Name: 对于检测到的敏感性和特异性显色琼脂培养基发展副溶血性弧菌及其他弧菌物种 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: 了解用于检测副溶血性弧菌及其他弧菌物种的新型显色琼脂培养基技术。该方法通过评估敏感性和特异性，为食品安全与环境微生物学研究提供可靠的病原菌分离方案。

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感谢 M. Channey、E. Chau 和 K. Tomas 在本项目中的协助。项目经费部分由加州理工州立大学资助。

1. 微生物菌株的培养基与培养
注意：所有实验均需使用无菌技术。使用无菌材料。使用前对所有容器、工具和试剂进行灭菌。由于被视为生物危害物，所有废弃材料在丢弃前必须经高压灭菌处理。以下所有操作的高压灭菌温度和时间组合为 ≥121 °C × ≥15 min。
<ol>
	<li>配制约1升胰蛋白胨大豆琼脂（TSA），首先将1升去离子水加入含有磁力搅拌子的2升锥形瓶中。所用锥形瓶的容积应至少为最终体积的两倍。向瓶中加入30 g胰蛋白胨大豆肉汤粉末和20 g琼脂颗粒。 
	注意：使用 2% 琼脂代替 1.5% 琼脂，以限制某些菌株的游走生长 弧菌 种（spp.）
	<ol>
		<li>开启搅拌器，充分混匀。在搅拌的同时，开启加热使混合物沸腾。一旦混合物开始沸腾，立即将烧瓶从加热器上取下。用锡箔纸 loosely 覆盖烧瓶，用胶带将箔纸固定在烧瓶上，再进行高压灭菌。</li>
		<li>配制胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）时，省略步骤1.1配方中的琼脂。 
		注：可使用瓶子代替锥形瓶。</li>
		<li>在制备添加2%氯化钠（NaCl）的胰蛋白胨大豆琼脂（TSAS）时，于搅拌和加热前在混合物中加入20 g NaCl。在制备添加2% NaCl的胰蛋白胨大豆肉汤（TSBS）时，省略琼脂成分，并于搅拌和加热前在混合物中加入20 g NaCl。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>制备脑心浸液（BHI）琼脂时，将37 g BHI粉末和15 g琼脂颗粒悬浮于1 L纯化水中，加热并频繁搅拌以溶解粉末，随后进行高压灭菌。如需制备BHI肉汤，则省略琼脂。</li>
	<li>制备TCBS琼脂时，将89 g TCBS粉末溶于1 L纯化水中，频繁搅拌并加热，煮沸1 min以彻底溶解粉末。切勿进行高压灭菌。</li>
	<li>所有琼脂培养基均需将热琼脂冷却至45–50 °C 在水浴中。将空的培养皿每五到六个叠成一叠。从叠放的底部开始，将融化的琼脂倒入每个培养皿中，至约半满为止。倾倒后立即盖上培养皿盖。将培养皿置于室温下静置，使琼脂凝固。
	<ol>
		<li>次日或12小时后使用琼脂平板。未使用的平板可置于冰箱中保存最多两周。使用前，将平板从冰箱中取出，在室温下平衡至少15分钟。 
		注意：1 升琼脂大约可制成 45 块琼脂平板。制备当天应使琼脂平板充分干燥，并在冷藏保存后恢复至室温，以有效减少菌落蔓延。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>获取巧克力琼脂和显色琼脂平板，每次实验前于室温平衡。</li>
	<li>传代培养所展示的全部54种微生物菌株 表1 每隔几天。
	<ol>
		<li>使用无菌接种环将菌种从冻存菌株或前一批培养物转移至非选择性培养基，如BHI、TSB/TSA或巧克力琼脂。培养嗜盐菌 弧菌属 spp. 在 TSBS/TSAS 上。</li>
		<li>为检测培养物的纯度，将所有菌株按可观察单个菌落的模式划线接种。例如，采用三区划线法，将大量细菌逐步稀释，最终获得单个分离菌落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将培养皿倒置，在35-37 °C 长达 48 小时。对于 弯曲杆菌 物种，孵育试管或平板 在含有气体袋的密闭盖罐中培养以形成微需氧环境。培养后观察菌落形态。纯培养物应产生形态相似的菌落。 
	注意：所有培养皿均需倒置培养，以防止盖子内侧凝结的水滴落入菌落。</li>
</ol>
2. 通过 PCR 进行物种鉴定
<ol>
	<li>采用 tlh-PCR 方法确认 V. parahaemolyticus 菌株的身份。使用引物 tlh-F (5' AAA GCG GAT TAT GCA GAA GCA CTG 3') 和 tlh-R (5' GCT ACT TTC TAG CAT TTT CTC TGC 3') 扩增热不稳定溶血素基因的 450-bp 片段20。
	<ol>
		<li>使用无菌接种环将每种 V. parahaemolyticus 菌株在 TSAS 上的少量单菌落转移至 5 ml TSBS 中。在 35-37 °C 下培养 16-24 小时。</li>
		<li>在 14,000 × g 条件下离心培养物 1 分钟。弃去上清液，并用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗涤沉淀物两次。将悬浮液煮沸 3 分钟以获得细胞裂解物。 
