Name: 自旋饱和转移差异核磁共振（NMR SSTD）:一种新的工具来获得化学交换过程的动力学参数 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
Description: 学习自旋饱和转移差异核磁共振（SSTD NMR）方法，用于获取有机和有机金属分子化学交换过程的动力学参数。该技术无需信号合并即可同时测定速率常数和弛豫时间，为研究分子动力学提供高效工具。

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感谢东英吉利大学、英国工程与自然科学研究委员会（EPSRC，项目编号 EP/L012855/1）以及欧盟（H2020-MSCA-IF-2014-EF-ST-658172）提供的经费支持（MTQ）。

注意：使用前请查阅所有相关的材料安全数据表（MSDS）。

1. 核磁共振样品制备
<ol>
	<li>称取 5 mg 的 N,N-二甲基乙酰胺，加入适用于低温的核磁共振管中，并溶于 0.6 ml 甲苯-d8 中。</li>
</ol>
2. 核磁共振实验设置25
<ol>
	<li>NOE谱图采集
	<ol>
		<li>进行一维核奥弗豪泽效应（NOE）实验。26 
		注意：NOE效应可能在任何温度下发生。 在SSTD NMR实验中将被照射信号的一维NOE谱在-40 °C 为确保此处所用样品中的旋转和磁化转移效应降至最低，从而使核奥弗豪泽效应（NOE）（若存在）占主导地位，并在本实验中得以测量。理想情况下，两个交换核之间不应存在NOE效应，以避免对SSTD方法造成干扰。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SSTD NMR 实验设置
	<ol>
		<li>将样品放入磁体中，首先输入 ej 在软件的命令行中输入指令以开启气流。然后将样品放置在磁铁上方，接着输入 ij. 等待样品进入磁体内部。</li>
		<li>样品放入磁体后，输入 edte 在命令行中，将温度改为第一个选定的温度以开始实验（本例中为295.5 K）。让样品在选定温度下稳定至少20分钟。</li>
		<li>进行一维实验 1对样品进行氢核磁共振（H-NMR）实验。
		<ol>
			<li>创建一个新的数据集 a 1H-NMR 实验。点击 文件/新建，为新实验命名。</li>
			<li>依次输入并等待前一个命令执行完成： 锁定, atma, 顶垫片, getprosol 和 rga.</li>
			<li>类型 zg 以获取质子实验数据。完成后输入 efp 和 apk 进行傅里叶变换并调整相位。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>创建一个新的数据集，例如一个 1氢核磁共振（1H NMR）实验。为此，请点击文件（FILE）/新建（NEW），并为新实验命名。</li>
		<li>在此新数据集中，类型 rpar 在命令行中。从列表中选择一个“STDDIFF”参数集，例如 STDDIFFESGP，然后点击“读取”和“读取全部”（图1）。或者，通过键入 rpar STDDIFFESGP 全部. 
		注意：本实验可使用此脉冲序列进行。然而，我们实验中使用的脉冲程序为 STDDIFF。</li>
		<li>要选择 STDDIFF 脉冲序列，请点击 PULPROG 行中带有三个点的按钮（图2 和 3).</li>
		<li>在进行SSTD NMR实验之前，校准 1H 90° 硬脉冲（p1）。为此，请确保样品已置于磁体中并达到所需温度（步骤 2.2.2）。输入 脉冲校准 在命令行中并复制该值 90° 在较高功率下脉冲（此处 pl1 = -1 dB） 即， 脉冲最短的那个图4).</li>
		<li>输入实验中已校准的硬脉冲参数值。 getprosol 1H （步骤 2.2.7 中获得的 p1 值）（pl1 的值）图5).</li>
		<li>设置整形脉冲的长度。输入 p13 并引入一个值 50,000 µsec (图6).</li>
		<li>设置选择性脉冲形状。为此，请进入功率设置，然后点击 SHAPE 旁边的“编辑…”按钮图7）。转至整形脉冲 13 并选择： Gaus 1.1000 (图8).</li>
		<li>设置选择性脉冲功率（SP13）。设置为合适的值， 即，在此系统上介于 40–60 dB 之间（对应场强约为 120 Hz）（图8过高的场强可能导致无法接受的饱和效应。27-29 
		注意：50 dB 在我们的情况下为最佳值。需注意这是衰减刻度，数值越小，射频功率越高。该参数对应饱和高斯级联，需持续施加较长时间（数秒）。 sp13 不应低于 40 dB（如有需要，请参考仪器说明书，因为高功率下的长脉冲可能会损坏探头）。根据我们的经验，硬脉冲衰减以上 41–61 dB 1H 90° 脉冲（本研究中为 -1 dB）效果良好。应始终选择尽可能高的衰减，以达到相似的饱和水平。</li>
		<li>类型 无内容可供翻译。 并将其设置为 8，然后输入 ds 并将其设置为 4。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 核磁共振数据采集与处理25
<ol>
	<li>SSTD NMR 实验采集
	<ol>
		<li>打开 1在2.2.3步骤中执行氢核磁共振（¹H NMR）实验，以确定将要照射的信号位置。为此，在软件浏览器中查找该实验，右键点击数据集，然后选择“在新窗口中显示”。</li>
		<li>将光标线移至待照射信号的中心位置，并记录以 ppm 为单位的化学位移。选择实验中将使用 的谱宽。 
		注意：本实验中需照射的信号位于 2.17 ppm，所用谱宽为 1.46 ppm。请确保未使用化学位移校正，否则可能导致照射频率设置错误。</li>
		<li>转到之前创建的 SSTD NMR 实验，该实验的设置如第 2.2 节所述。</li>
		<li>创建一个包含照射频率的列表。为此，请输入 fq2list 在命令行中选择一个现有列表。</li>
		<li>编辑辐照频率列表，包含以下数据的前3行（图9): 第1行。P (表示以下数据单位为 ppm； 第2行. 待照射信号的频率，以 ppm 为单位，按 3.1.1 测定；第 3 行 3.40 ppm （一个远离的频率） 1该化合物的H信号，因此在此频率下的照射不会影响谱图。</li>
		<li>以新名称保存列表，然后输入 fq2list 在命令行中选择刚刚创建的列表。</li>
		<li>为了将实验聚焦于所研究的信号，输入 o1p 选择将要照射的信号的化学位移作为实验中心。</li>
		<li>类型 sw 选择谱宽（此处为1.46 ppm，但也可选择其他任意谱宽）。 
		注意：如果更改谱宽后获得的采集时间过长（这将导致谱图中引入更多噪声），可通过输入命令进行调整 AQ 以获得所需的自由感应衰减（FID）分辨率（FIDRES，此处为 0.25 Hz）。</li>
		<li>选择扫描间松弛延迟的时间值 D1确保其值至少为 T 的 1 到 5 倍1 最慢松弛的 质子 
		注意：我们将其设置为 40 秒，这是最长的饱和时间（D20)。通过这种方式，所有实验的每次扫描总时间（延迟时间 + 饱和时间 + 脉冲 + 采集时间）保持一致。</li>
		<li>类型 D1 并将其设置为 40 秒。</li>
		<li>通过输入设置饱和时间的第一个值 D20 并将其设置为 40 秒。确定接收增益（rg) 通过键入自动完成 rga.</li>
		<li>通过输入创建下一个实验 iexpno类型 D20 在此实验中选择20秒的饱和时间。输入rga以自动确定 rg.</li>
		<li>重复上一步骤 D20 = 10, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.3 秒</li>
