Name: 为葡萄糖和脂肪酸氧化率在大鼠离体的测定方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: 学习在大鼠离体工作心脏中同时测定葡萄糖氧化率和脂肪酸氧化率的方法。该技术可实时评估心肌代谢适应与心脏收缩功能，为心血管疾病研究提供精确的代谢分析框架。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本研究由美国国立卫生研究院资助，资助项目编号为 R00 HL112952（授予 R. H.）、R01 HL108618（授予 J.P.G.）、P01 HL051971 和 P20 GM104357。本内容仅由作者负责，不代表美国国立卫生研究院的官方观点。

<ol><li>Neely, J. R., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+carbohydrate+and+lipid+metabolism+and+the+energy+balance+of+heart+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Relationship between carbohydrate and lipid metabolism and the energy balance of heart muscle.</a> Annu Rev Physiol. 36, 413-459 (1974).</li>
<li>Sen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+regulation+of+load-induced+mTOR+signaling+and+ER+stress+in+mammalian+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Glucose regulation of load-induced mTOR signaling and ER stress in mammalian heart.</a> J Am Heart Assoc. 2, e004796(2013).</li>
<li>Young, M. E., McNulty, P., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+maladaptation+of+the+heart+in+diabetes%3A+Part+II%3A+potential+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Adaptation and maladaptation of the heart in diabetes: Part II: potential mechanisms.</a> Circulation. 105, 1861-1870 (2002).</li>
<li>Stanley, W. C., Recchia, F. A., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+substrate+metabolism+in+the+normal+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart.</a> Physiol Rev. 85, 1093-1129 (2005).</li>
<li>Fillmore, N., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+mitochondrial+oxidative+metabolism+as+an+approach+to+treat+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting mitochondrial oxidative metabolism as an approach to treat heart failure.</a> Biochim Biophys Acta. 1833, 857-865 (2013).</li>
<li>Jaswal, J. S., Keung, W., Wang, W., Ussher, J. R., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+fatty+acid+and+carbohydrate+oxidation--a+novel+therapeutic+intervention+in+the+ischemic+and+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting fatty acid and carbohydrate oxidation--a novel therapeutic intervention in the ischemic and failing heart.</a> Biochim Biophys Acta. 1813, 1333-1350 (2011).</li>
<li>Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+metabolism+as+a+target+for+the+treatment+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Cardiac metabolism as a target for the treatment of heart failure.</a> Circulation. 110, 894-896 (2004).</li>
<li>Taegtmeyer, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+Cardiac+Metabolism%3A+A+Scientific+Statement+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Assessing Cardiac Metabolism: A Scientific Statement From the American Heart Association.</a> Circ Res. , (2016).</li>
<li>Barr, R. L., Lopaschuk, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodology+for+measuring+in+vitro%2Fex+vivo+cardiac+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Methodology for measuring in vitro/ex vivo cardiac energy metabolism.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 43, 141-152 (2000).</li>
<li>Neely, J. R., Liebermeister, H., Battersby, E. J., Morgan, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pressure+development+on+oxygen+consumption+by+isolated+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pressure development on oxygen consumption by isolated rat heart.</a> Am J Physiol. 212, 804-814 (1967).</li>
<li>Taegtmeyer, H., Hems, R., Krebs, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+energy-providing+substrates+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Utilization of energy-providing substrates in the isolated working rat heart.</a> Biochem J. 186, 701-711 (1980).</li>
<li>Liao, R., Podesser, B. K., Lim, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+continuing+evolution+of+the+Langendorff+and+ejecting+murine+heart%3A+new+advances+in+cardiac+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 303, H156-H167 (2012).</li>
<li>Cingolani, O. H., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-volume+relation+analysis+of+mouse+ventricular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pressure-volume relation analysis of mouse ventricular function.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301, H2198-H2206 (2011).</li>