		注意：V. parahaemolyticus 易于裂解，因此无需使用裂解试剂。也可直接取少量菌落作为扩增模板。</li>
		<li>在 25-µl 反应体系中进行 PCR。配制反应混合液，终浓度为 1× PCR 缓冲液、1.5 mM MgCl2、每种 dNTP 100 µM、每种引物 1 µM、Taq DNA 聚合酶 1 U，以及 1 µl 细胞裂解物。94 °C 预变性 5 分钟后，进行 35 个循环的扩增：94 °C 变性 30 秒，58 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 60 秒21。</li>
		<li>取 5-µl 扩增产物上样于 1.5% 琼脂糖凝胶中。开启电源开始电泳。经溴化乙锭染色后，在紫外光下观察扩增产物的有无。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 选择性与鉴别培养基上的培养
<ol>
	<li>实验前两到四天，将表1中列出的所有微生物菌株划线接种于非选择性培养基（TSAS、BHI 或巧克力琼脂）上，以获得单菌落。将平板在 35–37 °C 下孵育 48 小时。孵育后通过观察菌落形态检查培养物的纯度。纯培养物应产生形态一致的菌落。</li>
	<li>从步骤 3.1 中挑取数个分离的菌落，转移至 5 ml 液体培养基中。在 35–37 °C 下孵育试管 16–24 小时。 
	注意：在所有实验中，均应使用小于四天的幼嫩菌落制备过夜培养物。</li>
	<li>用接种环取一环过夜培养物，在选择性和鉴别性培养基（TCBS 和显色琼脂）上划线，以分离单菌落。将平板在 35–37 °C 下孵育最长 96 小时。</li>
	<li>通过观察平板上的菌体密度及分离菌落的大小，记录所有菌株的总体生长情况。记录菌落在自然光和/或紫外光下的颜色。注意记录分离菌落的其他特征，如隆起度、边缘和形态。</li>
</ol>
4. 恢复实验
<ol>
	<li>选择一个具有代表性的子集 副溶血性弧菌 菌株（n=14），涵盖不同血清型和分离来源22. 从平板中接种幼嫩培养物至5 ml TSBS中。将试管在35-37 °C 16-24 小时。</li>
	<li>按照下述方法对过夜培养物进行标准平板计数法。
	<ol>
		<li>涡旋混匀过夜培养物。进行10倍或10-1 通过转移进行稀释 100 µl 过夜培养物加入含有 900 µl PBS。涡旋振荡以充分混匀。</li>
		<li>使用新的移液器吸头转移 100 µl 从第10个-1 稀释管转移到另一含有 900 µl PBS。涡旋振荡以充分混匀。此为10-2 稀释。依次重复该步骤，得到10-7 稀释</li>
		<li>使用 10-4 至 10-7 稀释管，平板 100 µl 分别在显色培养基、TCBS 和 TSAS 琼脂平板上。 
		注意：稀释因子（df) 在平板上的数量变为 10-5 至 10-8分别。</li>
		<li>将等份试样均匀涂布在琼脂表面。 
		注意：只要先涂布最稀释的等分试样，同一菌株在同一培养基上使用同一涂布棒是可行的（即，从10-8 至 10-5）。不同培养基请勿使用同一涂布棒。</li>
		<li>35–37 °C下培养平板37 °C 最长培养 96 小时。计数平板上的菌落。忽略菌落数量过多无法计数（tntc）或少于 25 个的平板。根据以下公式计算 CFU/ml： 
		<img alt="柱容量计算公式，\(N=C/[(1 \times n_1)+(0.1 \times n_2)] \times df\)；色谱分析" src="/files/ftp_upload/54493/54493eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 
		何处 
		N = 未稀释管中的细胞数量，以 CFU/ml 或 CFU/g 表示 
		C = 平板上菌落数在 25-300 范围内的菌落总数 
		n1 = 计数菌落数所依据的平板数量（菌落来自较低稀释度的平板） df 
		n2 = 来自后续10倍稀释液的平板数量（用于计数菌落） 
		df = 较低的稀释倍数（即，更高浓度的稀释液）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>比较不同培养基中的CFU/ml。以TSAS上的CFU/ml为100%，计算各培养基的%回收率 V. parahaemolyticus 在显色培养基和TCBS琼脂上培养。</li>
</ol>
5. 竞争实验
<ol>
	<li>选择在显色培养基和TCBS琼脂上表现出不同菌落形态的菌株子集。 
	注意：通过这种方法，可以计数来源于 副溶血性弧菌 仅，尽管接种物中存在其他物种。
	<ol>
		<li>选择一个 副溶血性弧菌 在TCBS和显色培养基上分别产生预期的绿松石色和青色菌落的菌株。</li>
		<li>选择一个非-副溶血性弧菌 以及一个非弧菌属 在这些培养基上均不生长或菌落颜色不同的物种。 
