Name: 成像G蛋白偶联受体介导的趋化和信令活动在中性粒细胞样细胞HL60 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 了解利用微流控技术实时监测HL60中性粒细胞样细胞的趋化运动和信号传导动态。该方法可同时观察多个趋化实验，为研究细胞迁移机制提供高分辨率的可重复数据。

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本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家过敏与传染病研究所（NIAID）的院内基金资助。

1. 人中性粒细胞样HL60细胞的培养与分化
<ol>
	<li>准备含有 RPMI 1640 培养基、10% (v/v) 胎牛血清 (FBS)、0.1 mM 丙酮酸钠和 25 mM HEPES（4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸）的 RPMI（罗斯韦尔帕克纪念研究所）1640 培养基。将 RPMI 1640 培养基预热至 37 °C。</li>
	<li>使用血细胞计数板测定 HL60 细胞的细胞密度，以确保细胞处于对数生长期。 
	注意：细胞通常在传代后第三天进入对数生长期。对数生长期细胞的密度通常为 6–8 × 105 个细胞/ml。启动新培养所需的细胞密度约为 1.5 × 105 个细胞/ml。 
	注意：例如，在 T-75 平底培养瓶中进行 10 ml 的新培养时，若对数生长期细胞密度为 6 × 105 个细胞/ml，则需取 2.5 ml 对数生长期细胞（6 × 105），稀释至 10 ml 新培养体系中，使终浓度为 1.5 × 105 个细胞/ml。为达到终体积 10 ml，需加入 7.5 ml RPMI 1640 培养基。</li>
	<li>将计算好的体积的预热 RPMI 1640 培养基加入平底培养瓶中。对于 T-75 平底培养瓶培养，细胞培养总体积为 10 ml。</li>
	<li>将计算好的体积的对数生长期 HL60 细胞加入平底培养瓶中，使细胞密度达到 1.5 × 105 个细胞/ml。</li>
	<li>将细胞置于 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中孵育。 
	注意：HL60 细胞的倍增时间约为 24 小时。</li>
	<li>每 2–3 天使用 RPMI 1640 培养基传代一次。必须确保 HL60 细胞的密度始终不超过 1.5 × 106 个细胞/ml，且细胞传代时间不超过 2 个月。</li>
	<li>在实验前 5 天开始诱导 HL60 细胞分化。 
	注意：RPMI 1640 分化培养基包含 RPMI 1640 培养基、10% (v/v) 胎牛血清 (FBS)、0.1 mM 丙酮酸钠、25 mM HEPES 和 1.3% 二甲基亚砜 (DMSO)。换句话说，即在 RPMI 1640 培养基中加入 1.3% DMSO。
	<ol>
		<li>为诱导 HL60 细胞分化，先将 RPMI 1640 培养基预热至 37 °C，并将其加入平底培养瓶中。</li>
		<li>对于终体积为 10 ml 的 HL60 分化培养体系，直接向平底培养瓶中的 RPMI 1640 培养基中加入 130 µl DMSO，同时轻轻旋转培养瓶，使 DMSO 迅速被 RPMI 1640 培养基稀释。</li>
		<li>将对数生长期的 HL60 细胞加入终体积为 10 ml 的 RPMI 1640 分化培养基中，使终细胞密度为 1.5 × 105 个细胞/ml。将 HL60 细胞在 37 °C、含 5% CO2 的湿润化培养箱中，用 RPMI 1640 分化培养基培养 5 天。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 包被4孔板盖玻片表面
<ol>
	<li>从冰箱中取出2%明胶储备液瓶，用70%乙醇擦拭清洁后放入生物安全柜中。取1 ml 2%明胶储备液，并立即将剩余的明胶储备液放回冰箱。</li>
	<li>将明胶溶液在37 °C条件下完全液化，并充分吹打混匀。用9 ml预热的1×Hanks'平衡盐溶液（HBSS）缓冲液稀释1 ml 2%明胶储备液，得到终浓度为0.2%的明胶溶液。</li>
	<li>分别向4孔板的中间两孔或底部带有盖玻片的1孔板中加入0.5 ml或2 ml的0.2% HBSS明胶溶液。轻轻倾斜培养板，使液体覆盖整个孔底表面。</li>
	<li>将培养板置于37 °C培养箱中孵育。1小时后即可使用，可保存至多5天。在接种细胞前，移除4孔板或1孔板中的明胶溶液。</li>
</ol>
3. 使用细胞迁移分析装置进行趋化性实验
<ol>
	<li>准备并预热RPMI 1640饥饿培养基，即含有0.1 mM丙酮酸钠（可选）和25 mM HEPES的RPMI培养基。</li>
	<li>在 RPMI 1640 饥饿培养基中配制 100 μl 浓度为 100 nM 的 fMLP（N-甲酰甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸）。</li>
	<li>配制3 ml含1%牛血清白蛋白（BSA）的RPMI 1640培养基，即在RPMI 1640饥饿培养基中加入1% BSA，以及10 ml含0.1% BSA的RPMI 1640培养基。</li>
	<li>将22 mm方形盖玻片和5 μm细胞迁移分析装置芯片用新配制的1% BSA/RPMI 1640培养基在室温下孵育1小时。</li>
	<li>使用以下步骤组装支架：
	<ol>
		<li>将支架底座放置好，使杠杆处于垂直位置，以便杠杆可向使用者方向倾斜。用70%乙醇溶液润湿41 mm玻璃片表面，用擦拭纸小心擦拭表面，注意避免刮伤。</li>