		<li>所有实验创建完毕后，打开第一个实验，在命令行中输入 multizg 并指明实验次数，此处为 8 次（即, multizg 8).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SSTD NMR 实验数据处理
	<ol>
		<li>打开该组中实验编号（EXPNO 1）的流程编号（PROCNO 1）（选择饱和时间较长的那一个）。</li>
		<li>在命令行中输入 磅 并将数值设置为 1.5。 
		注意：对于信噪比非常高的谱图，该值可适当降低；反之，对于噪声较大的实验，若谱图分辨率未受到严重影响，该值可适当提高。</li>
		<li>在命令行中输入 efp 并处理 FID # = 1（“在共振频率”谱图）于 PROCNO = 2图10).</li>
		<li>通过点击校正实验的相位 交互式相位校正 按钮，并将其保存为二维实验。保存并退出（图11).</li>
		<li>类型 重复 1 在命令行中输入以进入 PROCNO 1。</li>
		<li>在命令行中输入 efp 并处理 FID # = 2（“离共振”谱）于 PROCNO = 3图12).</li>
		<li>在命令行中输入 .md 然后 重复 2 显示一个包含两个处理后谱图的多窗口显示：2（中间信号饱和的谱图）和3（在40 ppm处施加饱和脉冲序列的谱图）图13).</li>
		<li>点击带有三角符号的按钮（图13) 计算差谱并将其保存在 PROCNO 4 中。退出多显示窗口。</li>
		<li>为左侧信号（即观察化学交换过程导致饱和转移的信号）选择积分范围。在 PROCNO 3 和 PROCNO 4 中始终对相同区域进行积分。 
		注意：本实验采用的积分范围为 2.55 - 2.67 ppm。</li>
		<li>整合完成后，转至各实验中的“Integrals”选项卡，复制“Integral [abs]”的数值图14).</li>
		<li>将 PROCNO 4 中的积分除以 PROCNO 3 中的积分，即为 η 的值SSTD 饱和时间为 40 秒（ηSSTD =自旋饱和转移差参数.21</li>
		<li>对其他具有不同饱和时间的实验重复该步骤。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 数据分析30
<ol>
	<li>获取动力学参数的数据分析
	<ol>
		<li>绘制所得 ηSSTD 值随饱和时间的变化曲线。21</li>
		<li>对获得的曲线进行指数拟合，使其符合以下方程 
		<img alt="静态平衡方程 η_STD；数学公式；指数衰减过程。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 
		<img alt="δ 等于动力学常数方程。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 2"> 
		<img alt="η_SSTD^MAX 公式；效率优化；研究关键词；教育符号使用。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 3">= <img alt="η&lt;sub&gt;SSTD&lt;/sub&gt; 符号用于静态或动态效率分析的科学方程中。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 4"> 在极长饱和时间下 
		t = 时间</li>
		<li>计算 ηSSTDMAX 和 δ 的值，并根据以下方程用于计算速率常数（k）和弛豫时间（T1A）： 
		<img alt="最大效率与δ公式；方程；教育用途；数学分析。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 5"> 
		T1A = 自旋A的纵向弛豫时间常数 
		k = 双位点交换动力学速率常数
		<ol>
			<li>通过下式获得动力学速率常数：<img alt="显示 k = ηSSTD (MAX) · δ 的方程，用于科学分析与研究。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 6"></li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>利用Eyring图获取热力学参数
	<ol>
		<li>以不同温度下的动力学速率值为基础，绘制 ln(k/T) 对 1/T 的图（T = 绝对温度）。</li>
		<li>对所得数据进行线性拟合，使其符合Eyring方程： 
		<img alt="Arrhenius方程，ln(k/T)=ln(kB/h)-ΔH‡/RT+ΔS‡/R，热力学，动力学公式。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 7"> 
		<img alt="活化焓公式，ΔH‡，化学动力学方程中的表示。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 8"> 
		<img alt="活化熵，ΔS‡，定义符号，热力学概念。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 9"> 
		<img alt="普朗克常数方程，h=普朗克常数，量子物理，科学概念。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 10"> 
		R = 气体常数 
		kB = 玻尔兹曼常数 
		T = 绝对温度</li>
		<li>计算热力学参数 ΔH≠ 和 ΔS≠。</li>
		<li>使用以下方程计算 EA(298) 和 ΔG≠(298) 的值： 
		<img alt="活化能方程：\(E_A(298)=\Delta H^\ddagger+RT\)，热力学，公式。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 11"> 
		<img alt="298 K时的吉布斯自由能方程，ΔG‡ = ΔH‡ - TΔS‡，热力学公式。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 12"> 
		<img alt="活化能方程，\(E_{A(298)}\)，温度298 K，化学动力学概念。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 13"> 
		<img alt="298 K时吉布斯能的静态平衡公式 ΔG°(298)，方程关键概念。" src="/files/ftp_upload/54499/54499eq14.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 14"> 
		 </li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Bain, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+Exchange+in+NMR%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Nuc.+Mag.+Res.+Spect%22%5BJournal%5D)">Chemical Exchange in NMR.</a> Prog. Nuc. Mag. Res. Spect. 43, 63-103 (2003).</li>
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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