		注意：例如， V. metschnikovii 在TCBS上生长极为微弱，且在显色琼脂上不生长。 福氏志贺菌 在TCBS培养基上不生长，但在显色培养基上产生品红色菌落。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在选定上述菌株后，使用在非选择性培养基上生长的单菌落制备过夜液体培养物。
	<ol>
		<li>制备过夜培养物 副溶血性弧菌 和 V. metschnikovii 通过从TSAS上转移数个分离的菌落至5 ml TSBS中。在35-37 °C 16-24 小时</li>
		<li>制备过夜培养物 福氏志贺菌 通过将少量BHI琼脂上的孤立菌落转移至5 ml BHI肉汤中。35–37 °C 16-24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对每种菌株，进行类似于步骤 4.2.1 和 4.2.2 的系列稀释。将适当的稀释液涂布于 TSAS 或 BHI 培养基上，利用步骤 4.2.5 中所示公式测定过夜培养物的 CFU/ml。 
	注意：通常情况下， 100 µl 从第10个-5 至 10-7 稀释管适用于大多数培养物。根据CFU/ml的数值反推下一步所用细胞的准确数量。CFU/ml的计算值是在培养后获得的，尽管后续步骤与步骤5.3在同一天进行。</li>
	<li>使用第5.2和5.3步中的过夜培养物和稀释管，混合不同量的a V. parahaemolyticus 菌株与非V. parahaemolyticus 物种。例如，混合 500 µl 10 的-5 稀释管 副溶血性弧菌 与 500 µl 过夜培养物的 V. metschnikovii. 
	注意：该混合物用于模拟高微生物背景。若要模拟低微生物背景，可混合 500 µl 10 个中的每一个-5 来自两个物种的稀释管. </li>
	<li>铺板 100 µl 将混合液分别接种于显色培养基、TCBS 和 TSAS 琼脂平板上。</li>
	<li>孵育于 35-37 °C 长达 96 小时，计数菌落 副溶血性弧菌 且非副溶血性弧菌 根据在显色培养基和TCBS琼脂上的生长差异及菌落形态区分物种。 
	注意：例如，如果非副溶血性弧菌 该物种不在显色培养基和TCBS琼脂上生长，所有菌落均属于 副溶血性弧菌. 如果非副溶血性弧菌 该物种在两种培养基上均生长，但仅TCBS培养基上的蓝绿色菌落及显色培养基上的青色菌落属于目标菌落 副溶血性弧菌非副溶血性弧菌 物种可能表现出与之相似或不相似的菌落形态 副溶血性弧菌 在TSAS上。
	<ol>
		<li>如果非V. parahaemolyticus 物种的生长方式与 副溶血性弧菌 在此非选择性培养基上，将菌落数除以二以获得相应数值 副溶血性弧菌 仅将实际菌落数与步骤5.3中得出的预期菌落数进行比较。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 牡蛎匀浆物的影响
<ol>
	<li>称取不少于12个软体贝类（包含肉和汁液）的牡蛎肉，总质量≥50 g。
	<ol>
		<li>加入等量的 PBS 至牡蛎肉及牡蛎汁中，高速匀浆 90 秒。此为 2-1 稀释的牡蛎匀浆</li>
		<li>加入100 g的2-1 将牡蛎匀浆液用 PBS 稀释至 400 g。使用天平称量重量，而非体积。高速搅拌混合物 1 分钟。对牡蛎匀浆液进行高压灭菌。 
		注意：此为用于加标的牡蛎匀浆液。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在牡蛎匀浆存在下重复复苏实验（步骤 4）。
	<ol>
		<li>待500 g牡蛎匀浆冷却后，加入 100 µl 的 副溶血性弧菌 在TSBS中过夜培养的菌液。确定实际的加入量 副溶血性弧菌 通过执行第4.2步中所述的标准平板计数程序，对接种物中的细胞进行计数。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在牡蛎匀浆存在下重复竞争实验（步骤5）。
	<ol>
		<li>待500 g牡蛎匀浆冷却后，加入 100 µl 每种过夜培养的菌液 副溶血性弧菌 和非副溶血性弧菌 将其与之关联。确定细菌的实际数量 通过执行第4.2步中所述的标准平板计数程序，对接种物中的细胞进行计数</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用匀浆器将细菌细胞与牡蛎匀浆液充分混匀。 
	注：混合后，含有故意添加细胞的牡蛎匀浆称为加标牡蛎匀浆。</li>
	<li>将加标牡蛎匀浆液进行稀释，以获得10-1 至 10-3 按照第4.2.2步所述程序进行稀释管操作。涂布 100 µl 将各稀释液分别接种于显色培养基、TCBS 和 TSAS 琼脂平板上。将平板置于 35-37 °C 长达 96 小时。</li>
	<li>将显色琼脂和TCBS琼脂上的实际菌落计数与根据步骤6.2.1和6.3.1推算出的预期菌落计数进行比较。 
	注意：例如，如果一个离心管中的 副溶血性弧菌 过夜培养物含有 108 CFU/ml，接种量为 100 μl 意味着107 将细胞加入500克牡蛎匀浆中，得到5 × 104 细胞/克。稀释与涂布后，选择具有 df = 10-2 应产生 500 个菌落；而含有 df = 10-3 应得到50个菌落。此为预期的菌落数量。</li>
</ol>