<li>Pacher, P., Nagayama, T., Mukhopadhyay, P., Batkai, S., Kass, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+cardiac+function+using+pressure-volume+conductance+catheter+technique+in+mice+and+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measurement of cardiac function using pressure-volume conductance catheter technique in mice and rats.</a> Nat Protoc. 3, 1422-1434 (2008).</li>
<li>Abraham, D., Mao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+Pressure-Volume+Loop+Analysis+Using+Conductance+Catheters+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Cardiac Pressure-Volume Loop Analysis Using Conductance Catheters in Mice.</a> J Vis Exp. , (2015).</li>
<li>Harmancey, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+improves+metabolic+and+contractile+efficiency+in+stressed+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance improves metabolic and contractile efficiency in stressed rat heart.</a> FASEB J. 26, 3118-3126 (2012).</li>
<li>Harmancey, R., Vasquez, H. G., Guthrie, P. H., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decreased+long-chain+fatty+acid+oxidation+impairs+postischemic+recovery+of+the+insulin-resistant+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Decreased long-chain fatty acid oxidation impairs postischemic recovery of the insulin-resistant rat heart.</a> FASEB J. 27, 3966-3978 (2013).</li>
<li>Goodwin, G. W., Taylor, C. S., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+energy+metabolism+of+the+heart+during+acute+increase+in+heart+work%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of energy metabolism of the heart during acute increase in heart work.</a> J Biol Chem. 273, 29530-29539 (1998).</li>
<li>Lopaschuk, G. D., Ussher, J. R., Folmes, C. D., Jaswal, J. S., Stanley, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+fatty+acid+metabolism+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Myocardial fatty acid metabolism in health and disease.</a> Physiol Rev. 90, 207-258 (2010).</li>
<li>Neely, J. R., Denton, R. M., England, P. J., Randle, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+increased+heart+work+on+the+tricarboxylate+cycle+and+its+interactions+with+glycolysis+in+the+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">The effects of increased heart work on the tricarboxylate cycle and its interactions with glycolysis in the perfused rat heart.</a> Biochem J. 128, 147-159 (1972).</li>
<li>Katz, J., Dunn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-2-t+as+a+tracer+for+glucose+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Glucose-2-t as a tracer for glucose metabolism.</a> Biochemistry. 6, 1-5 (1967).</li>
<li>Gillis, A. M., Kulisz, E., Mathison, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+electrophysiological+variables+in+blood-perfused+and+buffer-perfused%2C+isolated%2C+working+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cardiac electrophysiological variables in blood-perfused and buffer-perfused, isolated, working rabbit heart.</a> Am J Physiol. 271, H784-H789 (1996).</li>
<li>Qiu, Y., Hearse, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+ischemic+vulnerability+and+responsiveness+to+cardioplegic+protection+in+crystalloid-perfused+versus+blood-perfused+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Thorac+Cardiovasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Comparison of ischemic vulnerability and responsiveness to cardioplegic protection in crystalloid-perfused versus blood-perfused hearts.</a> J Thorac Cardiovasc Surg. 103, 960-968 (1992).</li>
<li>Cotter, D. G., Schugar, R. C., Crawford, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ketone+body+metabolism+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ketone body metabolism and cardiovascular disease.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 304, H1060-H1076 (2013).</li>
<li>Huang, Y., Zhou, M., Sun, H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branched-chain+amino+acid+metabolism+in+heart+disease%3A+an+epiphenomenon+or+a+real+culprit%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Branched-chain amino acid metabolism in heart disease: an epiphenomenon or a real culprit?</a> Cardiovasc Res. 90, 220-223 (2011).</li>
<li>Buse, M. G., Biggers, J. F., Friderici, K. H., Buse, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidation+of+branched+chain+amino+acids+by+isolated+hearts+and+diaphragms+of+the+rat.+The+effect+of+fatty+acids%2C+glucose%2C+and+pyruvate+respiration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxidation of branched chain amino acids by isolated hearts and diaphragms of the rat. The effect of fatty acids, glucose, and pyruvate respiration.</a> J Biol Chem. 247, 8085-8096 (1972).</li>