该方法的一个显著优势在于，仅需一组实验即可获得特定温度下的速率常数和弛豫时间，并且所用脉冲序列具有良好的稳健性（与用于研究蛋白质-配体相互作用的STD实验所采用的序列相同，通常包含在仪器厂商提供的标准实验程序中）。由于无需测量T1或达到稳态饱和，该方法简化了实验设置。此外，值得注意的是，与依赖磁场强度的共熔法不同，该方法不受磁体强度的影响。然而，其主要局限性在于，该技术无法适用于交换速率过快或过慢的化学交换过程，这取决于核磁共振仪的温度范围或所用溶剂的性质。
这种用于计算动力学参数的新技术可适用于多种底物，其适用性已在一些有趣的分子中得到验证21。对于4-N,N-二甲氨基[2.2]对环芳烃这一具有挑战性的底物，其中一个目标甲基信号与其他分子信号重叠，但其动力学参数仍成功地通过SSTD核磁共振（NMR）方法得以计算。有趣的是，只要待研究的信号之一是独立分辨的，该方法即可适用。SSTD NMR 还是一种可用于计算分子动力学参数的有效方案，尤其适用于那些发生信号聚并的温度过高、导致分子在达到该温度前即发生分解的情况。例如 PtCl2(二甲基丙二烯)(吡啶) 就属于此类情况，而该方法在无需达到聚并温度的条件下即成功应用。溶剂和温度的选择对于获得良好结果至关重要，因为化学交换速率会随这些参数发生显著变化。此外，除了常规核磁共振实验中的标准要求外，SSTD NMR 实验的关键步骤还包括照射的选择性以及温度的精确控制。这两个因素都必须精确，以确保实验的成功。
此处展示的代表性结果是关于分子内化学交换的动力学，但该技术也可用于研究分子间化学交换以及配体交换的动力学，这些过程在过渡金属配合物的动态行为中十分常见。
最后，若对相关方程进行适当的修正32，该方法还可拓展用于处理多部位交换和布居不等的情况，正如此前的双重共振实验中所实现的那样8-9，从而进一步提升该技术在研究复杂化合物中化学交换过程方面的应用价值。