<ol><li>Yeung, P. S., Boor, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidemiology%2C+pathogenesis%2C+and+prevention+of+foodborne+Vibrio+parahaemolyticus+infections%5BTitle%5D)+AND+%22Foodborne+Pathog.+Dis%22%5BJournal%5D)">Epidemiology, pathogenesis, and prevention of foodborne Vibrio parahaemolyticus infections.</a> Foodborne Pathog. Dis. 1 (2), 74-88 (2004).</li>
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部分培养基由加利福尼亚州圣玛丽亚的Hardy Diagnostics慷慨提供。Thorsen在加利福尼亚州立理工大学就读期间开展了本研究。他目前是Hardy Diagnostics的员工。

本研究聚焦于培养基的开发与评估。传统上，TCBS 是用于分离和检测的选用性和鉴别性培养基 副溶血性弧菌，霍乱弧菌 和 V. vulnificus12然而，已有研究报道了该培养基存在一些局限性，例如无法实现分化 V. cholerae 来自其他 弧菌属 物种。蔗糖和pH指示剂是TCBS中的鉴别成分。因此，能够发酵蔗糖的菌株产酸，导致培养基颜色改变。培养基的着色是TCBS的一个缺点，因为它可能妨碍对菌落形态的观察。新开发的显色培养基利用高pH和高盐浓度抑制非目标菌的生长弧菌 在许多海洋样本中发现的物种。该新型显色培养基的最终 pH 值为 8.6±0.2。每升去离子水中含有蛋白胨 10 g、海盐混合物 10 g、牛胆汁 10 g、硫代硫酸钠 10 g、酵母提取物 5 g、柠檬酸钠 5 g、碳酸钠 2.2 g、乳糖 2 g、丙酮酸钠 0.5 g、显色混合物 0.3 g 以及琼脂 15 g。该显色混合物可实现不同菌种间的区分 弧菌属 spp. 根据其产生特定酶的能力差异进行区分。与改变TCBS琼脂培养基颜色不同，不同的...

