对于检测到的敏感性和特异性显色琼脂培养基发展副溶血性弧菌及其他弧菌物种
November 8th, 2016
检测和分离临床相关的弧菌种类需要选择性和差异性培养基。本研究评估了一种新的显色培养基检测和鉴定副溶血性弧菌和其他相关物种的能力。发现新培养基比传统培养基具有更好的敏感性和特异性。
该程序的总体目标是评估与传统培养基相比，新型显色培养基检测和分离副溶血性弧菌能力的敏感性和特异性。这种方法可以帮助回答食品和环境微生物学领域的关键问题，例如弧菌物种在食品和收获环境中的普遍程度是多少？我们程序的主要优点是可以使用许多细菌分离物，包括在存在食物基质的情况下。
在培养细菌之前，对所有琼脂培养基进行高压灭菌。然后在水浴中将琼脂冷却至 45 至 50 摄氏度。琼脂准备好后，将空培养皿排列成五到六个板的堆栈。
然后，从堆栈底部开始，将熔融的琼脂倒入每个盘子中，直到大约半满，倒入后盖上盖子。让琼脂在室温下凝固至少 12 小时。为了设置微生物菌株培养物，当琼脂准备好时，使用无菌接种环将培养物转移到适当的非选择性琼脂平板上，以允许观察分离菌落的模式划线细菌。
当所有菌落都铺板后，将培养物在 35 至 37 摄氏度下倒置孵育长达 48 小时，弯曲杆菌属除外，它应该在装有气袋的密闭盖罐中孵育，以产生微需氧环境。观察孵育结束时的菌落形态。纯培养物应产生表现出相似菌落形态的菌落。
为了在选择性和差异培养基上生长出目标菌落，将一些分离的菌落转移到 5 mL 的适当肉汤中，并在 35 至 37 摄氏度下重新孵育培养物 16 至 24 小时。第二天，将一环过夜培养物划线到至少一个硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖或 TCBS、琼脂平板和至少一个显色琼脂平板上，在 35 至 37 摄氏度下孵育长达 96 小时。在孵育结束时，检查板上的培养密度和分离菌落的大小，以确定菌株的整体生长，酌情记录环境光或紫外线下菌落的颜色，并注意菌落的任何其他重要特征。
要进行回收率测定，将副溶血性弧菌的年轻培养物接种在 5 毫升补充有 2% 氯化钠或 TSBS 的胰蛋白酶大豆肉汤中，并将试管置于 35 至 37 摄氏度下 16 至 24 小时。第二天，涡旋过夜培养物并设置 1 乘以 10 至负 1，至 10 乘以 10 至负 7 的 PBS 细菌稀释液。使用 1 乘以 10 比 4 乘以 10 比 10 比负 7 的稀释液，将 100 微升每种稀释液均匀接种到补充有 2% 氯化钠琼脂或 TSAS 的单个显色、TCBS 和胰蛋白酶大豆琼脂平板上。
将所有板在 35 至 37 摄氏度下孵育长达 96 小时。然后对菌落进行计数，忽略菌落数量过多而无法计数或菌落少于 25 个的板。要进行竞争测定，请选择一种副溶血性弧菌菌株，该菌株在 TCBS 上产生预期的 turqouise 菌落，在显色琼脂上产生青色菌落，以及非 V.
副溶血菌属，不在两种介质上生长或表现出不同的菌落颜色。将一些分离的副溶血性弧菌和梅氏尼科维弧菌菌落从 TSAS 农业转移到 5 毫升 TSBS 中，在 35 至 37 摄氏度下孵育 16 至 24 小时。将一些分离的宋内志贺氏菌菌落从脑心输液 （BHI） 琼脂转移到 5 毫升 BHI 肉汤中，在 35 至 37 摄氏度下转移 16 至 24 小时。
第二天，对每种菌株进行连续稀释，将稀释液接种到非选择性琼脂平板上，以确定每毫升过夜培养物的菌落形成单位。接下来，使用过夜培养物和稀释管混合不同体积的副溶血性弧菌菌株和非溶血弧菌菌株。副溶血性菌属，并将 100 微升细菌混合物散布到单个显色、TCBS 和 TSAS 琼脂平板上。
在 35 至 37 摄氏度下放置长达 96 小时后，根据菌落在显色板和 TCBS 板上的生长和形态差异对菌落进行计数。为了评估牡蛎匀浆对选择性和差异培养基上细菌生长的影响，首先称量至少 50 克来自至少 12 种软体动物贝类的牡蛎肉，包括肉和液体。然后将等质量的 PBS 加入牡蛎组织中，高速混合混合物 90 秒。
接下来，将 100 克稀释的牡蛎匀浆加入 400 克 PBS 中，并将混合物高速混合一分钟。然后高压灭菌匀浆。冷却后，添加 100 μL 各过夜的副溶血性弧菌和非溶血弧菌。
对牡蛎浆液进行副溶血性培养，并使用匀浆器将细菌细胞与牡蛎匀浆混合。如图所示，在 PBS 中将加标牡蛎匀浆的 1 乘以 10 乘以负 10 乘以 10 乘以负 3 稀释液，将每种稀释液的 100 微升涂抹在单个显色、TCBS 和 TSAS 板上。在 35 至 37 摄氏度下放置 96 小时后，将显色琼脂和 TCBS 琼脂上的实际菌落计数与从过夜培养物的标准平板计数中推断出的预期菌落计数进行比较。
为了确定本研究中使用的菌株的生长和菌落形态，细菌在选择性和差异培养基上生长。TCBS 是用于分离某些弧菌属的常规培养基，包括绿松石色的 V.Parahaemolyticus 和黄色的 V.Cholerae。使用显色培养基从食物和环境样本中选择临床相关的弧菌物种，可产生青色副溶血性弧菌和洋红色 V.Cholerae。
在牡蛎匀浆存在下，在显色琼脂平板上生长的副溶血性弧菌菌落与在非选择性培养基上观察到的数量相似，这表明显色培养基的检测限与非选择性培养基的检测限相似，即使在食物基质存在的情况下也是如此。副溶血性弧菌的生长和恢复也不受非溶血性弧菌存在的影响。副溶血性菌属，是差异和选择性培养基的基本属性，因为环境样品中含有大量各种弧菌属，尤其是在富集程序之后。
此外，通过不耐热溶血素 PCR 对 TCBS 和显色琼脂的比较显示，显色琼脂具有更高的敏感性和特异性，表明这种差异和选择性培养基在检测和鉴定副溶血性弧菌方面的总体性能更好。一旦掌握，如果作得当，整个过程包括大约 50 种菌株的测试和孵育时间都可以在 30 天内完成。在尝试此程序时，重要的是要记住认真标记所有培养物并始终使用无菌技术。
按照此程序，可以执行其他方法（如菌落 PCR）来回答其他问题，例如，这种特异性分离株是否携带毒力基因？该技术开发后，为食品安全和公共卫生领域的研究人员探索贝类和河口环境中的弧菌物种检测铺平了道路。观看本视频后，您应该对如何进行标准平板计数以及如何评估生长培养基的灵敏度、特异性和检测限有一个很好的了解。
不要忘记，与病原体和热介质一起工作可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取预防措施，例如穿防护服、覆盖任何开放性伤口和隔离生物危害性废物。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
概述
本研究评估了一种用于检测和分离副溶血弧菌及相关物种的新型显色培养基。该新培养基在灵敏度和特异性方面相较于传统方法有所提高。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 食品安全
- 环境微生物学
背景
- 弧菌属是食品和环境中的重要病原体。
- 传统培养基在检测这些物种时可能缺乏灵敏度。
- 改进的检测方法对公共卫生至关重要。
- 显色培养基可以增强识别过程。
研究目的
- 评估新型显色培养基的有效性。
- 比较其灵敏度和特异性与传统培养基。
- 促进复杂样本中弧菌属的检测。
使用的方法
- 通过高压灭菌法制备琼脂培养基。
- 使用前将琼脂冷却至45-50摄氏度。
- 使用各种细菌分离株进行测试。
- 评估培养基在检测弧菌属方面的性能。
主要结果
- 新的显色培养基显示出更高的灵敏度。
- 与传统培养基相比，特异性也得到了改善。
- 可以有效测试多种细菌分离株。
- 即使在食品基质存在的情况下，该方法也适用。
结论
- 新培养基是检测弧菌属的有价值工具。
- 它可以增强食品安全监测和环境评估。
- 进一步的研究可能扩大其在微生物学中的应用。
常见问题
Executive Industry Relevance
Accurate detection and differentiation of Vibrio parahaemolyticus in complex food matrices is critical for food safety risk assessment and public health surveillance. Improved chromogenic media enhance predictive confidence in pathogen identification, supporting go/no-go decisions in raw material screening and environmental monitoring. This method addresses a key discovery-stage challenge in microbiological assay development by providing a selective, differential tool with higher sensitivity and specificity than conventional media.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of Vibrio species presence in food and environmental samples, supporting hypothesis testing for contamination sources.
