或柔软纸巾轻轻擦干肛鳍区域，防止释放的卵子因接触水而提前激活。将手指轻微沾湿（以防粘附鱼鳞），用一只手的一根手指按住雌鱼背部以固定，另一只手用手指沿雌鱼腹部轻轻施压，直至排出卵子。</li>
	<li>使用窄 spatula 将卵子从雌鱼体旁移开。将雌鱼放回含有条件化水的水族箱中恢复。 
	注意：当雌鱼侧卧并排出卵子后，可将其翻转至另一侧重复操作以获取更多卵子。为确保雌鱼完全恢复，仅可对腹部施加轻柔的手动压力，并确保从停止鳃部运动到放回水中的整个过程在2分钟内完成。</li>
	<li>在排卵后90秒内同时进行卵子激活（通过接触水）和受精（加入精子溶液）（见第5节）。</li>
</ol>
5. 体外 受精
注意：斑马鱼在自然交配中的受精为体外受精，依赖于交配过程中卵子和精子同时释放并接触水后被激活。体外受精通过将卵子暴露于含有精子的溶液中并加水来模拟这一过程。初始加水量较少（1 ml），以提高有效精子浓度。精子与卵子的结合在15–20秒内发生10，随后可增加水量。卵膜抬升进一步限制了精子结合能力的时间窗口，从而促进整批胚胎的紧密同步11,12。因此，所得胚胎在早期卵裂阶段表现出基本同步的细胞分裂周期。
<ol>
	<li>向培养皿中的挤出卵团中加入 100 µl 精子溶液（相当于一只雄鱼的精巢含量——见第 2 部分）。用移液枪头轻轻搅动卵团，使精子与卵子充分混合，注意搅动时枪头不要离开培养皿表面，以免损伤卵子。</li>
	<li>立即加入 1 ml 胚胎培养液（E3 溶液）以激活卵子（在第 5 至第 7 部分中，条件化水也可作为 E3 的替代品），再次用移液枪头轻轻搅动以混合精子和卵子。启动计时器，以受精时刻为计时起点。</li>
	<li>在受精后 1 分钟（mpf）且保持 1 ml 体积的条件下，向培养皿中加满 E3 溶液。在继续后续操作前，将培养皿静置至受精后 10–12 分钟（mpf），以确保卵子充分激活，包括卵膜完全扩张。</li>
</ol>
6. 热激处理
注意：在早期胚胎中施加热激可抑制中心粒复制，导致中心粒数量不完整，从而在后续细胞周期中无法驱动纺锤体形成2。纺锤体的缺失进而导致分裂沟无法形成13。
<ol>
	<li>在绒毛膜扩张后（10-12 小时后受精），将胚胎从培养皿倒入茶筛中。使用装有 E3 培养基的洗瓶冲洗培养皿，以收集残留于茶筛中的任何剩余胚胎。</li>
	<li>将装有胚胎的茶筛放入盛有 E3 培养基的烧杯中，并置于预热至 28.5 °C 的水浴中。预先使烧杯和 E3 培养基与水浴温度平衡，并确保有足够的 E3 培养基，使茶筛中的所有胚胎均暴露于培养液中。</li>
	<li>在 22 小时后受精时，将茶筛从 28.5 °C 水浴中取出，短暂地在纸巾上轻压以去除多余液体，然后将其转移至另一个同样预热、盛有 E3 培养基的烧杯中，并置于 41.4 °C 的恒温水浴中。</li>
	<li>在 24 小时后受精时，经短暂吸干后，将茶筛重新转移回 28.5 °C 水浴中的 E3 培养基烧杯内。在 29 小时后受精时，使用装有 E3 培养基的洗瓶将胚胎从茶筛转移至一个 10 cm 的培养皿中。</li>
</ol>
7. 筛选经历一次细胞周期胞质分裂停滞的胚胎
<ol>
	<li>在受精后35-45分钟（mpf）期间，在解剖显微镜下使用透射光源，挑选出正在进行对称卵裂并进入2细胞期的胚胎，这些胚胎即为已受精的胚胎。移除未发生细胞卵裂的胚胎。</li>
	<li>继续观察在第一次细胞周期中表现出正常细胞分裂、并在第二次细胞周期（50-65 mpf）期间被选中的已受精胚胎。</li>
	<li>根据以下类别对胚胎进行分类（图2C）：4细胞（&#34;无停滞&#34;，即呈标准的2:2排列方式的4细胞胚胎）；3细胞（&#34;部分停滞&#34;，表现为异常的2个小细胞:1个大细胞排列）；以及2细胞（&#34;完全停滞&#34;，即在第二次细胞周期中两个卵裂球均发生细胞周期停滞，呈现与2细胞胚胎相同的1:1排列）。将完全停滞的胚胎分选至新的培养皿中。 
	注意：在此阶段，呈2:2排列的胚胎表示在第二次细胞周期中两个卵裂球均未发生细胞分裂停滞；呈异常的2个小细胞:1个大细胞排列的胚胎表示热激导致其中一个卵裂球在第二次细胞周期中发生细胞周期停滞，而另一个未停滞；而呈1:1排列的&#34;停滞&#34;胚胎则表示在第二次细胞周期中两个卵裂球均发生了预期的细胞分裂停滞。停滞的胚胎应在随后的细胞周期（65-80 mpf）中恢复细胞卵裂。由于前一细胞周期提供的纺锤体稳定信号不完全，卵裂球的排列可能有所变化2,14，但大多数胚胎将形成相对正常的囊胚，并能进行正常发育。</li>
	<li>将胚胎置于培养皿中继续发育，每10 cm培养皿中胚胎数量不超过80个。在受精后24小时（hpf）观察胚胎，判断其是否具有二倍体或纯合二倍体胚胎的正常形态特征6（即体轴伸展程度正常（图3A、3C）），与单倍体胚胎典型的体轴缩短和躯干增厚形成对比（图3B）；和/或在36 hpf时利用遗传性色素标记（如golden或albino）及其他相关检测方法评估二倍化情况（图3及下文）2,6,9。</li>
	<li>移除表现出单倍体形态、已裂解或存在其他明显异常缺陷的胚胎。 
	注意：如有需要，可让胚胎继续发育至受精后5天，期间每日持续移除裂解或明显异常的胚胎，并添加新鲜E3培养基以更新环境。注意：存活的胚胎在第5天鳔充气后，可通过转移至孵化系统并在标准条件下喂养继续培养。</li>
</ol>