作为该组织的一员 弧菌 属， 副溶血性弧菌 是一种革兰氏阴性、不形成芽孢、呈弯曲杆状的细菌。在液体和半固体环境中均表现出高度运动性。大多数 副溶血性弧菌 菌株对人类无致病性，但致病亚型曾引发流行病和大流行，因此该物种在许多国家被视为重要的食源性病原体1,2发病率 弧菌 自2000年以来，美国的感染率呈上升趋势3. 在……之中 弧菌 sp.（复数：spp.） 副溶血性弧菌 是美国报告引起疾病最频繁的物种4,5其他具有临床意义的物种包括 V. alginolyticus, V. vulnificus, V. cholerae, 等等。 少数疾病由多种物种同时引起。
副溶血性弧菌 是海洋水体中的天然栖居物种，因此广泛分布于全球各地的海洋水域，包括河口地区。该物种于1950年因日本发生一起食物中毒暴发事件而被发现。在美国，该物种首次从普吉特湾地区的海水、沉积物及贝类中分离获得。6,7海洋栖息地中的滤食性生物，例如双壳类贝类，可能携带 副溶血性弧菌 作为其正常菌群的一部分8因此， 副溶血性弧菌 人类感染通常与食用受污染的海产品有关，尤其是生的或未煮熟的贝类。另一种较少见的感染途径是开放性伤口接触海水，从而导致皮肤感染。大多数 副溶血性弧菌 菌株不会引起人类疾病，但某些携带毒力因子（如耐热直接溶血素，TDH）的亚型具有致病性。食源性疾病的最常见症状 副溶血性弧菌 感染症状包括腹泻和腹痛，随后出现恶心、呕吐和发热。也有头痛和寒战的报道。中位潜伏期为15小时，但在摄入足量致病菌株后，潜伏期可长达96小时。9病程持续两到三天。由 副溶血性弧菌 通常具有自限性，因此无需特殊治疗。轻度胃肠炎可通过口服补液进行有效治疗。较严重的病例可使用四环素或环丙沙星等抗生素治疗。10胃肠炎病例的死亡率约为2%，但若患者发展为血流感染或败血症，死亡率可高达29%。任何食用海鲜或有开放性伤口暴露于海水者均存在感染风险 副溶血性弧菌 感染。病情更严重、可危及生命的形式为败血症，在患有基础疾病的亚人群中更为常见。11，包括酒精中毒、肝病、糖尿病、肾病、恶性肿瘤以及其他导致免疫反应减弱的疾病。值得注意的是，这类人群也更容易感染由 V. vulnificus，可在类似于自然栖息地的环境中找到 副溶血性弧菌.
副溶血性弧菌 通常使用硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂作为选择性和鉴别性培养基进行分离。在接种TCBS琼脂前，可先在碱性蛋白胨水中进行增菌。TCBS上的可疑菌落需进一步通过一系列生化试验和/或针对物种特异性基因的分子检测方法进行鉴定。基于PCR的方法常用于确认菌种身份。 副溶血性弧菌 通过扩增热不稳定溶血素基因， tlh12. 
无论选择何种验证方法，拥有有效的培养基以分离和区分都至关重要 副溶血性弧菌 与其他海洋弧菌区分开来。TCBS 培养基通常被用于区分弧菌属内的不同物种 弧菌 根据其发酵蔗糖的能力对属进行分类12阳性发酵反应伴随pH指示剂溴百里酚蓝的颜色变化。 副溶血性弧菌 菌落在TCBS上具有较明显的特征，呈现蓝绿色。然而，该培养基难以轻易区分 V. alginolyticus 和 V. cholerae 蔗糖发酵 变形杆菌属 物种可能产生类似黄色的菌落 V. cholerae 或 V. alginolyticus13在TCBS上初次分离时 副溶血性弧菌 也可能被误认为 嗜水气单胞菌，志贺样邻单胞菌，以及 假单胞菌 种（spp.）14延迟发酵蔗糖的菌株可能与其他不发酵蔗糖的菌株混淆 弧菌13，包括 副溶血性弧菌TCBS 被发现对……不敏感 大肠杆菌, Pseudomonas putrefaciens，以及其他物种。另有多个物种可产生从绿色到灰色的菌落，可能与之混淆 副溶血性弧菌 或 V. vulnificus15因此，有必要开发具有更高灵敏度和特异性的替代培养基，以用于检测和分离 副溶血性弧菌 及其他近缘物种。
近年来已开发出多种替代性培养基。除了添加选择性试剂外，大多数培养基还含有显色底物，以根据不同物种的特异性酶活性差异进行区分。例如，吲哚基-β-葡萄糖苷和吲哚基-β-半乳糖苷作为显色底物，可依据β-葡萄糖苷酶和β-半乳糖苷酶的产生能力差异，将呈现蓝绿色的V. parahaemolyticus菌落与呈紫色的V. cholerae菌落区分开来16。多个研究团队开发的不同配方的显色琼脂已被评估，其性能被报道与TCBS相当或更优17,18,19。使用显色培养基的一个优势在于其周围培养基的着色程度极低，从而有利于特定菌落的分离。在本研究中，我们评估了一种新配方显色培养基检测和分离V. cholerae、V. parahaemolyticus和V. vulnificus的能力，并特别关注其区分V. parahaemolyticus与其他物种的能力。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;试剂/设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0140-15-4</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>高压灭菌器</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BHI 粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0418-17-7</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>任意</td><td></td><td>用于搅碎牡蛎肉</td></tr><tr><td>CampyGen 气体发生器</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>CN035A</td><td>用于提供微需氧环境；可使用其他品牌</td></tr><tr><td>巧克力琼脂平板</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>E14</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>常规 PCR 试剂（dNTPs、MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;、&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; 聚合酶）</td><td>任意</td><td></td><td>或使用 PCR 微珠（Fisher Sci 46-001-014）</td></tr><tr><td>培养管</td><td>Fisher Scientific</td><td>S50712</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>Eppendorf 管</td><td>Fisher Scientific</td><td>S348903</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>凝胶成像系统</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HardyChrom 弧菌琼脂平板</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>G319</td><td>本研究评估该培养基</td></tr><tr><td>培养箱</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>接种环</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-606</td><td>本研究使用 10 微升规格</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>牡蛎</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>R23701</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>培养皿</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>移液器及吸头</td><td>任意</td><td></td><td>需使用灭菌吸头</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;tlh&lt;/em&gt; 引物</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>天平</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>涂布棒</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-11</td><td>可改用玻璃珠代替</td></tr><tr><td>Stomacher 搅拌器</td><td>Stomacher</td><td>400</td><td>样品以 200 rpm 匀浆 30 秒。&amp;nbsp; 可使用其他匀浆设备。</td></tr><tr><td>搅拌器用无菌滤袋</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-5</td><td></td></tr><tr><td>TCBS 粉末</td><td>Hardy Diagnostics</td><td>265020</td><td>本研究评估该培养基</td></tr><tr><td>PCR 仪</td><td>任意</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TSB 粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0370-07-5</td><td>可使用其他品牌</td></tr><tr><td>紫外观察柜</td><td>任意</td><td></td><td>发射长波紫外光</td></tr><tr><td>水浴锅</td><td>任意</td><td></td><td>&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;来源&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;备注&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;细菌种类与菌株&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Aeromonas hydrophila&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Campylobacter jejuni&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Proteus mirabilis&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas aeruginosa&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt; Choleraesuis</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella boydii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella flexneri&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Shigella sonnei&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Vibrio alginolyticus&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. cholerae&lt;/em&gt;（血清型包括 &lt;em&gt;O139、O1&lt;/em&gt;、非 &lt;em&gt;O1、El Tor&lt;/em&gt; 生物型）</td><td>FDA, ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. damsela&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fisheri&lt;/em&gt;</td><td>环境来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. fluvialis&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. furnissii&lt;/em&gt;</td><td>CDC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. hollisae&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. metschnikovii&lt;/em&gt;</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. mimicus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. parahaemolyticus&lt;/em&gt;（血清型包括 O3:K6、O1:K56、O4:K8、O5:K15、O8、&lt;em&gt;等&lt;/em&gt;）</td><td>ATCC, FDA, CDC, 环境来源</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. proteolyticus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;V. vulnificus&lt;/em&gt;</td><td>FDA</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