化学交换通常指任何分子间或分子内过程，其中原子核从一个环境转移到另一个环境，且其核磁共振参数（化学位移、标量耦合、偶极耦合、弛豫速率）在新环境中发生变化。在有机分子和有机金属分子中存在大量化学交换的实例。例如， 联芳基化合物的旋转势垒、环翻转势垒与构象平衡、氮原子反转、配体结合、等价配体交换及互变异构。1-3 化学交换速率与交换过程能垒的热力学性质相关，因此研究化学交换速率对于理解这些系统的分子动力学至关重要。
核磁共振中动态交换的典型特征是随着温度变化，核磁共振信号的谱线形状发生显著改变。在低温下，交换过程缓慢，可观察到两个不同的化学位移。在高温下，这两个信号合并为一个信号，这一现象称为&#34;聚并&#34;。在中间温度范围内，信号变得非常宽。核磁共振谱对化学交换的这种敏感性使其成为研究溶液中分子动力学的极为强大的方法。目前主要采用两种方法研究溶液中的动态过程：谱线形状分析4-7和自旋饱和转移实验8-9。此外，还应提及反向转移方法10和CIFIT程序11，它们可直接提取速率常数，对于简单体系的交换测量是一种相对高效的方法。尽管这些方法在大多数情况下能获得很好的结果，但仍存在若干缺点。谱线形状分析的主要缺点是某些样品需要较高温度才能达到聚并条件12。进行自旋饱和转移实验时需考虑的主要问题包括：为在交换位点之间达到稳态饱和转移所需的很长的饱和时间，以及需要测定纵向弛豫时间常数T1，而当研究区域中不同信号发生重叠时，这可能难以实现13。
作为我们对有机金属反应机理研究的一部分14-16，本课题组正在研究铂-丙二烯配合物在溶液中的动态行为。这是一项复杂的工作，涉及至少三种不同的过程，其中之一是金属围绕丙二烯分子某一轴的π面交换或旋转。我们发现，以往在类似体系中常用的变温（VT）实验和谱线线型分析技术17-19在本研究中并不适用，原因是我们的铂-丙二烯配合物旋转速率非常缓慢，导致所关注信号的合并温度高于该配合物的分解温度。
为了克服这一局限性，我们开发并近期报道了一种新的核磁共振（NMR）方案（SSTD NMR），用于研究相互位点间的化学交换过程20。顾名思义，该方法将用于小分子的自旋饱和转移方法与用于研究蛋白质-配体相互作用的饱和转移差值NMR方法21-24相结合，通过测量在发生化学交换的小分子中随饱和时间递增的瞬态自旋饱和转移（即信号增强曲线），实现对交换过程的分析。
通过这种新方法（SSTD NMR），我们证明了可以测定小分子有机和有机金属化合物中分子内化学交换的动力学参数，并且相比传统方法具有一些额外优势：无需信号达到合并状态，因此可在更灵活的温度范围内开展研究；即使存在信号重叠也不受影响，但至少应有一个交换共振信号是独立可分辨的；无需测量T1或实现稳态饱和；速率常数可直接测得，同时在同一实验中获得T1值，且仅需进行一组实验即可完成。SSTD NMR方法的另一显著优势在于，与线型分析法不同，其动力学速率常数的测定不受高磁场下合并温度升高的限制。因此，该方法适用于低场和高场磁共振实验。本文旨在帮助新用户将这一新方法应用于自身研究中涉及化学交换的体系，并详细介绍了样品制备、实验设置、数据采集，以及在一种简单有机分子中进行数据处理与分析的示例。

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N,N&lt;/em&gt;二甲基乙酰胺</td><td>Aldrich</td><td>38840</td><td>急性毒性</td></tr><tr><td>甲苯-&lt;em&gt;d&lt;sub&gt;8&lt;/sub&gt;&lt;/em&gt;</td><td>Fluorochem</td><td>D-005</td><td>易燃且有毒</td></tr><tr><td>500 MHz 7&quot; 选择系列 NMR 样品管</td><td>GPE LTD</td><td>S-5-500-7</td><td></td></tr><tr><td>TopSpin 2.1</td><td>TopSpin 程序，Bruker Corp.，http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin/（2015）。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Origin 6.0</td><td>Origin 6.0 软件，OriginLab 公司，http://originlab.com。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备 5 mm 宽带观测 BBFOplus Z 梯度 SmartProbeTM 探头的 Bruker Avance III 500 MHz 谱仪</td><td>&amp;nbsp;布鲁克公司，http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>配备 5 mm TXI Z 梯度探头的 Bruker Avance I 500 MHz 反向三共振核磁共振波谱仪</td><td>&amp;nbsp;布鲁克公司，http://www.bruker.com</td><td></td><td></td></tr><tr><td>陶瓷标准探头匀场系统（5 mm）</td><td>&amp;nbsp;布鲁克公司，http://www.bruker.com</td><td>H00804</td><td></td></tr></tbody></table>

自旋饱和转移差值核磁共振（sstd nmr）：获取化学交换过程动力学参数的新工具

Spin Saturation Transfer Difference NMR (SSTD NMR): A New Tool to Obtain Kinetic Parameters of Chemical Exchange Processes