<ol><li>Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+clones+of+homozygous+diploid+zebra+fish+%28Brachydanio+rerio%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio).</a> Nature. 291, 293-296 (1981).</li>
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</ol>

作者没有竞争性财务利益。

关键步骤
必须在有效的体外受精条件下进行操作。为了确保获得充足的成熟卵子（步骤1），用于交配的雌鱼至少应在5天内未参与过交配实验，并且应呈现明显的怀卵状态。在暂停交配期间，观察者可充分监控15至30个鱼缸，以及时发现自然排卵的首次出现。一旦通过自然交配首次观察到卵子释放，应尽快中断交配过程，以便尽可能多的卵子保留在雌鱼体内，用于后续体外受精操作。这些已准备好进行人工挤卵的雌鱼，可在分离状态下保存最多2小时，而不会明显影响后续卵子的释放。为制备高效的精子溶液（步骤2），雄鱼应体态健壮，理想情况下具有红润色泽，这是繁殖期斑马鱼雄鱼的典型特征。干净的解剖操作通常包括将肠道向身体后方牵拉以移除，以及将鳔向前方牵拉以去除。在移除中央内脏器官后，睾丸将以透明细长的组织团块形式保留在体腔内壁两侧。应避免将不需要的器官（例如肠道）混入精子溶液中；如有需要，可在将其放入Hank's溶液前，在干燥的培养皿表面进行分离操作。为了在体外受精过程中获得较高的受精率（步骤4），关键在于挤出的卵子在加入精子前必须保持其受精能力。具有受精能力的卵子呈轻微黄色，且透明。在加入精子前，应避免卵子接触任何水...