一种用于检测的更敏感和特异的显色培养基的研制 副溶血性弧菌 及其他 弧菌 物种

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

由食源性感染在美国引起的 弧菌 物种数量呈现上升趋势。在该属中 副溶血性弧菌，V. parahaemolyticus 负责大部分 弧菌属相关感染。因此，准确区分三者至关重要 弧菌属 物种和检测 副溶血性弧菌 对于确保食品安全至关重要。尽管分子检测技术日益普及，依赖培养的方法仍在常规使用，并在某些情况下被视为标准方法。因此，本研究测试了一种新型显色琼脂培养基，旨在提供一种更优的方法，用于分离和鉴别具有临床意义的微生物 弧菌 spp. 该方案比较了检测的灵敏度、特异性和检测限 副溶血性弧菌 新型显色培养基与传统培养基之间的比较。多种 副溶血性弧菌 菌株（n=22) 代表不同血清型和来源的菌株被使用。这些菌株先前由美国食品药品监督管理局（FDA）和疾病控制与预防中心（CDC）鉴定，并在我们的实验室中进一步验证 tlh-PCR。在至少四次独立实验中，将这些菌株分别接种于显色琼脂和硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（TCBS）琼脂，后者是培养该物种推荐使用的培养基，随后在35–37 °C下培养24–96小时。三 副溶血性弧菌 菌株（13.6%）在TCBS培养基上未能最佳生长，但若生长则呈现绿色菌落。两株菌（9.1%）在显色琼脂上未产生预期的青色菌落。非副溶血性弧菌 菌株（n=32）也被用于检测显色琼脂的特异性。在这些菌株中，有31株未生长或表现出其他菌落形态。平均回收率 副溶血性弧菌 在显色琼脂上的相对计数约为添加2% NaCl的胰蛋白胨大豆琼脂的96.4%。综上所述，这种新型显色琼脂是一种有效的检测培养基 副溶血性弧菌 并将其与其他弧菌区分开来。

本研究共收集了54株微生物菌株，其中包括22株V. parahaemolyticus种、19株其他Vibrio属物种以及13株非Vibrio属物种（表1）。大多数V. parahaemolyticus菌株来自美国食品药品监督管理局（FDA）、疾病控制与预防中心（CDC）或其他州卫生部门，代表了多种血清型和分离来源。这些菌株此前已由监管机构鉴定确认。我们进一步通过tlh-PCR21,22对这些V. parahaemolyticus菌株的身份进行了验证。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">物种</td>
			<td rowspan="2">测...

检测和分离具有临床意义的Vibrio菌种需要使用选择性和鉴别性培养基。本研究评估了一种新型显色培养基在检测和鉴定V. parahaemolyticus及其他相关菌种方面的能力。结果表明，该新型培养基比传统培养基具有更高的敏感性和特异性。

由弧菌属物种引起的美国食源性感染呈上升趋势。在弧菌属中，副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）是导致……的主要原因。