<li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heart+is+better+protected+against+myocardial+infarction+in+the+fed+state+compared+to+the+fasted+state%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">The heart is better protected against myocardial infarction in the fed state compared to the fasted state.</a> Metabolism. 63, 127-136 (2014).</li>
<li>Niu, Y. G., Hauton, D., Evans, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+triacylglycerol-rich+lipoproteins+by+the+working+rat+heart%3A+routes+of+uptake+and+metabolic+fates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Utilization of triacylglycerol-rich lipoproteins by the working rat heart: routes of uptake and metabolic fates.</a> J Physiol. 558, 225-237 (2004).</li>
<li>Goodwin, G. W., Arteaga, J. R., Taegtmeyer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycogen+turnover+in+the+isolated+working+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Glycogen turnover in the isolated working rat heart.</a> J Biol Chem. 270, 9234-9240 (1995).</li>
<li>Sender, P. M., Garlick, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+rates+of+protein+in+the+Langendorff-perfused+rat+heart+in+the+presence+and+absence+of+insulin%2C+and+in+the+working+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Synthesis rates of protein in the Langendorff-perfused rat heart in the presence and absence of insulin, and in the working heart.</a> Biochem J. 132, 603-608 (1973).</li>
<li>Hindlycke, M., Jansson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+tolerance+and+pancreatic+islet+blood+flow+in+rats+after+intraperitoneal+administration+of+different+anesthetic+drugs%5BTitle%5D)+AND+%22Ups+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Glucose tolerance and pancreatic islet blood flow in rats after intraperitoneal administration of different anesthetic drugs.</a> Ups J Med Sci. 97, 27-35 (1992).</li>
<li>Zuurbier, C. J., Keijzers, P. J., Koeman, A., Van Wezel, H. B., Hollmann, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia%27s+effects+on+plasma+glucose+and+insulin+and+cardiac+hexokinase+at+similar+hemodynamics+and+without+major+surgical+stress+in+fed+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Anesth+Analg%22%5BJournal%5D)">Anesthesia's effects on plasma glucose and insulin and cardiac hexokinase at similar hemodynamics and without major surgical stress in fed rats.</a> Anesth Analg. 106, 135-142 (2008).</li>
<li>Oguchi, T., Kashimoto, S., Yamaguchi, T., Nakamura, T., Kumazawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pentobarbital+appropriate+for+basal+anesthesia+in+the+working+rat+heart+model%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Is pentobarbital appropriate for basal anesthesia in the working rat heart model?</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 29, 37-43 (1993).</li>
<li>Segal, J., Schwalb, H., Shmorak, V., Uretzky, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+anesthesia+on+cardiac+function+and+response+in+the+perfused+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Effect of anesthesia on cardiac function and response in the perfused rat heart.</a> J Mol Cell Cardiol. 22, 1317-1324 (1990).</li>
<li>Webster, I., Smith, A., Lochner, A., Huisamen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sanguinarine+non-+versus+re-circulation+during+isolated+heart+perfusion--a+Jekyll+and+Hyde+effect%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Drugs+Ther%22%5BJournal%5D)">Sanguinarine non- versus re-circulation during isolated heart perfusion--a Jekyll and Hyde effect?</a> Cardiovasc Drugs Ther. 28, 489-491 (2014).</li>
<li>Belke, D. D., Larsen, T. S., Lopaschuk, G. D., Severson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+and+fatty+acid+metabolism+in+the+isolated+working+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Glucose and fatty acid metabolism in the isolated working mouse heart.</a> Am J Physiol. 277, R1210-R1217 (1999).</li>
<li>Iannaccone, P. M., Jacob, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rats%21+%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Rats! </a> Dis Model Mech. 2, 206-210 (2009).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