本方案可用于操控斑马鱼胚胎的倍性，例如由雌核发育单倍体生成雌核发育纯合二倍体（图1），或产生四倍体。该操作通过诱导胞质分裂延迟一个精确的细胞周期来实现（图2A、2B）。这一关键的单周期胞质分裂延迟通过热激处理实现。最初由Streisinger及其同事描述的标准热激（HS）方案，是在受精后13-15分钟（mpf）期间施加一次温度脉冲，从而在第一个细胞周期中导致一次单细胞周期的细胞分裂停滞1。近期，通过在早期细胞周期中采用滑动时间窗方式进行热激处理扫描，该方案的效率得到了显著提升。该扫描发现了一个更晚的热激时间点（仍处于第一个细胞周期内，即22-24 mpf），可使发生单周期细胞分裂停滞的胚胎比例更高，而在此情况下，受影响的是第二个细胞周期2。已有研究报道，在第一个细胞周期内进行实验操作会干扰第二个细胞周期的细胞分裂，并导致DNA含量加倍，这一现象也在其他鱼类物种中被观察到3,4。我们将这种改进后的方案称为热激2（HS2——术语&#34;2&#34;表明热脉冲发生的时间点晚于标准HS方法，且HS2引起的细胞周期延迟发生在第二个细胞周期）。这些研究表明，热激后发生胞质分裂阻滞的基础是在热激期间中心粒复制受到抑制，从而影响下一个细胞周期中的纺锤体形成和分裂沟诱导。HS2可实现接近100%的细胞周期阻滞率，其倍性加倍效率最高可达标准HS方法的4倍2。
在卵裂球细胞周期期间接受热激处理的胚胎会表现出多种有害效应，表明热激会影响细胞分裂所需的多个过程2。另一方面，如果在细胞周期启动之前（受精后0-30分钟）施加热激，则其效应似乎与特异性干扰中心粒复制一致，且似乎不影响其他必需的细胞过程2。这些研究表明，在卵裂球分裂启动之前的时间段似乎是一个适合利用热激作为工具的发育窗口，可通过抑制中心粒实现对倍性的特异性操控。热激对中心粒复制表现出选择性作用的具体机制尚不清楚，但可能与在热应激条件下某些细胞类型（如白细胞）中观察到的中心体亚结构的选择性降解有关5。
通过体外受精（IVF）可实现胚胎发育的时间同步。在受精过程中使用未经处理的精子，会产生二倍体胚胎，这些胚胎在HS2诱导的一次细胞质分裂阻滞之后转变为四倍体。而使用经紫外线（UV）处理的精子（其DNA因交联而失活）则会产生雌核发育的单倍体胚胎6，这些胚胎在HSII诱导的一次细胞质分裂阻滞后转变为雌核发育的二倍体2。由于发生了全基因组加倍，后者即雌核发育的二倍体在基因组中每一个位点均为纯合状态。为简洁起见，我们将雌核发育的单倍体胚胎称为&#34;单倍体&#34;，将纯合的雌核发育二倍体胚胎称为&#34;纯合二倍体&#34;。若纯合二倍体具有活力且可育，则可用于建立无菌性和致死性缺陷的品系。由HS2直接诱导产生的纯合性也可便捷地应用于遗传分析或遗传筛选，因为来自携带突变的杂合雌性的纯合二倍体，在纯合位点上的比例高且固定（50%）2。
以下方案描述了执行HS2并诱导产生完全纯合的多倍体的操作步骤。在制备四倍体时，精子溶液应不进行处理；而在制备纯合二倍体时，精子需通过紫外线（UV）处理使其失活。此外，如讨论部分所述，可利用可见的色素标记辅助鉴定纯合二倍体个体。斑马鱼主要在光照周期开始后的前3小时内交配7，且成鱼与卵均对昼夜节律敏感8，因此为获得最佳结果，体外受精（IVF）操作应在此时间段内进行。