		<li>将41 mm玻璃片插入支架底座中。将BSA包被的22 mm方形盖玻片置于支架底座内的41 mm玻璃片上方。 
		注意：位于41 mm玻璃片与芯片之间的包被方形盖玻片可使趋化作用在包被表面的基质上发生。</li>
		<li>将小O形圈插入晶圆腔室底部，将晶圆腔室安装到支架底座中，椭圆孔朝向后方。将支架底座的内层向前拉至水平位置，以固定晶圆腔室。</li>
		<li>用气吹清除晶圆腔室内部的灰尘。向晶圆腔室中加入4 ml的0.1% BSA/RPMI 1640培养基。</li>
		<li>将BSA包被的细胞迁移分析装置芯片结构面朝下放置于晶圆载具中央，使其与玻璃接触。 
		注意：芯片插入时，定位标记（芯片顶部的孔）应朝向后方。</li>
		<li>将橡胶垫圈上的两个凸起插入孔中，将其固定在晶圆夹的底部。</li>
		<li>将大号O形圈安装到晶圆夹具顶部。将带有传感器孔的晶圆夹具从后部安装到位。将底座外壳的外侧杠杆向前拉至水平位置，以固定晶圆夹具。</li>
		<li>组装好支架后，将支架底部置于光源箱上，检查各孔中是否存在气泡。若发现气泡，使用配备加样头的塑料注射器将其去除。</li>
		<li>取下盖子，将组件放置在细胞迁移分析装置单元上方的培养皿上。将传感器模块固定到支架上。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备HL60细胞用于趋化实验：
	<ol>
		<li>使用血细胞计数板计算分化后的HL60细胞密度。经过5天分化后，细胞密度约为1.0 x 106 细胞/毫升</li>
		<li>计算 HL60 细胞的最终体积，使其终末细胞密度达到 2 x 106 细胞/毫升。例如，如果分化后的HL60细胞密度为1.0 × 106 细胞/ml，然后将10 ml已分化的HL60细胞用5 ml含0.1% BSA的RPMI 1640培养基重悬，以达到2 x 106 细胞/毫升</li>
		<li>离心分化后的 HL60 细胞，200 × g x g，室温离心5分钟。弃上清，按照步骤3.6.2）中计算的体积，用0.1% BSA/RPMI 1640培养基重悬细胞，调整细胞终浓度为2 x 106 细胞/毫升</li>
	</ol>
	</li>
	<li>启动细胞迁移分析仪主机和用于图像采集的电脑。将主机连接至电脑。开启细胞迁移分析仪。开启电脑。</li>
	<li>启动细胞迁移分析设备软件。
	<ol>
		<li>观察5个控制面板：摄像头、加热器、拍摄、备忘录和摄像头图像。</li>
		<li>在相机图像控制面板上，使用 &#34;水平线&#34; 或 &#34;垂直线&#34; 实时调整支架/视图位置，使相机位于相机图像面板的中心。</li>
		<li>在相机控制面板上，选择 CH1 至 CH6 以将相机移动到指定通道。要居中显示某通道的视野，请点击 &#34;移动 L&#34; 或 &#34;移动 R&#34; 调整相机的X坐标，使相机位置在水平方向上居中。</li>
		<li>通过旋转细胞迁移分析装置单元前面板上的位置旋钮，调节相机的Y坐标，以垂直调整图像，使图像居中于屏幕中央。</li>
		<li>在加热器控制面板上，设置 &#34;holder temp&#34; 至 37.0 °C 并 &#34;培养皿温度&#34; 至 39 °C。点击 &#34;热&#34; 开始加热。同时点击 &#34;支架&#34; 使用连接至支架的温度传感器来控制温度。</li>
		<li>在拍摄面板中，输入 &#34;15 秒&#34; 在 &#34;间隔&#34; 和 &#34;30 分钟&#34; 在 &#34;时间&#34; 用于趋化性实验的时间间隔和持续时间。检查 &#34;拍摄结束时关闭加热器&#34; 出于安全考虑，请指定存储图像的目的地。</li>
		<li>在备忘录面板中，输入实验的具体信息，例如所用的细胞系、是否施加处理，以及所用趋化因子的浓度。</li>
		<li>确认实验中将使用的所有通道的中心位置，并在需要时对所有通道重复调整。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>按如下步骤注射并排列细胞：
	<ol>
		<li>从支架上取下缓冲液板，从每个通道顶部起第三个孔中取出 8 μl 缓冲液。</li>
		<li>使用注射器向同一通道的第二个孔中注入 2 µl 细胞，同时实时观察屏幕以控制注射过程中的细胞数量和流速。待细胞排列整齐后，立即回加 8 µl 缓冲液。对其他通道重复相同操作。图1B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向支架中回加 2 ml 缓冲液，并向从顶部数第三个孔中加入 1 μl 100 nM fMLP。启动图像采集并保存数据。使用图像追踪软件分析所获得的数据。9 (图2).</li>
</ol>
4. 采用电穿孔法进行转染
<ol>
	<li>实验前5天按照第1节所述方法诱导HL60细胞分化。按照第2节说明对4孔或1孔培养板进行包被处理。</li>
	<li>准备并预热 RPMI 1640 电穿孔恢复培养基，其中包含 RPMI 1640 培养基、20%（v/v）胎牛血清（FBS）、0.1 mM 丙酮酸钠和 25 mM HEPES，至 37 °C。</li>
	<li>转染实验开始前，分别向预包被的4孔板或1孔板的孔中加入300 μl或3 ml RPMI 1640培养基。</li>
	<li>在含 5% CO₂ 的湿润化 37 °C 培养箱中孵育培养室2立即使用这些培养室，或存放于培养箱中以备将来使用（两周内）。</li>
	<li>使用血细胞计数板对分化后的HL60细胞进行细胞密度计数。 
	注意：细胞密度通常达到约 1.0 x 106 细胞/ml。细胞密度大于3.0 × 106 细胞/ml 通常会导致不理想的转染效率。由于 HL60 细胞为悬浮细胞，无需进行重悬。</li>