前述方案详细描述了在离体工作大鼠心脏中同时定量测定葡萄糖氧化和脂肪酸氧化底物通量的方法。随后可将这些测量结果与记录的心脏功能参数叠加，以确定在基础状态和应激条件下（如负荷变化、缺血-再灌注）底物代谢与心脏做功之间的关系。 等等……还可以评估诸如心力衰竭和糖尿病等既往疾病状态对代谢与收缩功能关系的影响。此外，可利用基因修饰啮齿类动物的心脏来探究特定蛋白质对心肌代谢和功能的作用。最后，这些参数还可用于单独测试药物及其他循环因子的影响。由于葡萄糖经糖酵解的通量并不总是与葡萄糖氧化速率相关，因此在单次实验条件下同时监测葡萄糖在两条通路中的代谢速率可能更具信息价值。
糖酵解速率可通过向灌注缓冲液中添加[5-3H]葡萄糖来测定，因为3H2O的释放由糖酵解过程中烯醇化酶步骤的活性决定20。 alternatively，可使用[2-3H]葡萄糖，其在糖酵解途径的磷酸葡萄糖异构酶步骤中产生3H2O，以检测心肌对葡萄糖的摄取速率<s...

临床相关性
在哺乳动物心脏中，氧化代谢途径中的底物通量、ATP生成与心脏做功之间存在显著的正相关关系1。在过去二十年中，对心脏代谢与功能之间复杂联系的研究表明，在不同类型的心脏疾病背景下，心脏代谢的改变是导致收缩功能障碍以及可能引发病理性结构重塑的原因2-4。因此，深入理解应激心脏代谢重构的调控机制，有望发现用于预防或治疗心力衰竭的治疗靶点5-7。美国心脏协会近期发布的关于&#34;评估心脏代谢&#34;的科学声明，凸显了科学界对该研究领域日益增长的关注8。尽管心脏成像技术的进步现已能够快速、准确地评估心脏形态与功能，但心脏代谢的体内研究仍受限且操作繁琐：核磁共振（NMR）波谱技术和正电子发射断层扫描（PET）成像可用于监测心脏高能磷酸盐代谢及三羧酸循环活性，但这些技术存在运行成本高昂、且无法在稳态条件下确定不同底物对氧化代谢贡献程度的局限性9。迄今为止，离体工作心脏模型仍是唯一可同时实时研究收缩功能与底物进入氧化代谢途径通量的技术7,9。以下实验方案旨在为制备和使用试剂提供指导，以测定离体工作大鼠心脏中底物利用速率。
离体工作大鼠心脏装置
尽管该技术已有近半个世纪的历史，离体工作大鼠心脏制备法仍然是心血管研究中的首选方法之一。与朗根多夫（Langendorff）心脏制备法类似，工作状态下的啮齿类动物心脏提供了一种相对简单、可靠且经济的方法，可在排除其他器官、神经激素及其他循环因子干扰的情况下，独立测定多种心脏参数。但与朗根多夫灌注心脏不同的是，工作心脏能够持续进行接近生理状态的心脏做功，这是产生与生理相关水平的氧化代谢通量的前提条件 体内 条件。通过将灌注缓冲液经连接左心房的插管输送至左心室（LV），当左心室充盈并收缩时，缓冲液在设定的后负荷静水压阻力下经主动脉导管射出。该灌注装置的设计最初由 Neely 及其同事描述10 随后由 Taegtmeyer、Hems 和 Krebs 进行了改进11，但自此之后几乎没有改变。根据原始装置的描述，可通过测定心输出量来评估心脏的收缩功能，仅需使用量筒和秒表即可测量主动脉和冠状动脉的血流。10,11目前，多家供应商提供完整的啮齿类动物心脏灌注系统。这些市售设备可配备流量探头、压力传感器、压力-容积导管，以及用于心脏功能数据采集与分析所需的所有仪器。供应商还提供详尽的文档资料和培训课程，帮助新用户熟悉其设备操作。此外，多篇综述文章也详细介绍了啮齿类动物工作心脏装置的实验方案，以及使用导管测量心脏功能的技术方法。12-15因此，我们仅简要提及灌流装置和记录设备的设置。本方案的主要目的是补充现有信息，描述可同时测定葡萄糖和长链脂肪酸氧化速率的方法，这两种底物是正常心脏中主要的能量来源。本文详细介绍了使用放射性标记能量底物评估心肌氧化代谢的全部步骤，包括试剂和缓冲液的配制、样品的收集与处理，以及数据分析。
方法原理
心肌细胞通过脂肪酸（主要是长链脂肪酸）和碳水化合物（葡萄糖和乳酸）的氧化磷酸化产生收缩所需的大部分能量。心脏的能量储备非常有限，依赖于血液循环持续供应这些能量底物。葡萄糖通过糖酵解途径分解产生丙酮酸，后者由线粒体内膜上的丙酮酸脱氢酶复合体进行脱羧反应。长链脂肪酸从循环中的白蛋白或脂蛋白甘油三酯中释放后，首先在细胞质中被活化为酰基辅酶A（acyl-CoA）分子，随后通过肉碱穿梭系统转运至线粒体基质，进入β-氧化途径。葡萄糖和脂肪酸分解产生的乙酰辅酶A（acetyl-CoA）分子进入三羧酸循环（Krebs循环），生成还原当量（NADH和FADH2），后者通过电子传递链在线粒体内膜上建立质子驱动力，并由ATP合酶催化生成ATP。三羧酸循环中酶促反应的最终副产物为水和二氧化碳。向离体工作心脏灌注14C和3H放射性标记的底物（如14C标记的葡萄糖和3H标记的油酸），将相应产生14CO2和3H2O，这些产物可从冠状静脉流出液中定量回收。通过将离体灌流心脏置于密闭腔室中，并在冠状静脉流出液离开心脏后立即收集，即可实现14CO2的收集。使用小型阴离子交换柱可从冠状静脉流出液中分离并回收3H2O。处理后的样品放射性通过液体闪烁计数器测定，结合所用放射性标记底物的比放射性，即可分别定量测定葡萄糖和脂肪酸在氧化途径中的代谢通量16,17。