- Operational Value: Provides a standardized, reproducible platform for isolating target strains from mixed microbial populations.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable, color-based readouts (cyan colonies for V. parahaemolyticus) that enable objective scoring and hit selection in screening campaigns.
- Operational Value: Supports assay scalability and reproducibility across laboratories, with demonstrated performance in food matrix interference studies.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates translational continuity from environmental detection to preclinical risk assessment by providing confirmed Vibrio isolates for downstream virulence or biomarker analysis.
- Operational Value: Reduces false-negative rates in complex samples, improving reliability of preclinical safety models involving food-derived exposures.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery workflow, supporting initial hazard identification before progression to mechanistic studies or lead identification efforts in food safety programs.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing regarding Vibrio prevalence and strain diversity in food and aquatic environments.
- Screening: Delivers quantitative colony-forming unit data and chromogenic readouts that support reproducible, high-throughput environmental monitoring.
- Analytics: Provides measurable outputs (colony count, color morphology) that allow comparison of detection limits and selectivity across media types.
- Translational Research: Connects environmental detection to preclinical evaluation by supplying validated isolates for virulence gene screening or challenge model development.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable microbiological platform applicable across food safety, environmental monitoring, and public health surveillance programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence through improved sensitivity (~96.4% recovery) and specificity in differentiating V. parahaemolyticus from non-target Vibrio species.
- Operational Value: Delivers standardized, matrix-tolerant performance with clear visual differentiation (cyan vs. non-cyan colonies), reducing subjectivity in interpretation.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted prioritization of samples and interventions by improving detection reliability in complex food matrices like oyster homogenate.
- Portfolio Impact: Enhances early-stage de-risking of food safety interventions by providing more accurate baseline contamination data.
Implementation Considerations
- Requires microbiological expertise in selective media preparation, aseptic technique, and chromogenic colony interpretation.
- Dependent on standard laboratory infrastructure including autoclaves, incubators (35–37°C), and dilution/plating equipment.
- Necessitates cross-team standardization of incubation times (24–96 hr), dilution schemes, and colony counting protocols to ensure reproducibility.
- Adaptation considerations include validation across diverse food matrices (e.g., shellfish, seawater) and Vibrio species panels to maintain specificity.
- Practical limitations include occasional failure of certain V. parahaemolyticus strains to produce expected cyan colonies (9.1% in study) and suboptimal growth on TCBS for some strains (13.6%), necessitating confirmatory testing.
