离体工作大鼠心脏中葡萄糖和脂肪酸氧化速率的测定方法

本实验的总体目标是，在离体工作状态的大鼠心脏中，同步实时测定心肌葡萄糖氧化速率和脂肪酸氧化速率，以及心脏收缩功能。该方法有助于回答心血管领域中的关键科学问题，例如心脏如何在代谢层面适应能量需求的急性变化，以及在病理状态下这些代谢响应如何受到影响。

该技术的主要优势在于，它使研究人员能够完全控制环境变量，例如输送至心脏的底物、药物或激素的种类和浓度。主要研究人员为密西西比大学医学中心心血管 Reno 资源中心的博士后研究员 Bhavisha Bakrania。实验开始时，启动泵以预充灌流装置并为缓冲液供氧。

准备好材料后，对大鼠进行麻醉并实施手术准备。剪除腹部毛发，沿中线做切口并向两侧延伸。将胃和肠道移开以暴露下腔静脉，注入 200 USP 单位肝素。

等待5到10秒，然后使用剪刀剪开膈肌及肋骨两侧，以暴露胸腔内容物。接着用手轻轻抓住心脏，将心脏和肺一起完整切除。在降主动脉水平进行剪切，注意避免损伤主动脉弓和升主动脉。

立即把心脏和肺转移到盛有冰冷KH缓冲液的解剖皿中。待心脏停止跳动后，需学会快速操作，以便在一分至两分钟内重新启动心脏。现在将心脏和肺浸入另一盛有冰冷KH缓冲液的器皿中。

迅速剪除肺组织的大块残留，然后在主动脉弓上方切断降主动脉。后续操作需采取放射性物质使用所需的安全防护措施。接着，用镊子小心打开主动脉，并将心脏沿套管向上推入。

务必小心，切勿使套管进入主动脉通路，否则可能导致心脏灌注不足以及主动脉瓣受损。现在，使用微型夹固定连接处，并开始进行离体心脏（Langendorff）灌流。不慌不忙地使用3-0丝线将主动脉固定在主动脉套管上，随后移除微型夹。

然后定位肺静脉，并根据需要修剪掉非心脏组织。保留足够的组织以将左心房固定在插管上。左心房插管是本方案中第二关键的步骤，插管插入不当或存在漏液均会减弱心肌收缩力，并影响代谢速率的定量分析。

接下来，以与右侧插管相同的方法制备左心房引流插管。然后用镊子轻轻夹住肺静脉开口，将心脏沿心房插管向上滑动。根据需要移动组织，注意不要弯曲主动脉或过度牵拉心脏。

然后用3-0丝线固定套管。最后打开心房管路，同时将主动脉管路切换至工作模式。如果缓冲液从左心房泄漏，则关闭心房管路，并切换回Langendorff模式。

然后使用更多缝线以更好地固定套管，并再次尝试切换至工作模式。如果实验包括通过导管直接测量左心室功能，则首先使用26号针头穿刺左心室心尖，插入压力-容积导管，并将导管轴与左心室长轴对齐。然后将远端电极E1置于主动脉瓣下方、紧邻心内膜边界处，将近端电极E4置于心室壁内侧稍靠内位置。

现在将心脏密封于一个带水套的腔室中。然后在软件中开始监测功能参数。待基线参数稳定至少五分钟之后，开始记录数据。

为测量冠状动脉血流，记录收集 20 毫升流出液所需的时间。然后通过三通旋塞将 2 毫升流出液吸入注射器，弃去其余部分。立即将这 2 毫升样品转移至微量离心管中，并取 0.5 毫升等分试样用于测定葡萄糖氧化速率。

将剩余样品置于冰上保存。持续定期采集冠状静脉回流液样本，并在结束前，向心房导管注入 10 µL 高渗盐水，注射位置为即将连接套管之前的导管处。

利用此团注的反应来计算并行电导，以准确测定心脏容积。接下来，打开心室腔并移除左心室内的导管。然后将心脏从插管上剪下，放入冰冻的KH缓冲液中。迅速用纸巾吸干心脏表面水分，并称量其湿重。

称重后，立即解剖所需的组织样本，然后用预冷于干冰上的镊子夹取剩余组织并速冻。预先在玻璃闪烁瓶中加入一毫升10倍浓度的氢氧化四甲基铵，每个冠状窦流出液样本准备一瓶，另加两瓶作为对照。

一旦将样品瓶装入，立即直接放入已装好的闪烁瓶中。进行分析时，用橡胶套塞小心地盖紧瓶口，并使用封口膜密封瓶口。然后，使用带有长23号针头的1毫升注射器，通过橡胶套注入200微升60%高氯酸。

让所有样品瓶静置过夜。第二天，用镊子小心取出每个样品管，并在敞口的样品瓶上方用一毫升闪烁液冲洗其底部，以回收全部的氢氧化羟胺。然后向每个样品瓶中再加入九毫升闪烁液。

为获得特异性活性，向其中两个小瓶中各加入0.5毫升灌注缓冲液。随后剧烈振荡小瓶，并静置至少六小时后再进行测量。为测定心肌油酸氧化速率，首先为每个样品准备一个阴离子交换树脂柱。

只需用玻璃棉填充三支3 mL注射器管的管尖。然后使用移液管将树脂水浆液加至每根层析柱的2 mL刻度处。接着，用超纯水冲洗树脂，每根柱子用2 mL超纯水冲洗三次。

然后将闪烁小瓶置于层析柱下方，并向柱中加入0.5毫升冠脉流出液。进行本底测定时，使用灌注缓冲液代替。接着，依次用0.5毫升、1毫升和最后2毫升的超纯水洗脱层析柱。

弃去层析柱。然后向样品瓶中加入13毫升闪烁液。为测定比活性，直接向两个装有13毫升液体闪烁液的样品瓶中各加入0.5毫升灌注缓冲液。

剧烈振荡小瓶，静置六小时以上，然后进行测量。从两只16周龄大鼠中分离心脏，并施加不同的应激条件。对于其中一只心脏，通过将后负荷增加40%并在灌注缓冲液中添加肾上腺素，模拟其工作负荷的急性增加。

在工作负荷突然增加后，心率立即上升超过50%。心脏做功在负荷突增时提高了40%以上，同时伴随葡萄糖和油酸氧化速率的升高。葡萄糖氧化相对于基线的增幅尤为显著。

另一颗心脏则经历15分钟的全心缺血和30分钟的再灌注。在这些实验条件下，再灌注数分钟后脉压接近正常水平。10分钟内，心脏做功迅速升高至超过缺血前水平，随后恢复至接近基线水平。

这是由于油酸氧化增加所致，而葡萄糖氧化则迅速恢复至缺血前水平。若操作熟练，心脏的分离及以工作模式进行初始再灌注可在五分钟内完成。

完成此操作后，可进一步采用其他方法（如RNA和蛋白质表达分析）来回答更多问题，例如药物或应激条件对分子信号通路的影响。请注意，使用放射性示踪剂可能具有极高危险性，在执行本操作时，必须始终采取预防措施，例如穿戴全套个人防护装备。