<table><tbody><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH₂PO₄）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>P284</td><td></td></tr><tr><td>七水硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;*7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>碳酸氢钠（NaHCO₃）&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙（CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>AG 1-X8 树脂，氯离子型，100 - 200 干燥目数，500 g</td><td>Bio-Rad</td><td>1401441</td><td>此物品可通过直接购买氢氧化物形式来替换&amp;nbsp; （参见下文参考文献），但成本将高出近8倍</td></tr><tr><td>AG 1-X8 树脂，氢氧型，100 - 200 干燥目数，100 g</td><td>伯乐（Bio-Rad）</td><td>1432445</td><td>购买此物品可省去将阴离子交换树脂从氯化物形式转化为氢氧化物形式的步骤（见方案第1.2节）</td></tr><tr><td>玻璃微分析真空过滤器支架</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-753-2</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠（NaOH）</td><td>Fisher Scientific</td><td>S318</td><td>腐蚀性物质。请查阅产品材料安全数据表（MSDS），以获取正确的操作和储存方法。</td></tr><tr><td>带烧结圆筒的气体分散管</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-138B</td><td></td></tr><tr><td>Probumin 牛血清白蛋白 无脂肪酸，粉末状</td><td>EMD Millipore</td><td>820027</td><td>建议使用活性炭脱脂的BSA，因为其他纯化工艺（如冷乙醇分级沉淀）可能会残留对心脏有毒性的物质。</td></tr><tr><td>油酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O7501</td><td></td></tr><tr><td>油酸，[9,10-&lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H(N)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NET289005MC</td><td>放射性物质。请遵循所在机构辐射安全办公室关于订购和操作的指导方针。</td></tr><tr><td>透析膜管，29 mm 直径</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-667E</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-葡萄糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖，D-[14C(U)]-</td><td>PerkinElmer</td><td>NEC042B005MC</td><td>放射性物质。请遵循所在机构辐射安全办公室关于订购和操作的指导方针。</td></tr><tr><td>Humulin R U-100</td><td>礼来公司</td><td>NDC 0002-8215-01（HI-210）</td><td></td></tr><tr><td>Inactin Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T133</td><td>美国缉毒局（DEA）管制物质第三类</td></tr><tr><td>3-0 丝线黑色编织线</td><td>Roboz Surgical</td><td>SUT-15-3</td><td></td></tr><tr><td>10x 氢氧化苄基二甲基十二烷基铵</td><td>PerkinElmer</td><td>6003005</td><td>剧毒，可引起严重灼伤。请查阅产品材料安全数据表（MSDS），以获取正确的操作与储存方法</td></tr><tr><td>20 ml 玻璃闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-341-25E</td><td>使用玻璃小瓶以实现定量回收 &lt;sup&gt;14&lt;/sup&gt;CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>20 ml HDPE 闪烁瓶</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-23B</td><td>使用HDPE小瓶进行定量回收 &lt;sup&gt;3&lt;/sup&gt;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>红色橡胶套管塞</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-126DD</td><td>20 mL 闪烁瓶；可重复使用</td></tr><tr><td>BD PrecisionGlide 针头 23G × 40 mm</td><td>BD</td><td>305194</td><td>用于通过CO的橡胶套管塞注入高氯酸&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 陷阱</td></tr><tr><td>高氯酸，60%</td><td>Fisher Scientific</td><td>A228</td><td>具有强腐蚀性，可能起氧化剂作用和/或引起爆炸危险。请查阅产品材料安全数据表（MSDS）以获取正确的操作和储存方法</td></tr><tr><td>Ultima Gold，闪烁液混合物</td><td>PerkinElmer</td><td>6013327</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棉</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC38606</td><td></td></tr><tr><td>Decon Dri-Clean 洗涤剂粉末</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355</td><td>用于玻璃器皿、塑料部件和管路的清洗</td></tr><tr><td>Alconox Tergazyme 酶活性粉状清洁剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-000-115</td><td>用于清洗 &quot;难以到达&quot; 被脂肪酸-BSA 残留物污染的表面（管路、玻璃器皿）</td></tr></tbody></table>