<table><tbody><tr><td>斑马鱼交配盒</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>三卡因</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>经 FDA 批准（ANADA 200-226）</td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>用于配制 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>用于配制 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>细网鱼网（4-5 英寸）</td><td>PennPlax</td><td>（ThatFishThatPlace # 212370）</td><td>可在 ThatFishThatPlace 购买</td></tr><tr><td>塑料勺</td><td></td><td></td><td>大多数普通商店均有售</td></tr><tr><td>解剖剪刀</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>解剖镊</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>可从 Fine Science Tools 购买</td></tr><tr><td>体视显微镜（带透射光源）</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>反射光源（LED 臂）</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>或同等产品</td></tr><tr><td>直径 10 cm 的培养皿</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>冰桶</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>Pipetteman P-1000</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;l 移液器吸头</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>窄刮刀</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>凹面玻璃载片</td><td>Corning Inc</td><td>722085（Fisher 货号 13-748B）</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>紫外灯</td><td>UVP</td><td>型号 XX-15（货号 UVP18006201）</td><td>可从 Fisher Scientific 购买。尽管我们使用此型号未观察到该现象，但某些紫外光源随时间推移可能出现强度下降（若出现此情况，请参见“修改与故障排除”部分）</td></tr><tr><td>紫外防护眼镜</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>纸巾</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>Kimwipes 擦镜纸</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>计时秒表</td><td></td><td></td><td>任意厂家</td></tr><tr><td>洗瓶</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>茶滤器</td><td></td><td></td><td>厨房用品商店有售</td></tr><tr><td>250 ml 烧杯（2 个）</td><td>Corning Inc.</td><td>1000250</td><td>可从 Fisher Scientific 购买</td></tr><tr><td>水浴锅（2 个）</td><td></td><td></td><td>任意厂家，精度达 0.1 °C（&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt; Shel Lab H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 浴系列）</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 溶液 1</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td>8.0 g NaCl，0.4 g KCl 溶于 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中。4&amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 溶液 2</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td>0.358 g 无水 Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，0.6 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 溶于 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中。4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 溶液 4</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td>0.72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 溶于 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中。4 &amp;deg;C 保存。</td></tr><tr><td>Hank's 预混液</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td>按以下顺序加入：10.0 ml 溶液 1；&amp;nbsp;1.0 ml 溶液 2；&amp;nbsp;1.0 ml 溶液 4；&amp;nbsp;86.0 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O；&amp;nbsp;1.0 ml 溶液 5。4 &amp;deg;C 保存</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; 溶液 6</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td>0.33 g NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶于 10 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 中。体外受精实验当天早晨新鲜配制。</td></tr><tr><td>Hank's 溶液（终溶液）</td><td>见上文</td><td>见上文</td><td>将 990 &amp;mu;l Hank&amp;rsquo;s 预混液与 10 &amp;mu;l 新鲜配制的溶液 6（NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 溶液）混合</td></tr></tbody></table>

通过热休克2处理对斑马鱼胚胎进行倍性操作

Ploidy Manipulation of Zebrafish Embryos with Heat Shock 2 Treatment

染色体倍性的操控可实现多种有用的转化，例如将二倍体转化为四倍体，或单倍体转化为二倍体。在斑马鱼中 Danio rerio，特别是通过单个杂合母本直接产生纯合雌核发育二倍体，在遗传分析中具有重要价值。本文介绍了一种基于首次细胞周期中热激处理（Heat Shock 2, HS2）的染色体倍性加倍的改良方案。该方法通过抑制中心粒的复制，导致胚胎在第二次细胞周期中发生精确的细胞分裂停滞。这种精确的单周期分裂阻滞，结合正常进行的DNA复制，最终实现全基因组的加倍。与此方法相关的实验步骤包括卵子和精子的采集、精子的紫外线（UV）处理， 体外 受精后施加热激以导致细胞周期延迟一个周期，从而实现倍性加倍。该方案的改良版本可应用于诱导其他动物物种的倍性变化。

