在小鼠实验为细菌性肺炎的诱导和表型非侵入性和技术上非密集型方法

该实验方案的总体目标是提供一种非侵入性且技术上非密集的程序，用于在小鼠中诱导细菌性肺炎，并随后量化肺部体内宿主防御反应。这种方法可以帮助回答传染病和免疫学领域的关键问题，即控制宿主对感染反应的基因和分子途径。这种肺部感染方法的主要优点是其技术简单性。

这使得即使是在肺部手术方面几乎没有专业知识的实验室也可以研究肺先天免疫反应。在生物安全二级设施中，解冻肺炎克雷伯菌的甘油原液，并将 1 毫升细菌转移到装有 50 毫升胰蛋白酶大豆肉汤的 500 毫升培养瓶中。将悬浮培养物在 37 摄氏度和 200 至 225 RPM 下孵育过夜。

第二天早上，在装有 50 mL 胰蛋白酶大豆肉汤的新培养瓶中稀释 1 至 5 mL 细菌培养物，并在摇床中将培养物在 37 °C 下再孵育 2.5 小时，以达到对数期。在第二次孵育结束时，将第二次培养物中的 1 毫升细菌转移到 1.5 毫升试管中进行离心。在不干扰调色板的情况下去除上清液，然后将细菌轻轻重悬于一毫升无菌盐水中，进行三次单独洗涤。

第三次洗涤后，将细菌重悬于另一毫升无菌盐水中，并设置接种物的对数连续稀释。在一次性比色皿中量取 1 毫升 1 至 10 和 1 至 100 稀释液，一式两份，以确定洗涤后的肺炎克雷伯菌的 OD 600。1.0 的 OD600 大致相当于每毫升 10 到 8 分之 CFU 的 4 到 7 倍。

在计算每次稀释液中细菌的浓度后，将所需的接种 CFU 剂量重悬于每只 8 至 12 周龄的受体动物 50 至 60 微升无菌盐水中。为了将细菌输送给动物，将剂量接种物吸入 P200 移液器吸头中，并将麻醉的小鼠置于半卧位，由上颌切牙悬挂，从斜面Plexiglas 板的钉子之间拉伸的橡皮筋。使用一对钝的、无脊的镊子，轻轻地将舌头拉到一边，并将剂量存入动物的口腔，注意避免对舌头或口腔咽部造成创伤。

保持舌头缩回，用戴手套的手指轻轻封闭鼻子，直到房子吸气两到三次。当口腔中没有可见液体时，将小鼠从接种板转移到笼子上，仰卧位，以防止在小鼠恢复时鼻孔堵塞。在胸骨正下方做一个纵向切口。

然后，用镊子抬起胸骨，划开横膈膜，让肺落回胸腔。继续切口向上穿过脉管系统两侧的胸腔，然后向上穿过颈部。当可以看到气管时，小心地切开颈部中间并将组织推向两侧，以避免损坏周围的血管。

现在从头部向下约四分之一处划开气管，然后将一个插管插入气管，该套管连接到预装了 1 毫升 PBS 的 1 毫升注射器上。慢慢地将容量推入肺部，让所有肺叶膨胀。然后用注射器将体积拉出，并将收集的洗涤液混合在 15 毫升试管中，置于冰上。

在适当的实验终点，从左心室收集血液并将其转移到肝素化管中以避免凝血。然后在含有 5 毫升 PBS 的 15 毫升试管中收获所有肺叶，在含有 2 毫升 PBS 的 15 毫升试管中收获脾脏。接下来，每个样品使用单独的一次性匀浆器，在冰上浸渍组织，然后连续稀释组织浆液。

将稀释液一式两份接种在单个 TSA 板的不同侧面，并让样品短暂干燥。然后倒置板，并在 37 摄氏度的静态培养箱中将样品培养过夜，对板两侧的细菌菌落和第二天早上的每次稀释液进行平均。在 2000 CFU 的肺炎克雷伯菌中，小鼠通常在感染后 12 至 24 小时开始出现临床症状。

在 48 到 72 小时内，许多动物表现出疾病和发病症状，通常在体重平均减轻 20% 之前。然而，LD50 剂量可以检测实验组内相对增加和降低的生存率，并且可能是长期研究的首选。肺炎克雷伯菌下呼吸道感染的特点是感染后 6 小时内白细胞大量流入气道，在 24 小时内达到高峰，主要以中性粒细胞为代表。

感染肺炎克雷伯菌后 24 小时和 48 小时，在支气管肺泡灌洗液中均可检测到细胞因子，并有助于了解肺微环境及其响应细菌入侵的免疫自我募集。在感染后 24 至 48 小时内，肺、血液和脾脏中的细菌载量也会急剧增加。一旦掌握，如果作得当，每只小鼠只需一到两分钟即可完成肺部感染的口咽抽吸方法。

在尝试此过程时，重要的是要记住不要使用过多的吸液量。50 至 60 微升的体积通常适用于 8 至 12 周龄的小鼠。按照此程序，可以对肺和外周组织进行多种方法，以量化病原体清除中的免疫反应。

观看此视频后，您应该对如何通过口咽病原体递送诱导实验性细菌性肺炎以及确定小鼠的病原体负荷有很好的了解。不要忘记，与微生物一起工作可能是危险的，并且在执行此程序时应始终采取基本的 BSL-2 预防措施和做法。