本实验的总体目标是评估一种新型显色培养基在检测和分离副溶血性弧菌方面的灵敏度和特异性，并与传统培养基进行比较。该方法有助于回答食品和环境微生物学领域的关键问题，例如，弧菌属在食品及采收环境中的流行情况如何？本方法的主要优势在于可使用多种细菌分离物，即使在食品基质存在的条件下也能进行检测。在培养细菌之前，对所有琼脂培养基进行高压灭菌。然后将琼脂在水浴中冷却至45至50摄氏度。当琼脂准备就绪后，将空的培养皿每五到六个叠成一叠摆放整齐。然后，从培养皿堆叠的底部开始，将熔化的琼脂倒入每个培养皿中，直至约一半满，倒完后立即盖上皿盖。在室温下静置琼脂至少12小时，使其完全凝固。准备微生物菌种培养时，当琼脂凝固后，用无菌接种环将菌种转移至相应的非选择性琼脂平板上，以划线法接种细菌，使细菌分布模式便于观察单个分离菌落。所有菌落接种完成后，将培养物倒置，在35至37摄氏度下孵育最多48小时，但弯曲杆菌属（Campylobacter species）除外，后者应置于含有气体发生袋的密闭罐中孵育，以形成微需氧环境。孵育结束后观察菌落形态。纯培养物应产生形态相似的菌落。为了在选择性和鉴别性培养基上扩增目标菌落，将数个分离的菌落转移至5毫升合适的液体培养基中，并在35至37摄氏度下重新培养16至24小时。次日，取一环过夜培养物，划线接种至至少一个硫代硫酸盐-柠檬酸盐-胆盐-蔗糖（Thiosulfate-Citrate-Bile-Salts-Sucrose，TCBS）琼脂平板和至少一个显色琼脂平板上，在35至37摄氏度下培养最长96小时。培养结束后，观察平板上的菌落密度和分离菌落的大小，以评估菌株的整体生长情况，并根据需要记录菌落在自然光或紫外光下的颜色，同时注明菌落的其他重要特征。为进行回收实验，将副溶血性弧菌的幼龄培养物接种于5毫升胰蛋白胨大豆肉汤中，该肉汤添加2%氯化钠，即TSBS，并将试管置于35至37°C下培养16至24小时。次日，将过夜培养物涡旋混匀，并在磷酸盐缓冲液（PBS）中制备1×10⁻¹至1×10⁻⁷的系列稀释液。使用1×10⁻⁴至1×10⁻⁷的稀释液，分别取100 µL均匀涂布于各显色培养基、TCBS培养基以及添加2%氯化钠的胰蛋白胨大豆琼脂培养基（即TSAS）平板上。将所有平板在 35 至 37 摄氏度下孵育最多 96 小时。然后计数菌落，忽略菌落过多无法计数或菌落数少于 25 个的平板。为进行竞争实验，选择一种在 TCBS 培养基上产生预期的蓝绿色菌落、在显色培养基上产生青色菌落的副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）菌株，以及一种非 V.副溶血性物种，其在任一培养基上均不生长或表现出不同的菌落颜色。从TSAS琼脂上挑取数个孤立的副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）和梅契尼科夫弧菌（V. metschnikovii）菌落，接种于5毫升TSBS液体培养基中，在35至37摄氏度条件下孵育16至24小时。从脑心浸液（BHI）琼脂上挑取数个孤立的宋内志贺菌（Shigella sonnei）菌落，接种于5毫升BHI肉汤中，在35至37摄氏度条件下孵育16至24小时。第二天，对每种菌株进行系列稀释，将稀释液涂布于非选择性琼脂平板上，以测定过夜培养物每毫升中的菌落形成单位。接着，利用过夜培养物和稀释管，混合不同体积的副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）菌株与非副溶血性弧菌（non-V. parahaemolyticus）物种，取100 µL细菌混合液分别涂布于显色培养基、TCBS和TSAS琼脂平板上。在35至37摄氏度下培养最多96小时后，根据菌落在显色培养基和TCBS平板上的生长差异和形态特征进行计数。为评估牡蛎匀浆对细菌在选择性和鉴别性培养基上生长的影响，首先从至少12只软体贝类中称取不少于50克的牡蛎肉，包括肉和汁液。然后向牡蛎组织中加入等质量的PBS，并将混合物高速匀浆90秒。接下来，将100克稀释的牡蛎匀浆加入400克PBS中，高速搅拌混合物一分钟。然后对匀浆进行高压灭菌。冷却后，分别加入100微升过夜培养的V. Parahaemolyticus和非V.将副溶血性弧菌培养物加入牡蛎匀浆中，使用均质器将细菌细胞与牡蛎匀浆充分混合。用PBS对加标牡蛎匀浆进行1×10⁻¹至1×10⁻³的系列稀释，如图所示，将每个稀释度的100 µL分别涂布于显色培养基、TCBS和TSAS平板上。在35至37°C培养96小时后，将显色培养基和TCBS琼脂平板上的实际菌落计数与根据过夜培养物的标准平板计数推算出的预期菌落计数进行比较。为了确定本研究中所用菌株的生长情况和菌落形态，将细菌培养于选择性和鉴别性培养基上。TCBS 是用于分离某些弧菌属物种（包括呈青绿色的副溶血性弧菌和呈黄色的霍乱弧菌）的传统培养基。使用显色培养基从食品和环境样本中选择临床相关弧菌属物种时，会产生呈青蓝色的副溶血性弧菌和品红色的霍乱弧菌。在含有牡蛎匀浆的存在下，副溶血性弧菌在显色琼脂平板上形成的菌落数量与非选择性培养基上的数量相似，表明即使存在食物基质，显色培养基的检出限与非选择性培养基相当。此外，非副溶血性弧菌物种的存在并不影响副溶血性弧菌的生长和回收，这是差异性和选择性培养基的一项关键特性，因为环境样品中含有大量多种弧菌属物种，尤其是在经过增菌培养后。 此外，通过不耐热溶血素PCR对TCBS培养基与显色培养基进行比较，结果显示显色培养基具有更高的灵敏度和特异性，表明该选择性与鉴别性培养基在检测和鉴定副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）方面整体性能更优。熟练掌握后，若操作得当，包括检测和约50株菌的培养时间在内，整个流程可在30天内完成。进行该实验时，务必始终认真标记所有培养物，并严格执行无菌操作技术。完成此操作后，还可进行其他方法，如菌落PCR，以回答更多问题，例如：该特定分离株是否携带毒力基因？该技术建立后，为食品安全和公共卫生领域的研究人员探索贝类及河口环境中弧菌属的检测铺平了道路。观看本视频后，您应能充分理解如何进行标准平板计数，以及如何评估培养基的灵敏度、特异性和检测限。请务必注意，处理病原体和高温培养基可能极其危险，在进行本实验操作时，应始终采取预防措施，例如穿戴防护服、包扎任何开放性伤口，以及对生物危害性废物进行分类处理。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