	<li>将细胞在200 × g下离心 x g 离心 5 分钟，室温。弃上清，重悬 2 x 106 100 μl 转染试剂中的 HL60 细胞</li>
	<li>加入4 μg GFP-PKD1质粒9 将细胞与转染试剂的100 μl混合液轻轻且充分混匀，然后加入提供的电穿孔杯中。</li>
	<li>选择制造商为人类白细胞细胞系预设的程序，并进行电穿孔。 
	注意：更多详细信息可从制造商网站获取。</li>
	<li>电穿孔后，立即轻柔地向细胞中加入500 μl预热的RPMI 6140电穿孔恢复培养基，并使用提供的塑料移液管将细胞从比色杯轻柔转移至1.6 ml离心管中。</li>
	<li>在含5% CO₂的湿润化37 °C培养箱中孵育细胞30分钟2将100 μl或500 μl细胞分别接种至4孔板或1孔板的一个孔中。</li>
	<li>向4孔或1孔培养板的同一孔中分别加入RPMI 1640培养基，终体积为1 ml或4 ml。将细胞置于37 °C、含5 % CO₂的湿润培养箱中孵育。2 孵育3小时。将RPMI 1640饥饿培养基预热至37 °C。</li>
	<li>使用1 ml移液器，从4孔板或1孔板的孔中分别轻柔地移除0.8 ml或3 ml RPMI 1640培养基。操作时应轻柔，避免吸走贴壁的HL60细胞。 
	注意：HL60 细胞在悬浮培养基中生长并发生分化。经分化处理或特定干预后，HL60 细胞可黏附于经多聚赖氨酸、胶原蛋白、明胶或纤连蛋白包被的基质表面。</li>
	<li>向4孔或1孔培养板的孔中分别加入0.8 ml或3 ml RPMI 1640无血清培养基。静置1小时。 
	注意：此时细胞已准备好进行成像实验9.</li>
</ol>
5. 通过多通道荧光显微镜监测GPCR介导的PKD1膜转位
<ol>
	<li>在RPMI 1640饥饿培养基中，配制含有100 nM fMLP和1 μg/ml Alexa 594的新鲜混合液作为刺激物。 
	注意：fMLP与Alexa 594的混合液需现配，以确保最大活性。</li>
	<li>将接种有细胞的4孔腔室安装在40倍油镜下。</li>
	<li>将荧光显微镜设置为多通道配置，具体如下：
	<ol>
		<li>绿色发射通道（500–530 nm）用于GFP标记的PKD1，红色发射通道（580–620 nm）用于趋化因子fMLP（Alexa 594），透射光通道用于识别贴壁的HL60细胞。</li>
		<li>启动&#34;实时&#34;采集，并优化三个通道的采集条件：</li>
		<li>精细调节三个通道的激光强度与功率，以在长时间成像过程中最小化光漂白。</li>
		<li>如有必要，对每2至4帧进行平均，以降低背景噪声，提高图像质量。时间间隔设为1秒。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在GFP和DIC（微分干涉差）通道视野中寻找表达强GFP-PKD1的贴壁细胞。贴壁细胞形态扁平，移动缓慢。</li>
	<li>在识别出高表达GFP-PKD1的贴壁HL60细胞后，通过降低各通道的激光功率并提高探测器增益，优化采集条件，以减少长期成像过程中的光漂白（图3A）。</li>
	<li>用200 μl移液器吸取100 μl fMLP/Alexa 594溶液并备用。选择&#34;时间序列采集&#34;模式，设置时间间隔为2秒，采集帧数为100帧。 
	注意：采集的时间间隔和帧数取决于实验目的。如图3所示，1–2秒间隔和100帧常用于成像实验。对于迁移较慢的细胞，长时间成像需采用更长的时间间隔；而对于迁移迅速的细胞，则需更短的时间间隔以观察细胞迁移的连续细节。</li>
	<li>小心取下4孔腔室的盖子，确保腔室位置不变。立即开始采集，并在使用激光光斑作为引导、将200 μl移液器精准定位至细胞上方的同时，采集3–5张未刺激状态下的细胞图像。</li>
	<li>以快速且均匀的流速将fMLP/Alexa 594混合液滴加至正在成像的细胞上，并完成整套时间序列采集。对采集的数据进行命名并保存，以供后续数据分析使用。</li>
</ol>
6. 在可见且可控的化学引诱刺激下成像趋化细胞
<ol>
	<li>使用10 μl微量移液器和注射吸头，用30 μl新配制的fMLP与Alexa594混合液反向填充微量移液管。</li>
	<li>将微量移液管连接至安装在显微镜载物台上方的微量移液管固定器，并将管路连接至压力供给装置；该装置可提供恒定压力，使fMLP/Alexa594溶液从微量移液管中释放，从而形成稳定的浓度梯度。</li>
	<li>打开压力供给装置，并将补偿压力（Pc）设定为70 hPa。</li>
	<li>将接种有表达PKD1-GFP的HL60细胞的单孔腔室盖玻片置于共聚焦显微镜或同等荧光显微镜的40倍油镜上。</li>
	<li>设置通道模式采集，配置如下：绿色通道（500–530 nm）用于检测GFP标记的PKD1；红色通道（580–620 nm）用于检测趋化因子fMLP（Alexa594）；透射光通道用于识别贴壁的HL60细胞。</li>
	<li>开始&#34;实时&#34;采集，并优化三个通道的采集条件：调节各通道强度以进行成像数据的定量分析；精细调整三个通道的信号强度与激光功率，以获得最佳图像质量并最小化光漂白。如有必要，对每2至4帧进行平均以提高图像质量。我们通常使用1秒的时间间隔。</li>
	<li>开始&#34;实时&#34;采集，在GFP和透射光通道中寻找表达强PKD1-GFP的贴壁细胞。使用明场光学系统，将微量移液管置于视野中央（图4A），以便观察fMLP浓度梯度及表达PKD1-GFP的贴壁HL60细胞。</li>
	<li>选择延时采集模式，设置时间间隔为2秒，采集帧数为100帧。 
	注意：每次延时序列采集完成后，应为数据命名并保存，以便后续数据分析。</li>
</ol>