离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的测定方法

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

哺乳动物心脏是ATP的主要消耗器官，需要持续供应能量底物以维持收缩功能。因此，心肌代谢的改变与收缩功能障碍及心力衰竭的发生密切相关也就不足为奇。揭示代谢与收缩功能之间的关联，将有助于阐明心脏在疾病状态下适应性或失代偿性变化的部分机制。离体工作大鼠心脏制备技术可用于实时、同步监测心脏收缩功能以及能量底物进入氧化代谢途径的流量。本实验方案旨在详细描述用于制备和使用缓冲液的方法，以定量测定葡萄糖和脂肪酸（心脏主要能量底物）的氧化速率。同时讨论了样品分析与数据解读所采用的方法。简而言之，该技术基于向心脏灌注 14C-放射性标记的葡萄糖和一种 3H-放射性标记的长链脂肪酸 离体 通过常温晶体液灌注维持跳动的心脏。 14CO2 和 3H2O，这些供能底物在酶促反应中产生的终末产物，随后从冠状窦流出液中被定量回收。结合所用放射性标记底物的比活性数据，即可分别定量测定葡萄糖和脂肪酸在氧化途径中的通量。利用适当的记录设备，可同时测定离体心脏的收缩功能，并将其直接与代谢通量数值进行关联分析。该技术对于研究在不同应激条件下（如前负荷和后负荷改变、缺血、药物或循环因子作用）或基因产物表达改变后，代谢与收缩功能之间的关系极为有用。

下图描述了两个代表性实验。在这两个实验中，均采用前述方案制备的KH缓冲液，对16周龄雄性Sprague Dawley大鼠的心脏进行离体工作模式灌流。在每个实验中，心脏均受到某种应激条件处理以影响其做功。通过将压力传感器插入主动脉管路连续记录脉压，并测定心脏功率，以评估心肌收缩功能。同时通过测定葡萄糖和油酸氧化速率，确定每种应激条件对能量底物利用的影响。
在第一次实验中，通过将后负荷增加40%（通过手动升高主动脉溢流室实现）并在灌注缓冲液中添加肾上腺素（1 µmol/L），在接近生理负荷条件下灌注20分钟后模拟了工作负荷的急性增加（图3A）。心率可通过脉搏压曲线上收缩压峰值之间的时间间隔测定，在工作负荷骤增后立即上升超过50%（图3B）。在工作负荷增加时，心脏做功提高了40%以上，同时葡萄糖和油酸氧化速率均上升（图3C）。结果表明，在急性工作负荷增加的应...