本详细实验方案介绍了我们课题组近期开发的新型自旋饱和转移差值核磁共振技术（SSTD NMR），用于研究传统方法难以分析的相互位点化学交换过程。顾名思义，该方法结合了用于小分子的自旋饱和转移技术与用于研究蛋白质-配体相互作用的饱和转移差值（STD）NMR技术，通过在发生化学交换的小型有机和有机金属分子中测量随饱和时间增加而变化的瞬态自旋饱和转移（即信号增强曲线），实现对交换过程的定量分析。
该方法相较于现有方法的优势在于：无需达到交换信号的合并；只要交换位点中的一个信号是孤立的，即可应用该方法；无需测量T1或达到稳态饱和；速率常数可直接测定，同时在同一次实验中利用一组实验即可获得T1值。
为了验证该方法，我们研究了受阻旋转的动力学行为 N,N二甲基酰胺，已有大量数据可供比较。采用SSTD方法获得的热力学参数与已报道的结果（自旋饱和转移技术及谱线形状分析）非常接近。该方法可应用于此前方法无法研究的更具挑战性的底物。
我们预计，该方法实验装置简单，且可广泛适用于多种底物，将成为有机和有机金属化学领域研究人员的常用技术，即使其不具备核磁共振（NMR）方面的深厚专业知识亦可应用。