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<li>Schakowski, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+non-viral+method+for+transfection+of+primary+leukemia+cells+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Vaccines+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel non-viral method for transfection of primary leukemia cells and cell lines.</a> Genet Vaccines Ther. 2, 1(2004).</li>
<li>Uchida, E., Mizuguchi, H., Ishii-Watabe, A., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+efficiency+and+safety+of+non-viral+vector-mediated+gene+transfer+into+a+wide+range+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Comparison of the efficiency and safety of non-viral vector-mediated gene transfer into a wide range of human cells.</a> Biol Pharm Bull. 25, 891-897 (2002).</li>
</ol>

作者声明本研究不存在竞争性财务利益。

在本研究中，我们展示了两种趋化性实验示例：第一，利用细胞迁移分析装置同时监测多个趋化性实验；第二，在同一细胞中实时可视化趋化因子梯度以及信号事件的空间-时间动态变化。
用于多重同时趋化性检测的细胞迁移分析装置
在本研究中，我们介绍了一种利用细胞迁移分析装置进行多个同时趋化性实验的详细方案。该装置允许用户在常规明场观察条件下，使用10倍物镜观察细胞的趋化行为。由于流体流动以扩散为主，该细胞迁移分析装置可产生高度可预测且稳定的浓度梯度，并支持最多同时进行六项趋化性实验。该方案的关键步骤在于获得可靠的浓度梯度以及将细胞准确排列在平台线处。用户应严格遵循制造商关于支架组装以及趋化因子和细胞注入的操作说明。详细的指导说明也可在线获取。与其它趋化性方法相比11-13,15，该装置显著提高了趋化性实验的可靠性和效率。细胞迁移分析装置芯片提供四种尺寸：4、5、6 和 8 μm，可适配不同类型和大小的细胞。我们发现，4 或 5 μm 的芯片适用于直径约为 10–15 μm 的 HL60 细胞和 D. discoideum 细胞。然而，该装置存在一定的局限性，并非适用于所有类型的细胞。我们在使用该装置对 Raw267.4 细胞进行趋化性实验时收效甚微，原因可能是 Raw267.4 细胞迁移速度过慢，其有效趋化所需的时间可能远超装置维持浓度梯度的时间。相比之下，Transwell 迁移实验对 Raw267.4 细胞效果良好9。另一项局限性在于当前装置无法进行荧光观察。未来的发展方向是实现更高倍数的荧光成像，这在改进型细胞迁移分析装置上已成为可能，该装置配备了荧光检测功能和 100 倍物镜，同时可同时进行的实验数量也增加至 12 个。所有这些改进均有助于提升趋化性实验的通量以及对迁移细胞中亚细胞动态过程的观察能力。
高效转染HL60细胞以表达荧光蛋白标记的蛋白
HL60 细胞是一种持续分裂的白血病细胞系，以悬浮状态生长。如先前报道18-20，HL60 细胞对基因转导具有抗性。脂质体转染和电穿孔基因转导方法均已被测试，其中电穿孔获得更高的转染效率，具体如第4节所述。由于电穿孔会造成严重损伤，因此在电穿孔后获得高细胞存活率对于实现高转染效率至关重要。因此，必须对细胞进行彻底且轻柔的操作处理，尤其是在电穿孔之后。所有培养基均需预热，并在电穿孔后的各步骤中轻柔地加入细胞中。同时，必须尽量缩短细胞与电穿孔试剂的接触时间。为避免细胞死亡，电穿孔后必须立即向细胞中加入 RPMI 1640 电穿孔恢复培养基。我们发现，恢复培养基中含 20% 胎牛血清（FBS）的细胞回收率明显高于含 10% FBS 的情况。电穿孔后，在 RPMI 1640 电穿孔恢复培养基中孵育 30 分钟，对提高细胞存活率和转染效率至关重要。为进一步提高转染效率，我们每次转染使用了 4 μg 质粒 DNA，这几乎是制造商推荐量的两倍。
电穿孔转染存在两个主要限制：蛋白表达的瞬时性以及细胞数量的限制（每次转染最多 2 × 106 个细胞）。在未分化的细胞中，由于载体质粒在每次细胞分裂后会被稀释一半，因此表达仅能在最初的几次细胞分裂期间被检测到。而分化后的 HL60 细胞存活时间不超过 48 小时。因此，任何实验均需在实验开始前 6 小时进行新鲜转染。一次电穿孔所获得的细胞数量仅能满足生化检测的最低需求。若需重复使用或大量细胞，强烈建议建立一个未分化的 HL60 细胞系，通过病毒载体（若可获得或可构建）稳定表达与荧光蛋白融合的目标蛋白。