以下方案描述了用于定量测定离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的缓冲液的配制与使用方法。同时讨论了样品分析和数据解读所采用的方法。

哺乳动物心脏是ATP的主要消耗器官，需要持续供应能量底物以维持收缩功能。毫不奇怪，……的改变会……

本实验的总体目标是，在离体工作状态的大鼠心脏中，同步实时测定心肌葡萄糖氧化速率和脂肪酸氧化速率，以及心脏收缩功能。该方法有助于回答心血管领域中的关键科学问题，例如心脏如何在代谢层面适应能量需求的急性变化，以及在病理状态下这些代谢响应如何受到影响。该技术的主要优势在于，它使研究人员能够完全控制环境变量，例如输送至心脏的底物、药物或激素的种类和浓度。主要研究人员为密西西比大学医学中心心血管 Reno 资源中心的博士后研究员 Bhavisha Bakrania。实验开始时，启动泵以预充灌流装置并为缓冲液供氧。准备好材料后，对大鼠进行麻醉并实施手术准备。剪除腹部毛发，沿中线做切口并向两侧延伸。将胃和肠道移开以暴露下腔静脉，注入 200 USP 单位肝素。等待5到10秒，然后使用剪刀剪开膈肌及肋骨两侧，以暴露胸腔内容物。接着用手轻轻抓住心脏，将心脏和肺一起完整切除。在降主动脉水平进行剪切，注意避免损伤主动脉弓和升主动脉。立即把心脏和肺转移到盛有冰冷KH缓冲液的解剖皿中。待心脏停止跳动后，需学会快速操作，以便在一分至两分钟内重新启动心脏。现在将心脏和肺浸入另一盛有冰冷KH缓冲液的器皿中。迅速剪除肺组织的大块残留，然后在主动脉弓上方切断降主动脉。后续操作需采取放射性物质使用所需的安全防护措施。接着，用镊子小心打开主动脉，并将心脏沿套管向上推入。务必小心，切勿使套管进入主动脉通路，否则可能导致心脏灌注不足以及主动脉瓣受损。现在，使用微型夹固定连接处，并开始进行离体心脏（Langendorff）灌流。不慌不忙地使用3-0丝线将主动脉固定在主动脉套管上，随后移除微型夹。然后定位肺静脉，并根据需要修剪掉非心脏组织。保留足够的组织以将左心房固定在插管上。左心房插管是本方案中第二关键的步骤，插管插入不当或存在漏液均会减弱心肌收缩力，并影响代谢速率的定量分析。接下来，以与右侧插管相同的方法制备左心房引流插管。然后用镊子轻轻夹住肺静脉开口，将心脏沿心房插管向上滑动。根据需要移动组织，注意不要弯曲主动脉或过度牵拉心脏。然后用3-0丝线固定套管。最后打开心房管路，同时将主动脉管路切换至工作模式。如果缓冲液从左心房泄漏，则关闭心房管路，并切换回Langendorff模式。然后使用更多缝线以更好地固定套管，并再次尝试切换至工作模式。如果实验包括通过导管直接测量左心室功能，则首先使用26号针头穿刺左心室心尖，插入压力-容积导管，并将导管轴与左心室长轴对齐。然后将远端电极E1置于主动脉瓣下方、紧邻心内膜边界处，将近端电极E4置于心室壁内侧稍靠内位置。现在将心脏密封于一个带水套的腔室中。然后在软件中开始监测功能参数。待基线参数稳定至少五分钟之后，开始记录数据。为测量冠状动脉血流，记录收集 20 毫升流出液所需的时间。然后通过三通旋塞将 2 毫升流出液吸入注射器，弃去其余部分。立即将这 2 毫升样品转移

methods-for-determination-rates-glucose-fatty-acid-oxidation-isolated

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

为葡萄糖和脂肪酸氧化率在大鼠离体的测定方法

本研究的目的是在生理前负荷和后负荷压力条件下，监测离体心脏的线粒体氧化还原状态。本文介绍了一种双心室工作状态的兔心脏模型。通过高时空分辨率的NADH荧光成像，监测心外膜组织中线粒体的氧化还原状态。...