SSTD NMR 技术被用于计算酰胺键旋转的动力学参数 N,N-二甲基乙酰胺21 这是一个简单的示例，相关文献中可找到大量可供比较的数据。31
由于酰胺键在共振式中具有部分双键特性，导致其周围旋转受阻，从而使两个甲基在核磁共振谱中呈现为两个不同的信号 1H-NMR 谱（2.61 和 2.17 ppm 处的信号） 22.5 °C）。在2.17 ppm处对甲基信号（MeB) 导致其信号在 1H NMR。当Me饱和时B，饱和度转移至另一个甲基（MeA）由于内旋转过程，可通过降低现象来观察 1信号在2.61 ppm处的H强度。该强度降低的程度取决于饱和时间。 图15 显示 1H NMR 谱的 N,N-二甲基乙酰胺在 22.5 °C，扩展示意图显示了甲基在 2.17 ppm 处未饱和（a）和已饱和（b）的谱图，以及用于计算 η 值的差谱（c）SSTDηSSTD 因子通过将 Me 积分值除以某值计算得出A 在SSTD核磁共振谱图（c）中，通过Me的积分值A 在谱图（a）中，如实验方案所述。所获得的 η 值SSTD 在不同温度下，各饱和时间的数据均汇总于 表1所得η值的图示SSTD 与饱和时间的关系呈现出指数曲线，随着饱和时间的增加，曲线趋于平缓。对于特定温度，通过指数拟合该曲线可计算出反应速率常数（k以及弛豫时间的 1测量信号的 H（T1A) (图16). 图17 显示所有获得的曲线以及 k 和 T1A 拟合得到的数值。
最后，ln(k/T) 对 1/T 作图，并拟合至 Eyring 方程（图 18) 用于计算活化焓和活化熵。所确定的活化参数如表所示。 表2，以及使用不同方法计算得出的先前已报道的参数。
如表2所示，采用自旋饱和转移差值技术（SSTD NMR）获得的活化参数值与其他技术（如SST NMR或谱线线型分析）先前报道的数据高度一致。ΔS‡的报道值范围较宽，这是由于使用NMR技术测量该参数存在较大难度31。对于其他活化参数，本方法所得结果不仅与已有报道值非常接近，而且更为准确，因为在所有情况下，我们的误差（标准偏差，SD）均更小。
<img alt="NMR分析软件界面，参数设置菜单，波谱实验配置。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1：输入 rpar 后显示的实验列表。该图展示了不同的参数集，应从中选择STDDIFFESGP。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振波谱仪设置；数据采集参数输入界面；脉冲序列配置。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2：采集参数。 用红色方框标出的按钮可进入不同脉冲序列的列表。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振波谱的脉冲序列选择界面；用于序列选择与编辑的列表表格。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 3"> 
图 3： 脉冲序列列表。 该图显示了实验中选定的脉冲序列（STDDIFF）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="NMR脉冲校准显示；1H、gammaB1/2pi在11.0 dB处的设置及脉冲序列。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图4"> 
图4：90°脉冲校准后弹出的窗口。 该图显示了在不同功率水平下校准得到的90°脉冲值。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振波谱仪设置；参数调整；数据采集；质子共振条件。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5： 命令行界面截图。 该图展示了如何输入已校准的硬脉冲数值。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光子实验中脉冲持续时间设置界面；输入值 P13=50000.00 μs。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6： 整形脉冲持续时间的取值。 该图展示了如何输入整形脉冲的持续时间值。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振波谱软件界面；脉冲序列和功率分析的参数设置。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 7"> 
图 7： 采集参数。 该图显示了功率参数。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="形变脉冲参数表；光谱学用的脉冲功率、偏移频率、相位对齐数据。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig8.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图8"> 
图8：形变脉冲的参数。 形变脉冲的参数值将在第13行中引入。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig8large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="来自计算分析软件界面的文本数据。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig9.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图9"> 
图9：照射频率列表。 该图包含前3行中的以下数据：第1行. P（表示后续数据单位为 ppm）；第2行。需照射信号的化学位移频率（ppm），如3.1.1节中测得；第3行。40 ppm（该频率远离化合物的1H信号，因此在此频率照射不会影响谱图）。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig9large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="用于多维数据的一维处理命令界面，指定FID和PROCNO以获取结果。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig10.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图10"> 
图10： 第一个FID的处理。 该图显示了输入efp.后弹出的窗口。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig10large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振谱图；质子化学位移；ppm；波谱学；数据分析；核磁共振。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig11.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图11"> 
图11： 相位校正。 显示手动相位校正窗口的截图。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig11large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="光谱学中多维数据的一维处理命令界面；对话框输入字段。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig12.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图12"> 
图12： 第二个FID的处理。 该图显示了输入efp.后弹出的窗口。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig12large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="用于化合物分析和谱图拟合的化学位移峰NMR谱图" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig13.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Figure 13"> 
图13：谱图2和谱图3的多重显示。 红色方框中高亮的按钮用于计算差谱。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig13large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="核磁共振波谱；积分分析结果；显示吸收峰和ppm数据。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig14.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图14"> 
图14：积分表。 该图显示了绝对积分和相对积分的数值。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig14large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="分子化学平衡的核磁共振分析；谱图数据展示化合物状态转变。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig15.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图15"> 
图15：在甲苯-d8 中于22.5 °C下N,N-二甲基乙酰胺的结构及其1H NMR 谱图。（a）照射前2.13至2.66 ppm区域的1H NMR 展开图。（b）在2.17 ppm处照射甲基后同一区域的展开图。（c）差谱图[(a)-(b)]。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig15large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的高清版本。</a>
<img alt="静态平衡公式 η=a(1-exp(-b*t)) 拟合曲线图，回归分析数据。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig16.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图16"> 