真核细胞能够感知趋化因子浓度梯度并朝向高浓度区域移动，这一细胞过程称为趋化性。趋化性在多种生理过程中发挥关键作用，例如胚胎发生1、神经元模式形成2、癌细胞转移3、中性粒细胞向炎症部位募集4，以及模式生物Dictyostelium discoideum5的发育。通常情况下，真核细胞通过G蛋白偶联受体来感知趋化因子5。趋化因子与这些受体结合后，促进异源三聚体G蛋白Gα与Gβγ亚基的解离，进而激活下游信号转导通路，最终调控肌动蛋白细胞骨架的时空组织，驱动细胞迁移5-9。
细胞生物学家一直在开发和改进趋化性实验，以研究G蛋白偶联受体（GPCR）信号通路如何介导细胞的定向迁移。Boyden于1960年开发了Boyden小室或称transwell迁移实验10。该实验通过在由微孔膜分隔的两个小室之间建立化学趋化因子的浓度梯度来实现检测。由于其操作简便且易于使用，该方法至今仍是应用最广泛的趋化性实验。然而，该实验无法对细胞迁移过程进行实时可视化观察。Zigmond小室是首个可实现可视化成像的微流控装置，能够在盖玻片上清晰地观察细胞穿过狭窄区域向趋化因子源定向迁移的过程11。Dunn12和Insall13对该装置进行了改进，显著提升了Zigmond小室趋化实验的高分辨率和长期成像能力。由于微流控系统中的流体流动具有高度可预测且以扩散为主导的特性，因此为新一代趋化性实验（如EZ-TAXIScan，一种细胞运动分析装置）提供了有效的技术解决方案。
在确保梯度稳定的基础上，该装置可同时进行六项趋化性实验（图1A）。与上述各种腔室实验中产生的方向固定的梯度不同，Guenther Gerisch 开发的针头或微量移液器实验可产生具有可移动源的梯度14。在该实验中，趋化因子从可移动的微移液管中释放，从而形成稳定的浓度梯度。利用这种针头实验，研究人员发现不同细胞产生的伪足具有根本不同的特征。通过应用荧光显微镜技术，我们能够对梯度进行可视化，从而实现全程定量测量15。在本研究中，我们详细描述了制备趋化性HL60（人早幼粒细胞白血病）细胞的方法，利用细胞运动分析装置同时监测多个趋化性实验，以及在单个活细胞中可视化G蛋白偶联受体（GPCR）介导的信号分子（如蛋白激酶D1）在可见且时空可控的趋化刺激下的时空动态变化。我们先进的成像方法可广泛应用于一般的趋化性研究，尤其适用于哺乳动物细胞系统。