对于检测到的敏感性和特异性显色琼脂培养基发展<em&gt;副溶血性弧菌</em&gt;及其他<em&gt;弧菌</em&gt;物种

我们近期报道了一种新型的荧光生成型DNA酶探针的构建方法，可用于建立一种简单、直接“混合即读”的荧光检测法以检测细菌。这些特殊的DNA探针可在特定细菌产生的粗制胞外混合物（CEM）存在下，催化切割经发色团修饰的DNA-RNA嵌合底物，从而将细菌的检测转化为荧光信号的产生。在本报告中，我们将描述关键的实验步骤，其中使用一种名为“RFD-EC1”的特异性DNA酶探针来检测模式菌株大肠杆菌（Escherichia coli, E.

利用荧光生成型DNA酶检测细菌

来源： Heering, J., 等细胞分化诱导与单细胞成像 副溶血性弧菌 游动细胞与群集细胞 视频实验杂志 (2017)本视频展示了利用特殊制备的琼脂培养基诱导副溶血性弧菌（Vibrio...

诱导 Vibrio parahaemolyticus 分化为游动细胞

来源： Heering, J., 等细胞分化诱导与单细胞成像 副溶血性弧菌 游动细胞与群集细胞 J. Vis. Exp. (2017).本视频演示了从一株 Vibrio parahaemolyticus...

副溶血性弧菌游动细胞成像样品的制备

来源： Yeung, M. 等 一种用于检测的更敏感且特异的显色培养基的开发 副溶血性弧菌 及其他 弧菌 物种。 视频实验杂志...

一种用于快速检测Vibrio菌属的新显色培养基

来源： Brumfield, K. D., 等用于维持和区分不同生物型的实验室技术 Vibrio cholerae 临床与环境分离株 视频实验杂志 (2017).本视频演示了伏格斯-普罗科菲耶夫（Voges-Proskauer，VP）试验，用于区分霍乱弧菌（Vibrio...

Vibrio cholerae 生物型分化的 Voges-Proskauer 试验

本文介绍了一种用于在大体积农业用水中对食源性病原体进行一体化浓缩、富集及终点比色检测的方案。该方法通过改良莫尔棉签（Modified Moore Swabs,...

基于比色法的纸质检测 大肠杆菌, 沙门氏菌 和 spp. 单核细胞增生李斯特菌 从大量农业用水中

用于维持和区分霍乱弧菌生物型的实验室技术 霍乱弧菌 临床与环境分离株

本方案可实现对具有显著差异的Vibrio...

细胞分化诱导与单细胞成像 副溶血性弧菌 游动细胞与群集细胞

介绍了一种电化学DNA生物传感器的制备方案，该传感器由聚乳酸稳定的、金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极组成，用于检测副溶血性弧菌（Vibrio...

开发一种电化学DNA生物传感器以检测食源性病原体

本文介绍了智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的原理、结构及操作方法。以中国山东地区家禽分离的沙门氏菌（Salmonella）为例，说明该系统的应用。计算了Lar指数，并全面讨论了其在评估抗菌药物耐药性中的意义。...

智能高通量抗菌药物敏感性检测/噬菌体筛选系统的应用及抗菌耐药性幼虫指数

了解用于检测副溶血性弧菌及其他弧菌物种的新型显色琼脂培养基技术。该方法通过评估敏感性和特异性，为食品安全与环境微生物学研究提供可靠的病原菌分离方案。

一种用于检测的更敏感和特异的显色培养基的研制副溶血性弧菌及其他弧菌物种

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一种用于检测的更敏感和特异的显色培养基的研制 副溶血性弧菌 及其他 弧菌 物种

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