一种用于检测的更敏感和特异的显色培养基的研制 副溶血性弧菌 及其他 弧菌 物种

本实验的总体目标是评估一种新型显色培养基在检测和分离副溶血性弧菌方面的灵敏度和特异性，并与传统培养基进行比较。该方法有助于回答食品和环境微生物学领域的关键问题，例如：食品及采收环境中弧菌属的污染情况如何？本方法的主要优势在于可使用多种细菌分离物，即使在存在食品基质的情况下也能进行检测。

在培养细菌之前，对所有琼脂培养基进行高压灭菌。然后将琼脂在水浴中冷却至45至50摄氏度。当琼脂准备就绪后，将空的培养皿每五到六个叠成一叠摆放整齐。

然后，从培养皿堆叠的底部开始，将熔化的琼脂倒入每个培养皿中，直至约一半满，倒完后立即盖上皿盖。在室温下静置琼脂，使其凝固至少12小时。在准备微生物菌株培养时，当琼脂完全凝固后，用无菌接种环将菌种转移至相应的非选择性琼脂平板上，并以划线法接种细菌，使细菌分布成一定模式，以便观察单个分离的菌落。

所有菌落接种完成后，除空肠弯曲菌（Campylobacter species）外，将培养物倒置于35至37摄氏度条件下培养最多48小时；空肠弯曲菌需置于密闭盖的罐中，并放入气体发生袋以形成微需氧环境进行培养。培养结束后观察菌落形态。纯培养物应产生形态一致的菌落。

为了在选择性和鉴别性培养基上扩增目标菌落，将数个单菌落转移至5毫升适当的液体培养基中，并在35至37摄氏度下重新培养16至24小时。次日，用接种环取一环过夜培养物，分别划线接种至至少一个硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose，简称TCBS）琼脂平板和至少一个显色琼脂平板，于35至37摄氏度下培养最长96小时。培养结束后，观察平板上的菌落密度及单菌落大小，以评估菌株的整体生长情况；根据需要，在自然光或紫外光下记录菌落的颜色，并记录菌落的其他重要特征。

为进行回收实验，将副溶血性弧菌的幼龄培养物接种于5毫升胰蛋白胨大豆肉汤中，该肉汤添加2%氯化钠，即TSBS，并将试管置于35至37摄氏度下培养16至24小时。次日，涡旋振荡过夜培养物，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中制备1×10⁻¹至1×10⁻⁷的系列稀释液。使用1×10⁻⁴至1×10⁻⁷稀释度的菌液，将每种稀释液各取100微升，均匀涂布于各自的显色培养基、TCBS培养基以及添加2%氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂（TSAS）平板上。

将所有平板在35至37摄氏度下孵育最多96小时。然后计数菌落，忽略菌落过多无法计数或菌落数少于25个的平板。为进行竞争实验，选择一种在TCBS培养基上产生预期的绿松石色菌落、在显色培养基上产生青色菌落的副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）菌株，以及一种非V.

副溶血性物种，其在任一培养基上均不生长或表现出不同的菌落颜色。从TSAS琼脂上挑取数个孤立的副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）和梅氏弧菌（V. metschnikovii）菌落，接种于5毫升TSBS培养基中，在35至37摄氏度下培养16至24小时。从脑心浸液（BHI）琼脂上挑取数个孤立的宋内志贺菌（Shigella sonnei）菌落，接种于5毫升BHI肉汤培养基中，在35至37摄氏度下培养16至24小时。

第二天，对每种菌株进行系列稀释，将稀释液涂布于非选择性琼脂平板上，以测定过夜培养物每毫升中的菌落形成单位。随后，利用过夜培养物和稀释管，混合不同体积的副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）菌株与非副溶血性弧菌（non-V. parahaemolyticus）物种，取100 µL细菌混合液分别涂布于显色培养基、TCBS和TSAS琼脂平板上。

在 35 至 37 摄氏度下培养最长 96 小时后，根据菌落在显色培养基和 TCBS 平板上生长情况和形态学的差异进行菌落计数。为评估牡蛎匀浆对细菌在选择性和鉴别性培养基上生长的影响，首先从至少 12 只软体贝类中称取不少于 50 克的牡蛎肉，包括肉和汁液。然后向牡蛎组织中加入等质量的 PBS，高速匀浆 90 秒。

接下来，将100克稀释后的牡蛎匀浆加入400克PBS中，并高速搅拌混合物1分钟。然后对匀浆进行高压灭菌。冷却后，分别加入100微升过夜培养的副溶血性弧菌和非副溶血性弧菌。

将副溶血性弧菌培养物加入牡蛎匀浆中，使用均质器将细菌细胞与牡蛎匀浆充分混合。用PBS对加标牡蛎匀浆进行1×10⁻¹至1×10⁻³的系列稀释，如示例所示，将每个稀释度的100 µL分别涂布于显色培养基、TCBS和TSAS平板上。在35至37°C培养96小时后，将显色培养基和TCBS琼脂平板上的实际菌落计数与根据过夜培养物的标准平板计数推算出的预期菌落计数进行比较。

为了确定本研究中所用菌株的生长情况和菌落形态，将细菌培养于选择性和鉴别性培养基上。TCBS 是用于分离某些弧菌属物种（包括呈青绿色的副溶血性弧菌和呈黄色的霍乱弧菌）的传统培养基。使用显色培养基从食品和环境样本中选择临床相关弧菌属物种时，会产生呈青蓝色的副溶血性弧菌和品红色的霍乱弧菌。

在含有牡蛎匀浆的情况下，副溶血性弧菌在显色琼脂平板上形成的菌落数量与非选择性培养基上的数量相似，表明即使存在食品基质，显色培养基的检测限与非选择性培养基相近。此外，非副溶血性弧菌物种的存在并不影响副溶血性弧菌的生长和回收，这是差异性和选择性培养基的一项关键特性，因为环境样品中含有大量多种弧菌属物种，尤其是在增菌培养后。

此外，通过不耐热溶血素PCR对TCBS培养基和显色培养基进行比较，结果显示显色培养基具有更高的灵敏度和特异性，表明该选择性和鉴别性培养基在检测和鉴定副溶血性弧菌方面整体性能更优。熟练掌握后，若操作得当，整个实验流程（包括约50株菌的检测和培养时间）可在30天内完成。在进行该实验时，务必始终认真标记所有培养物，并严格执行无菌操作技术。

完成此操作后，还可进行其他方法，如菌落PCR，以回答更多问题，例如：该特定分离株是否携带毒力基因？该技术建立后，为食品安全和公共卫生领域的研究人员探索贝类及河口环境中弧菌属的检测铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何进行标准平板计数，以及如何评估培养基的灵敏度、特异性和检测限。

请务必注意，处理病原体和高温培养基可能具有极高的危险性，在进行本实验操作时，应始终采取相应预防措施，例如穿戴防护服、包扎任何开放性伤口，以及对生物危害性废物进行隔离处理。