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640 培养基 GlutaMAX</td><td>Life technologies</td><td>61870-036</td><td></td></tr><tr><td>丙酮酸钠</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>1 M HEPES 无菌溶液，pH 7.3</td><td>Quality Biological Inc.</td><td>A611-J848-06</td><td></td></tr><tr><td>青霉素-链霉素溶液</td><td>Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 2b</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>Amaxa&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 细胞系 Nucleofector&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 试剂盒 V，包含 Nucleofector&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 溶液、一次性移液管、Amaxa&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; 认证的 100 ml 铝电极比色皿</td><td>Lonza</td><td>VCA-1003</td><td></td></tr><tr><td>Lab-Tek 带腔室 #1.0 硼硅酸盐盖玻片</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>2% 明胶溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1393</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>HBSS（Hanks&amp;rsquo; 平衡盐溶液）</td><td>Life technologies</td><td>14025-076</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>单孔 Lab-Tek II 盖玻片腔室</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155361</td><td></td></tr><tr><td>四孔 Lab-Tek II 盖玻片腔室</td><td>Nalge Nunc International Inc</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 594</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-10438</td><td></td></tr><tr><td>fMLP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F3506-5MG</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片厚度 (2) 22 mm × 22 mm</td><td>Corning</td><td>2855-22</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>MIC-1001</td><td></td></tr><tr><td>EZ-TAXIScan 芯片（5 mm）</td><td>Effector Cell Institute, Inc.</td><td>EZT-F01-5</td><td></td></tr><tr><td>1701RN 10 &amp;mu;l 注射器</td><td>Hamilton</td><td>80030</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II 注射尖端</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Femtotips II</td><td>Eppendorf</td><td>930000043</td><td></td></tr><tr><td>TransferMan NK2，包含电机模块、带角度调节器的 X 头及定位辅助装置&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5188900056</td><td></td></tr><tr><td>DIAS 软件</td><td>Solltech Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM 780 META 或同等共聚焦显微镜，配备 40X 1.3 NA 或 60X 1.4 NA 油镜 DIC Plan-Neofluar 物镜</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

成像中性粒细胞样hl60细胞中g蛋白偶联受体介导的趋化作用及其信号事件

Imaging G Protein-coupled Receptor-mediated Chemotaxis and its Signaling Events in Neutrophil-like HL60 Cells

真核细胞能够感知并朝向化学引诱物浓度梯度移动，这一细胞过程被称为趋化性。趋化性在多种生理过程中发挥关键作用，例如胚胎发育、神经元模式形成、癌细胞转移、中性粒细胞向炎症部位的募集，以及模式生物Dictyostelium discoideum的发育。真核细胞通过G蛋白偶联受体感知化学引诱物。可视化趋化性检测对于深入理解真核细胞如何调控化学引诱物介导的定向细胞迁移至关重要。本文中，我们详细描述了以下两种方法：1）对多个趋化性实验进行实时、高分辨率的监测；2）在类似中性粒细胞的HL60细胞中同时可视化化学引诱物浓度梯度以及信号事件的时空动态变化。