尽管在单个细胞周期中发生胞质分裂停滞，但此类胚胎中的DNA复制仍正常进行，导致胚胎的DNA含量加倍（图1）。Streisinger热激方案（标准HS）是在受精后13-15分钟（mpf）期间施加一次热脉冲，主要诱导在35 mpf时发生第一次胚胎细胞分裂期间的胞质分裂阻滞1,2；而本文所述的衍生方法，称为热激2（HS2），则在22-24 mpf期间进行热激处理，诱导在50 mpf时发生第二次胚胎细胞分裂期间的胞质分裂阻滞（图2；2,3,4）。在24 hpf时观察胚胎，可判断其是否具有二倍体或纯合二倍体胚胎典型的正常形态，或具有单倍体胚胎典型的较短且较宽的体轴形态（图3）6。若正确实现了一个细胞周期的延迟，所有胚胎均应表现出正常的二倍体形态。此外，在无有害突变的情况下，纯合二倍体胚胎具有活力，而单倍体胚胎则在发育2-3天后 invariably 出现致死现象。使用未经筛选的混合AB/图宾根遗传背景品系，通过HS2...

一种改良的倍性操作方案利用热激在早期胚胎的胞质分裂过程中诱导一个细胞周期的停滞。该方案以斑马鱼为例进行演示，但可能适用于其他物种。

染色体倍性的操作可实现多种有用的转化，例如将二倍体转化为四倍体，或将单倍体转化为二倍体。在斑马鱼 Danio rerio 中，……

本实验的主要目标是通过抑制对应于一个胚胎细胞周期的胞质分裂，促进早期斑马鱼胚胎的二倍体化。该方法有助于回答遗传学领域的一些关键问题，例如通过鉴定与成体或生殖性状相关的基因、创建近交品系或其他遗传操作。该技术的主要优势在于其操作简便且效果显著，能够实现单个杂合个体中等位基因的直接纯合化。实验前一天下午，将所需品系的斑马鱼配对放入标准的斑马鱼交配盒中，并使用隔板将雄鱼和雌鱼分开。实验当天早晨，移除物理隔板以开始产卵。通过肉眼观察含有交配对的水箱，检测自然交配过程中是否有卵排出。一旦观察到产卵的最初迹象，立即将雄鱼和雌鱼分隔开，以终止繁殖行为。将预先挑选的雌鱼单独饲养或集中于同一水族箱中。根据所需胚胎数量，使用多条雌鱼。为了从斑马鱼精巢制备精子悬液，根据文本方案确认安乐死后，将雄鱼从烧杯中取出。用预平衡水短暂冲洗，并通过将其短暂放置在纸巾的不同位置轻轻吸干。使用解剖剪刀或剃须刀片将鱼体去头，并沿腹部做纵向切口。然后在带有反射光源的解剖显微镜下，使用解剖镊去除内部器官。取出每侧睾丸组织，并将其转移至含有 Hank 溶液的微量离心管中。为使精子释放到溶液中，可用窄 spatula 剪切睾丸组织，或使用 1,000 微升枪头在溶液中上下吹打 5 至 6 次，注意避免产生气泡。然后让睾丸碎片自然沉降。将精子溶液置于冰上保存，其活性可维持两到三小时。若需进行紫外线精子处理，将精子溶液转移至干净的微量离心管中，留下精子碎片。为进行精子的紫外线处理，将最多一毫升的精子溶液转移至置于冰床上的洁净干燥凹玻片孔中。将装有凹玻片的冰床置于紫外灯下，使光源与样品距离为19厘米，以115伏电压处理精子溶液90秒。在紫外线处理期间，每隔30秒，使用未使用过的移液器吸头末端轻轻混匀溶液。使用移液器上的洁净吸头，将处理后的精子溶液转移至新的微量离心管中。置于冰上保存，直至进行体外受精（IVF）前使用，保存时间不超过两到三小时。根据文本方案对雌性斑马鱼进行麻醉后，一旦鱼体停止鳃部运动，立即用勺子捞出鱼体，并用预处理过的水短暂冲洗。用勺子从鱼体前部向后部移动，以避免损伤鳃盖，将鱼短暂且反复地放置在纸巾的不同位置，轻轻吸干表面水分。随后将其转移至一个洁净的直径10厘米的培养皿中。使用实验室擦拭纸或柔软纸巾进一步轻柔擦干肛鳍区域，防止释放的卵因接触水分而过早激活。然后用清水将手指轻轻润湿，将一只手的一根手指放在雌鱼背部作为支撑，用另一只手的手指沿雌鱼腹部轻轻施压，直至排出卵子。排出的卵子必须避免接触过多水分，以防卵子过早激活，从而影响其与精子结合受精。使用窄 spatula 将卵子从雌鱼体外移开。然后将雌鱼放回盛有预处理水的水族箱中以恢复。在挤卵后90秒内，向培养皿中的挤出卵液中加入100微升精子溶液。轻轻晃动移液器枪头使精子与卵子充分混合，注意枪头不要离开培养皿表面，以免损伤卵子。立即加入约一毫升的胚