离体双心室工作兔心脏的NADH荧光成像

经皮穿刺针活检获取的骨骼肌组织中分离线粒体的制备与呼吸测定评估

从头脂肪生成和β-脂肪酸氧化是肝细胞中的关键代谢途径，这些途径在多种代谢性疾病（包括脂肪肝病）中发生紊乱。本文中，我们演示了小鼠原代肝细胞的分离，并描述了β-脂肪酸氧化和脂肪生成的定量方法。...

小鼠原代肝细胞中脂肪酸氧化与脂质生成的测定

本文所述方法提供了利用少量小鼠骨骼肌分离的线粒体进行基于微孔板的呼吸测定实验的逐步操作指南。这些实验能够检测常用动物模型中线粒体氧消耗的机制性变化与适应性改变。...

使用小鼠骨骼肌微量组织分离线粒体进行高通量微孔板呼吸测定

糖酵解是多种生物系统中一个关键的代谢标志。通过测量细胞外H+通量来监测糖酵解是常见的方法，但需要进行校正才能实现定量和明确的结果。本文演示如何采集并校正细胞外通量数据，以区分细胞外酸化的呼吸源性和糖酵解源性贡献。...

测量与分析细胞外酸产生以确定糖酵解速率

代谢研究在免疫学领域中的重要性日益凸显。本文介绍了一种优化的方法，用于检测小鼠脾细胞以及T和B淋巴细胞的糖酵解和线粒体呼吸作用。...

一种优化的分析淋巴细胞糖酵解和线粒体呼吸的实验方案

本文介绍了一种在灌注心脏中使用心室内光学导管的方法，用于对心脏壁进行跨壁吸收光谱分析。所获得的数据可在此广泛应用的实验模型中，同步提供关于组织氧张力、底物利用和膜电位的信息，同时结合心脏功能的测量指标。...

用于灌注哺乳动物心脏跨壁吸收光谱监测细胞代谢的腔内心脏侧向发光导管

肌肉葡萄糖摄取的完整调控对维持机体葡萄糖稳态至关重要。本方案介绍了在分离并孵育的成熟骨骼肌中，评估胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取方法，用于阐明各种生理干预对机体葡萄糖代谢的影响。...

小鼠分离并孵育的成熟骨骼肌中胰岛素和收缩刺激的葡萄糖摄取测定

脂肪酸β-氧化是一种重要的代谢途径，在包括肝细胞在内的多种细胞类型中负责能量生成。本文介绍一种利用14C标记的棕榈酸测定 freshly isolated primary...

新鲜分离小鼠肝细胞悬液中脂肪酸β-氧化的测定

本文介绍了一种详细的实验方案，用于开展线粒体应激检测和糖酵解速率检测 离体...

Ex Vivo 视网膜组织样本中线粒体呼吸和糖酵解的测定

我们描述了一种实验装置，可用于在持续灌注模式下向离体灌注的小鼠心脏输注超极化13C标记的代谢物。采用专门的13C核磁共振（NMR）采集方法，可实时定量测定代谢酶活性；同时通过多参数31P-NMR分析，测定组织中的ATP含量和pH值。...

使用超极化 [1-13C]丙酮酸及 13C/31P 核磁共振波谱法研究离体灌注小鼠心脏的代谢

学习在大鼠离体工作心脏中同时测定葡萄糖氧化率和脂肪酸氧化率的方法。该技术可实时评估心肌代谢适应与心脏收缩功能，为心血管疾病研究提供精确的代谢分析框架。

离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的测定方法

探索更多视频