使用细胞迁移分析装置对多个HL60细胞的趋化运动进行同步成像
基于微流控技术的原理16，制造商提供了梯度形成的模拟曲线：梯度在1分钟内形成，5分钟内达到稳定，并可持续维持2小时。微流控系统所产生的稳定梯度具有高度可预测性，从而能够同时进行多个趋化实验。在本研究中，我们观察了三个同时进行的趋化实验（图2A 和 视频1）。我们发现，HL60细胞在趋化因子被注入趋化剂孔后立即开始趋化运动，并在随后的60分钟内沿直线持续移动，这与梯度稳定性模拟结果一致。通过追踪细胞的运动轨迹和形态，可对趋化行为进行定量测量和后续比较，所用的趋化指数包括细胞的总路径长度、速度、方向性和圆度（图2B）。总路径长度是连接路径各中心点的线段长度之和。速度由总路径长度除以时间得到。方向性向上测量，定义为：（路径终点的Y坐标减去路径起点的Y坐标）除以总路径长度，完全向上移动的物体该值为1.0。细胞的圆度是一个百分比指标，用于衡量给定周长所能包围面积的效率。在任意给定周长下，圆的面积最大，其圆度参数为100%；而直线不包围任何面积，其圆度参数为0%。我们展示了通过所选趋化参数定量测量得到的趋化行为（图2C）。
在时空可控的 fMLP 刺激下监测 HL60 细胞中 PKD 的亚细胞定位
将荧光标记且可控制的趋化因子刺激应用于实验系统是一项重要的技术进步。传统上，我们采用均一（也称为均匀）刺激或梯度刺激来观察细胞的响应与行为。然而，“盲”刺激不仅无法提供刺激物到达细胞过程中的时空信息，而且由于我们无法直接观察到刺激本身，任何关于细胞对刺激产生“异常”响应的观察结果都值得怀疑。我们此前已证明，可将荧光染料（Alexa594）与趋化因子共同使用，建立趋化因子浓度与检测到的荧光染料强度之间的线性关系15。通过绿色荧光蛋白（GFP）的采集配置、荧光染料（Alexa594）的红色发射信号以及透射光，我们能够同时监测贴壁细胞、刺激物的施加过程以及细胞对刺激的响应（图3A）。蛋白激酶D是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，在定向细胞迁移中发挥关键作用9,17。在均一施加的fMLP（红色）刺激下，HL60细胞介导了GFP标记的蛋白激酶D1（绿色）在细胞膜上的显著转位（图3B 和 视频2）。在fMLP梯度（红色）（图4A）中，HL60细胞主动将PKD1募集至细胞前缘（图4B 和 视频3）。对前缘突出部位GFP亚细胞定位的细致比较表明，PKD1定位于前缘的后部区域（图4C）。
<img alt="图1" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig1.jpg" /> 
图1. 细胞迁移分析装置可同时进行多达6个趋化性实验。（A）示意图展示了用于同时监测6个独立趋化性实验的细胞迁移分析装置芯片设计。红色表示加入孔中的趋化因子。（B）将HL60细胞加入细胞孔的同时，趋化因子扩散形成稳定的fMLP浓度梯度。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图 2" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig2.jpg" /> 
图 2. 使用 HL60 细胞同时监测多个趋化实验。（A）拼接图像显示了细胞迁移分析装置趋化实验的结果，用于检测 PKD 特异性抑制剂对施加浓度梯度后 0 和 12 分钟时趋化作用的抑制效果。趋化性 HL60 细胞在实验前用 1 μM PKD 抑制剂 CID755673 预处理 30 分钟。经或未经 PKD 抑制剂处理的 HL60 细胞分别在 RPMI1640 饥饿培养基或 100 nM fMLP 浓度梯度中进行 12 分钟趋化。 （B）示意图显示了追踪的 HL60 细胞的移动路径长度和形态。（C）趋化作用的定量分析，包括总路径长度、速度、方向性和圆度。数据以均值 ± 标准差表示；n 分别为 10、12 和 11，对应无浓度梯度、fMLP 浓度梯度但无 CID755673 处理、以及 fMLP 浓度梯度加 CID755673 处理组。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图3" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig3.jpg" /> 
图3. GPCR介导的PKD1在均匀施加fMLP刺激后发生显著的膜转位。（A）多通道监测PKD1-GFP（绿色）、趋化因子（1 μM fMLP 与 0.1 μg/ml 荧光染料Alexa 594混合，红色）以及DIC（微分干涉差成像），用于识别贴附在4孔板腔室中的HL60细胞，腔室以RPMI 1640培养基中含0.2%明胶的溶液包被。比例尺 = 10 μm。（B）图像序列显示，均匀施加的fMLP（红色）可诱导PKD1-GFP（绿色）发生显著的膜转位。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="图4" src="/files/ftp_upload/54511/54511fig4.jpg" /> 
图4. PKD1 在趋化运动 HL60 细胞前缘的定位。（A）通道模式采集配置有助于可视化微管尖端产生的 fMLP 梯度以及 PKD1 的时空动态。在 A-C 中，HL60 细胞瞬时表达 GFP 标记的 PKD1；为可视化微移液管（DIC）产生的 fMLP 梯度，将 100 nM fMLP（红色）与 0.1 μg/ml 荧光染料 Alexa 594 混合。（B）PKD1 在趋化运动细胞前缘富集定位。比例尺 = 10 μm。（C）融合图像显示 PKD1 定位于 HL60 细胞前缘的后部区域。绿色显示 PKD1 的细胞定位，DIC 图像显示前缘突出区域。比例尺 = 5 μm。 <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54511/54511fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

视觉趋化性检测对于深入理解真核细胞如何调控趋化剂介导的定向细胞迁移至关重要。本文中，我们详细描述了以下两种方法：1）对多个趋化性实验进行实时、高分辨率的监测；2）同时可视化中性粒细胞样HL60细胞中的趋化剂浓度梯度以及信号事件的时空动态变化。