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Research

科研

JoVE Journal

Developmental Biology

发育生物学

斑马鱼胚胎的倍性操作与热休克治疗2

本方法通过使用经紫外线灭活的精子进行受精后立即阻断第二次减数分裂，从而产生雌核发育的二倍体斑马鱼胚胎（即胚胎的全部遗传物质仅来自母本）。由于第一次减数分裂过程中发生了重组，EP胚胎并非完全纯合，但在所有未因重组而与着丝粒分离的位点上均为纯合状态。...

通过早期加压法制作雌核发育二倍体斑马鱼

本文报道了一种用于检测活体斑马鱼胚胎氧化应激的实验方案。该方法可实现对整个胚胎组织及单细胞群体中活性氧（ROS）的检测。本方案可同时完成定性与定量分析。...

斑马鱼胚胎中氧化应激的分析

斑马鱼因其与高等脊椎动物具有较高的遗传相似性，已成为发育生物学和人类疾病研究中强有力的研究模型系统。本实验方案描述了一种制备单倍体斑马鱼胚胎的方法，可用于正向筛选策略，以鉴定在早期胚胎发育过程中起关键作用的基因中的隐性突变。...

通过单倍体胚胎生产斑马鱼单倍体胚胎 体外 受精作用

本方案详细介绍了如何制备具有不同遗传背景的嵌合型斑马鱼胚胎。结合斑马鱼胚胎无与伦比的成像能力，该方法为研究目的基因的细胞自主性与非细胞自主性功能提供了极为强大的手段。...

通过手术融合发育中的囊胚生成连体斑马鱼胚胎

使用斑马鱼进行DNA复制时间分析 在体 内 模型系统

活体成像是一种强大的工具，可用于研究神经系统发育背后的细胞机制。本文介绍了一种利用延时共聚焦显微镜实时观察斑马鱼发育过程中大量多色Brainbow标记细胞的技术。...

利用Brainbow技术和活体斑马鱼延时共聚焦成像可视化大脑发育过程

本文介绍了一种在完整斑马鱼胚胎中对正常和异常胞嘧啶甲基化进行快速、高效时空监测的实验方案。...

完整斑马鱼胚胎中正常与异常胞嘧啶甲基化的快速高效时空监测

本研究描述了一种模块化Tol2转基因系统方案，该方法基于Gateway克隆技术，用于构建转基因载体并将其注射到斑马鱼胚胎中。...

斑马鱼 Tol2 系统：一种基于 Gateway 的模块化与可变转基因方法

本方案描述了如何在无PAM限制的情况下进行高效的腺嘌呤碱基编辑，以利用zSpRY-ABE8e构建精确的斑马鱼疾病模型。...

利用zSpRY-ABE8e实现高效无PAM限制的碱基编辑以构建斑马鱼人类遗传病模型

本文介绍了一种通过将稳定的zpc:cas9基因敲入品系与Tol2介导的sgRNA表达盒递送相结合，以产生母源突变体的实验方案。...

利用zpc:cas9基因敲入斑马鱼产生母源突变体

学习利用热休克处理斑马鱼胚胎以诱导细胞分裂停滞，从而实现二倍体化并促进遗传学研究。该方法操作简便，适用于基因功能鉴定及近交系构建。

通过热休克2处理对斑马鱼胚胎进行倍性操作

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