成像G蛋白偶联受体介导的趋化和信令活动在中性粒细胞样细胞HL60

视觉趋化实验是为了更好地了解如何真核细胞趋化控制介导的定向细胞迁移是必不可少的。在这里，我们描述了详细的方法:1）实时，多趋化实验的高分辨率监测，和2）同时可视化趋化梯度和信号中的中性粒细胞样HL60细胞事件的时空动力学。

该模型的总体目标是允许同时监测多个趋化性测定，或可视化单个趋化细胞的多个信号事件。Overdeck 的细胞生物学家已经开发了几种不同的方法来量化细胞的趋化性行为。直到最近，我们才能够回答趋化性领域的关键问题，例如，如何同时监测多个趋化性测定。

该技术的主要优点是应用微流体原理，为实时高分辨率的多个同步趋化性测定生成高度可重复和可靠的成分。演示该程序的将是 习 温 博士，她是我们实验室的博士后。要组装支架，首先使用杠杆将底座置于垂直位置，以便杠杆可以向用户倾斜。

然后，用 70% 乙醇短暂地涂在 41 毫米玻璃的表面，并使用湿巾小心地去除乙醇。将玻璃杯插入支架底座，并在玻璃杯顶部放置一个 BSA 涂层的 2 毫米方形盖玻片。接下来，将小 O 形圈插入晶圆外壳的底部，并将晶圆外壳安装到支架底座中，椭圆孔位于仪器后部。

将支架底座的内层向前拉至水平位置，以将晶圆外壳锁定到位。使用空气除尘器吹走晶圆外壳内部的任何碎屑。然后将 4 毫升 RPMI 1640 培养基加入外壳中，补充有 0.1% BSA。

现在，将 BSA 涂层电池迁移率分析设备芯片安装到晶圆外壳的中心，使结构面与玻璃接触，定位标记位于背面。将橡胶垫圈上的两个突起安装到孔中，将垫圈固定在晶圆夹具的底部，然后将大 O 形圈安装到晶圆外壳的顶部。然后安装带有传感器孔的晶圆夹，并将外壳底座的外杆向前拉至水平位置，以将晶圆夹锁定到位。

组装支架后，将支架底部放在灯箱上，确认孔中没有气泡。然后取下盖子，将组件转移到细胞迁移率分析设备单元顶部的板上，并将传感器模块连接到支架上。为了进行细胞迁移率测定，首先我们将分化的 HL60 细胞悬浮在补充 BSA 的 RPMI 1640 培养基中，并以每毫升浓度的两倍十至第六个细胞

然后，将细胞迁移率分析设备单元连接到用于图像采集的计算机，并打开两个设备。接下来，打开细胞迁移率分析设备软件。在相机图像控制面板中，使用横线和竖线实时调整支架位置，并在相机图像面板中将设备居中。

然后选择 Channel One 将摄像机移动到所选通道，并使用 Move Right 或 Move Right 调整摄像机的 X 坐标，使视野水平居中。要将图像垂直调整到屏幕中心，请转动细胞迁移率分析设备前面板上的位置旋钮。在加热器控制面板上，将支架温度设置为 37 摄氏度，将板温度设置为 39 摄氏度。

要使用连接到支架的热传感器控制温度，请单击 Heat 开始加热，然后单击 Holder。在拍摄面板上，为 Interval 输入 15 秒，为 Time 输入 30 分钟，以分别设置趋化性测定的间隔和持续时间。为安全起见，请选择 拍摄结束时关闭加热器 框。

然后，保存文件，将实验的具体内容输入到备注面板中，并确认设备已在所有通道中居中。现在从支架中取出所有缓冲液，并从第一个通道顶部的第三个孔中取出 8 微升缓冲液。使用注射器，将 2 μL 细胞注入同一通道中的第二个孔中，同时实时监测筛网以控制注射过程中的细胞数量和流量。

当细胞对齐后，立即将 8 μL 缓冲液加回孔中，并在通道 2 到 6 中重复细胞注射，如刚才所示。加入所有细胞后，将 2 毫升缓冲液加回支架中，并在适当通道中从顶部向第三个孔中加入 1 微升趋化剂。最后，开始图像采集。

在这个代表性实验中，HL60 细胞在注射趋化因子后立即开始沿直线路径进行趋化，并持续整个 60 分钟的测定，与梯度稳定性模拟结果一致。追踪细胞的行进路径和形态允许使用包括细胞的总路径长度、方向性、速度和圆度的趋化性指数对趋化性行为进行定量测量和随后的比较。荧光染料与化学引诱剂结合使用，可以在化学引诱剂浓度和监测的荧光染料强度之间建立线性关系。

此外，为了响应均匀施加的趋化刺激，HL60 细胞介导 GFP 触觉蛋白激酶的稳健膜易位 D1.In 趋化梯度，HL60 细胞主动将激酶募集到前缘的后部。掌握后，如果执行得当，此过程可以在 30 分钟内完成。在尝试此程序时，请务必严格遵循制造商对支架组件的说明，并监测细胞注射。

开发后，这项技术为趋化性领域的研究人员探索多种趋化性测定的可能性铺平了道路，例如单基因 dictyostilium 或其他类型的哺乳动物细胞系统。观看此视频后，您应该对如何组装装置、同时进行趋化性分析或同时可视化化疗细胞中的多个信号转导事件有很好的了解。