成像中性粒细胞样HL60细胞中G蛋白偶联受体介导的趋化作用及其信号事件

真核细胞能够感知并朝向化学引诱剂梯度移动，这一细胞过程被称为趋化性。趋化性在许多……中发挥关键作用。

该模型的总体目标是实现对多个趋化性实验的同时监测，或对单个趋化细胞的多种信号事件进行可视化观察。Overdeck 的细胞生物学家已开发出多种不同的方法来定量分析细胞的趋化行为。直到最近，我们才得以回答趋化性研究领域的一些关键问题，例如，如何同时监测多个趋化性实验。该技术的主要优势在于应用微流控原理，实时生成高度可重复且可靠的组分，用于同时进行多个高分辨率趋化性实验。本次实验操作将由本实验室的博士后Dr.Xi Wen演示。组装支架时，首先使用杠杆将底座调整至垂直位置，以便杠杆可向使用者方向倾斜。然后，用70%乙醇短暂润湿41毫米玻璃片的表面，并用擦拭纸小心除去乙醇。将玻璃片插入支架底座中，并在其上方放置一片经BSA包被的2毫米方形盖玻片。接着，将小型O型圈插入晶圆外壳底部，并将晶圆外壳安装到支架底座中，使椭圆形孔位于仪器后侧。将支架底座的内层向前拉至水平位置，以固定晶圆仓。使用气吹除尘器清除晶圆仓内部的任何碎屑。然后向仓内加入4毫升含0.1% BSA的RPMI 1640培养基。现在，将包被有BSA的细胞迁移分析装置芯片安装至晶圆腔室中心，使结构面与玻璃接触，并将定位标记置于后侧。将橡胶垫圈上的两个凸起插入孔中，以将垫圈固定在晶圆夹底部，并将大O型圈安装到晶圆腔室顶部。然后将晶圆夹安装到位，使传感器孔位于后侧，并将腔室底座的外侧杠杆向前拉至水平位置，以锁定晶圆夹。组装好支架后，将支架底部置于光源盒上，确认各孔中无气泡。随后移去盖子，将整个装置转移至细胞迁移分析仪单元上方的板上，并将传感器模块固定到支架上。进行细胞迁移实验时，首先将分化后的 HL60 细胞悬浮于添加了 BSA 的 RPMI 1640 培养基中，细胞浓度为每毫升两乘以十的六次方个细胞。然后，将细胞迁移分析装置单元连接到计算机以进行图像采集，并同时打开两个设备。接下来，启动细胞迁移分析装置的软件。在相机图像控制面板中，利用水平线和垂直线实时调整支架的位置，使装置位于相机图像面板的中央。然后选择通道一，将摄像头移至选定的通道，并使用“左移”或“右移”调整摄像头的X坐标，使视野在水平方向居中。为在垂直方向上将图像调整至屏幕中央，请旋转细胞迁移分析装置前面板上的位置调节旋钮。在加热控制器面板上，将持载器温度设置为37摄氏度，培养板温度设置为39摄氏度。使用连接到样品台的温度传感器控制温度时，单击“Heat”以启动加热，然后单击“Holder”。在拍摄面板中，将“Interval”设为15秒，将“Time”设为30分钟，分别用于设定趋化性实验的时间间隔和持续时间。出于安全考虑，勾选“Shooting结束时关闭Heater”选项。然后，保存文件，在备忘录面板中输入实验的具体信息，并确认设备在所有通道中均已居中。接着，将支架中的缓冲液全部移除，并从第一通道顶部起第三个孔中移除8微升缓冲液。使用注射器向同一通道的第二个孔中注入2微升细胞，同时实时观察屏幕，以控制注射过程中的细胞数量和流速。当细胞排列整齐后，立即向孔中重新加入 8 µL 缓冲液，并按照刚刚演示的方法，在第 2 至第 6 通道中重复进行细胞注射。所有细胞添加完毕后，向持载装置中重新加入 2 mL 缓冲液，并在相应通道中从顶部数起第三个孔内加入 1 µL 趋化因子。最后，开始图像采集。 在此代表性实验中，HL60 细胞在加入趋化因子后立即开始沿直线进行趋化运动，并在整个实验的 60 分钟内持续运动，这与趋化梯度稳定性模拟结果一致。通过追踪细胞的运动路径和形态，可对趋化行为进行定量测量和后续比较，所用的趋化指数包括细胞的总路径长度、方向性、运动速度和细胞圆度。在趋化因子中同时应用荧光染料，可建立趋化因子浓度与检测到的荧光染料强度之间的线性关系。此外，在均匀施加的趋化因子刺激下，HL60细胞表现出GFP标记的蛋白激酶D1（GFP-tact PKD1）显著的膜转位现象。在趋化因子梯度环境中，HL60细胞主动将该激酶募集至 Leading edge 的后部。若操作熟练，该过程可在30分钟内完成。进行此操作时，必须严格遵循载具组装的制造商说明，并密切监测细胞注射过程。该技术问世后，为趋化性研究领域的科研人员探索多种趋化性检测方法铺平了道路，例如单基因突变体盘基网柄菌，或其他类型的哺乳动物细胞系统。观看本视频后，您应能够充分理解如何组装装置、开展并行趋化性检测，以及在趋化细胞中同时观察多个信号事件。

imaging-g-protein-coupled-receptor-mediated-chemotaxis-its-signaling

Research

科研

JoVE Journal

Biology

生物学

成像G蛋白偶联受体介导的趋化和信令活动在中性粒细胞样细胞HL60

本文介绍了利用活细胞成像技术测定白细胞对特定配体的趋化反应，并鉴定细胞表面受体与胞质蛋白之间相互作用的方法。...

白三烯B4介导的细胞迁移及BLT1与β-arrestin相互作用的实时成像

本文中，我们描述了用于研究趋化性的详细活细胞成像方法。我们介绍了荧光显微镜技术，用于监测迁移细胞中信号事件的时空动态。对信号事件的测量使我们能够进一步理解GPCR信号网络如何实现对趋化因子梯度的感知，并调控真核细胞的定向迁移。...

成像介导趋化性信号事件的G蛋白偶联受体（GPCR）：以盘基网柄菌（Dictyostelium discoideum）为例

我们描述了一种用于在中性粒细胞趋化因子刺激下，中性粒细胞募集过程中动态测量中性粒细胞与内皮细胞相互作用的明场活体显微镜技术方案。...

通过活体视频显微镜追踪中性粒细胞在组织内的管腔内爬行、跨内皮迁移及趋化运动

本视频展示了使用全芯片法进行中性粒细胞趋化实验。该方法通过免疫磁珠负向筛选直接从全血中分离中性粒细胞，随后在微流控芯片上进行趋化实验。...

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斑马鱼中性粒细胞在伤口反应期间趋化因子受体的活体成像

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原代小鼠CD8+ T细胞的实时体外迁移实验

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成像中性粒细胞样HL60细胞中G蛋白偶联受体介导的趋化作用及其信号事件

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