图16：ηSSTD 在278 K下的曲线图及其指数拟合示例。 经英国皇家化学学会许可， reproduced自参考文献21的补充信息。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig16large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<img alt="饱和动力学曲线，ΔM/MA 随时间变化，数据表。光学光谱结果分析。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig17.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 17"> 
图 17：不同温度下 ηSSTD 随饱和时间变化的曲线图。该图显示了 N,N-二甲基乙酰胺的曲线以及所得速率常数和弛豫时间的数据表。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig17large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="Arrhenius 图、线性拟合、ln(k/T) 对 1/T 的图、动力学分析、回归方程显示。" src="/files/ftp_upload/54499/54499fig18.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 18"> 
图 18：Eyring 图。 该图显示了 N,N-二甲基乙酰胺的曲线图。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54499/54499fig18large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">tsat (sec)</td>
			<td>ηSSTD </td>
			<td>ηSSTD </td>
			<td>ηSSTD </td>
			<td>ηSSTD </td>
			<td>ηSSTD </td>
			<td>ηSSTD </td>
			<td>ηSSTD </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(T = 278 K)</td>
			<td>(T = 283 K)</td>
			<td>(T = 285.5 K)</td>
			<td>(T = 288 K)</td>
			<td>(T = 290.5 K)</td>
			<td>(T = 293 K)</td>
			<td>(T = 295.5 K)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>0.2526</td>
			<td>0.3957</td>
			<td>0.4671</td>
			<td>0.5461</td>
			<td>0.626</td>
			<td>0.6969</td>
			<td>0.7535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0.2526</td>
			<td>0.3957</td>
			<td>0.4671</td>
			<td>0.5461</td>
			<td>0.626</td>
			<td>0.6969</td>
			<td>0.7535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0.2383</td>
			<td>0.3806</td>
			<td>0.4537</td>
			<td>0.5355</td>
			<td>0.6199</td>
			<td>0.6969</td>
			<td>0.7535</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0.1904</td>
			<td>0.3193</td>
			<td>0.3919</td>
			<td>0.481</td>
			<td>0.5734</td>
			<td>0.6638</td>
			<td>0.7318</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.5</td>
			<td>0.1263</td>
			<td>0.2204</td>
			<td>0.2812</td>
			<td>0.3589</td>
			<td>0.4449</td>
			<td>0.5461</td>
			<td>0.626</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.25</td>
			<td>0.0761</td>
			<td>0.1353</td>
			<td>0.171</td>
			<td>0.2247</td>
			<td>0.2868</td>
			<td>0.3732</td>
			<td>0.4449</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.625</td>
			<td>0.0467</td>
			<td>0.0739</td>
			<td>0.099</td>
			<td>0.1327</td>
			<td>0.171</td>
			<td>0.2291</td>
			<td>0.2758</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.3</td>
			<td>0.0238</td>
			<td>0.044</td>
			<td>0.0472</td>
			<td>0.0644</td>
			<td>0.0847</td>
			<td>0.1169</td>
			<td>0.1463</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：ηSSTD 的数值。 该表格显示了在278–295.5 K温度范围内，N,N-二甲基乙酰胺在不同饱和时间下测得的数值。
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="585">
	<colgroup>
		<col>
		<col span="5">
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:145px;">方法</td>
			<td style="width:88px;">SSTD NMR </td>
			<td rowspan="2" style="width:88px;">SST NMR31</td>
			<td style="width:88px;">线型分析</td>
			<td style="width:88px;">线型分析</td>
			<td style="width:88px;">线型分析</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:145px;">参数</td>
			<td style="width:88px;">(本研究)</td>
			<td style="width:88px;">(1H NMR)4</td>
			<td style="width:88px;">(1H NMR)5</td>
			<td style="width:88px;">(13C NMR)6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">Ea 298 (KJ mol-1)</td>
			<td style="width:88px;">79.7 ± 0.1</td>
			<td style="width:88px;">73.1 ± 1.4</td>
			<td style="width:88px;">70.5 ± 1.7</td>
			<td style="width:88px;">82.0 ± 1.3</td>
			<td style="width:88px;">79.5 ± 0.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">ΔH‡ (KJ mol-1)</td>
			<td style="width:88px;">77.2 ± 0.1</td>
			<td style="width:88px;">70.6 ± 1.4</td>
			<td style="width:88px;">68</td>
			<td style="width:88px;">79.5 ± 0.4</td>
			<td style="width:88px;">76.6 ± 0.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">ΔS‡ (J mol-1 K-1)</td>
			<td style="width:88px;">11.5 ± 0.4</td>
			<td style="width:88px;">-10.5 ± 5.0</td>
			<td style="width:88px;">-15.0 ± 5.1</td>
			<td style="width:88px;">13 ± 8</td>
			<td style="width:88px;">3 ± 4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">ΔG‡298 (KJ mol-1)</td>
			<td style="width:88px;">73.8 ± 0.1</td>
			<td style="width:88px;">73.7 ± 2.0</td>
			<td style="width:88px;">72.5</td>
			<td style="width:88px;">75.3 ± 0.4</td>
			<td style="width:88px;">75.7 ± 0.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:145px;">溶剂</td>
			<td style="width:88px;">Tol-d8</td>
			<td style="width:88px;">Tol-d8</td>
			<td style="width:88px;">CCl4</td>
			<td style="width:88px;">Acetone-d6</td>
			<td style="width:88px;">neat</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： 活化参数。 该表格展示了内部旋转的活化参数 N,N通过SSTD NMR方法获得的二甲基乙酰胺参数，与使用其他NMR方法分析所得的相同参数进行比较。4,5,6 该表中的误差指标准差（SD）。（转载自参考文献）21 经英国皇家化学学会许可。

本文提供了一个详细的SSTD NMR方法实验方案，旨在帮助新用户应用这一新方法，以获得其自身化学交换体系的动力学参数。

自旋饱和转移差值核磁共振（SSTD NMR）：获取化学交换过程动力学参数的新工具

本详细方案描述了我们实验室近期开发的一种新型自旋饱和转移差谱核磁共振技术（SSTD NMR），该技术……

本实验的总体目标是获得通过传统方法难以测量的小分子有机物和有机金属分子之间相互化学交换的动力学参数和过程。该方法有助于理解发生化学交换的有机和有机金属分子的分子动力学，例如旋转异构、构象平衡、氮原子翻转、木质素交换以及互变异构等过程。该技术的主要优势在于无需交换信号的合并，且速率常数和弛豫时间可在同一次实验中获得。我们最初在研究铂离子配合物在溶液中的功能行为时提出了该方法，当时我们意识到变温取向分析技术并不适用。基于我们利用核磁共振（NMR）研究蛋白质与木质素相互作用的经验，我们认识到实际上类似的NMR方法也可用于研究有机分子中的交换过程，事实证明这一想法是正确的。向一支适用于低温的核磁共振（NMR）样品管中加入五毫克 N,N-二甲基乙酰胺，并用零点六毫升氘代甲苯溶解。在设置 SSTD NMR 实验时，首先将样品插入磁体中。温度控制是辅助 NMR 实验的关键步骤之一，因此务必让样品在选定温度下稳定至少 20 分钟。样品放入磁体后，在命令行中输入 EDTE。将温度调节至首个选定的实验温度。让样品在选定温度下稳定至少 20 分钟。对样品进行如文本方案所述的一维质子核磁共振（1H NMR）实验，然后通过点击“文件”（File）、“新建”（New）创建一个新的质子核磁共振实验数据集，并为该新实验命名。在新数据集中，在命令行中输入 RPAR。从列表中选择一个 STDDIFF 参数集。要选择 STDDIFF 脉冲序列，请点击脉冲程序行中带有三个点的按钮。在执行 SSTD NMR 实验之前，需校准质子 90 度硬脉冲 P1。在命令行中输入 pulsecal，然后复制较高功率下的 90 度脉冲值，即对应最短脉冲时间的数值。在实验中使用 getprosol 命令输入已校准的硬脉冲参数值。接着设置脉冲的持续时间，输入 P13 并设定数值为 50,000 微秒。通过进入功率设置，点击“形状”旁边的编辑按钮，然后选择脉冲形状 13，设定为高斯脉冲来设置选择性脉冲形状。将选择性脉冲功率 SP13 设为 50 分贝。输入 NS 并将其设为 8，然后输入 DS 并将其设为 4。为进行 SSTD NMR 实验，先打开质子 NMR 实验，以确定将要照射的信号位置。为此，请在软件浏览器中搜索该实验，右键单击数据集，然后点击在新窗口中显示。照射的选择性必须精确，以确保实验成功。确保未使用任何校正化学品，否则照射频率可能设置错误。将光标线移至待照射信号的中心位置，并记录以百万分之一为单位的化学位移。选择实验中将使用的谱宽。本例中，待照射信号位于2.17 ppm，所用谱宽为1.46 ppm。接下来，转到先前创建的SSTD NMR实验，在命令行中输入FQ2LIST并选择一个现有列表，以创建照射频率列表。按照文本方案中的描述编辑照射频率列表。将该列表另存为新名称。然后在命令行中输入 FQ2LIST 并选择刚刚创建的列表。为了将实验中心对准待研究的信号，请输入 O1P，然后选择将被照射信号的化学位移作为实验中心。输入 SW 以选择谱宽。选择扫描间弛豫延迟 D1 的数值，确保其至少为弛豫最慢的质子 T1 值的 1 至 5 倍。输入 D1 并将其设置为 40 秒。通过输入 D20 并将其设置为 40 秒，设定第一次饱和时间的值。通过输入 RGA 自动确定接收增益。输入 IEXPNO 创建下一个实验。输入 D20 并选择 20 秒的饱和时间。然后输入 RGA 以自动确定 RG。对 D20 分别等于 10、5、2.5、1.25、0.625 和 0.3 秒的情况重复上一步骤。所有实验创建完成后，打开第一个实验，在命令行中输入 multizg，并指定实验数量。处理数据时，从饱和时间较长的一组实验中打开编号为 1 的实验进行处理。在命令行中输入 LB 并将值设为 1.5。在命令行中输入 EFP，处理 FID 编号为 1，处理编号为 2。通过点击交互式相位校正按钮校正实验的相位，然后将其保存为一个两 G 实验，接着保存并退出。在命令行中输入 REP 1 以进入过程编号一。在命令行中输入 EFP，设置过程 FID 编号等于 2，过程编号等于 3。接着在命令行中输入 point MD，然后输入 REP 2，以显示包含过程谱图 2 和 3 的多显示窗口。单击带有 delta 符号的按钮，以计算差谱并将其保存在第四步处理中。然后退出多显示窗口。从左侧信号中选择积分范围。在第三个和第四个步骤中始终对相同区域进行积分。完成积分后，进入每个实验的积分标签页，复制积分的绝对值。针对具有不同饱和类型的其余实验，重复此操作流程。为了获得动力学参数，首先提取出SSTD参数值随饱和时间变化的数据。随后按照文本方案中描述的方法继续进行数据分析。由于酰胺键周围存在受阻旋转，使得两个甲基在质子核磁共振谱中呈现出两个不同的信号。在百万分之2.17处对甲基进行自旋饱和，会导致其在质子核磁共振谱中的信号消失。当在百万分之2.17处饱和甲基B时，由于分子内旋转，饱和效应会传递至百万分之2.16处的甲基A，这可通过百万分之2.61处质子信号强度的降低而观察到。SSTD参数因子通过将差谱中甲基A积分值除以原始谱图中甲基A积分值来计算。在特定温度下，SSTD 参数值随饱和时间变化的曲线呈指数关系。对这些曲线进行拟合可得到所测信号质子的速率常数和弛豫时间。在不同温度下绘制 SSTD 参数随饱和时间变化的曲线，可获得相应的速率常数和弛豫时间。采用Eyring方程计算热力学参数。利用SSTD核磁共振获得的数值与其他技术报道的数据高度一致。一旦掌握实验方法，在给定温度下完成一组实验以获得速率常数和弛豫时间，若操作得当，约需三小时即可完成。在进行该实验操作时，必须注意溶剂和温度的选择对获得良好结果至关重要，因为化学交换速率会随这些参数发生显著变化。通过该方法，还可研究其他过程，如动力学软分子间化学交换和木质素交换；此外，只要对公式进行适当修改，该方法还可拓展用于研究多部位交换和非等量种群的情况。观看本视频后，您应能够充分理解如何开展自旋饱和转移差谱实验，以及如何利用磁化转移来获取发生化学交换的分子的动力学和热力学参数。请务必注意，接触化学品可能具有极高危险性，在进行本实验的样品制备过程中，必须始终采取适当的安全防护措施，例如佩戴护目镜和手套。

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