Name: 通过注射心脏毒素急性骨骼肌再生的诱导 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: 了解通过注射心脏毒素诱导小鼠急性骨骼肌损伤与再生的完整实验方案。该方法利用胫骨前肌损伤模型，结合组织切片与横截面积分析，为再生医学研究提供高可重复性的体内研究工具。

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感谢IGB-CNR动物房和综合显微镜设施。本工作受益于欧洲共同体第七框架计划项目ENDOSTEM（血管相关干细胞和肌肉干细胞的激活以实现肌肉组织的修复与维持，资助协议编号241440）、意大利教育大学研究部（MIUR-PRIN 2010-2011）对G.M.和S.B.的资助、PON IRMI集群项目对G.M.的资助，以及CARIPLO基金会对G.M.和S.B.的资助。

所有实验均严格遵循机构动物研究指南，并根据意大利卫生部公共卫生、动物健康、营养与食品安全部门依据动物实验相关法律批准的程序进行。&#160;颈椎脱位操作可能因机构而异，具体取决于IACUC或其同等机构的要求。
1. 胫骨前肌注射心肌毒素
<ol>
	<li>在开始实验前，用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）或水将心脏毒素（CTX）储备液稀释，配制成10 μM的工作溶液。 
	注意： CTX在水中的溶解度为1 mg/mL。配制70 μM的储备液，分装后于-20 °C保存。本实验方案所用心脏毒素为多种心脏毒素的混合物，其分子量约为7,000 Da。 
	警告： 建议佩戴双层手套、防护口罩和护目镜（或在通风橱内操作以替代护目镜），并格外小心，避免与溶液发生任何接触，即使已稀释。</li>
	<li>通过腹腔注射氯胺酮和赛拉嗪（剂量分别为80 mg/kg和10 mg/kg体重）或其他经批准的麻醉剂对小鼠进行麻醉。</li>
	<li>将小鼠仰面放置，用70%乙醇喷洒其后肢。为准确观察胫前肌（TA）的位置，借助解剖刀在膝关节下方小腿前部剃除毛发。 
	注意： 胫前肌起源于胫骨近端主体，沿骨外侧向下延伸至踝部。其长腱跨过踝关节延伸至足部（见图1A）。</li>
	<li>缓慢回拉注射器活塞，吸取约100 μL溶液。</li>
	<li>将注射器垂直持握（针头朝上）以排除气泡。轻轻下拉活塞，并轻敲注射器管壁，促使附着在管内壁的气泡上浮。缓慢推动活塞以排出大气泡，此时针头会排出数滴液体。由于心脏毒素具有毒性，此时应确保将液体重新吸入管内，避免飞溅。</li>
	<li>继续吸取溶液至所需剂量。每侧胫前肌注射20 μL CTX溶液。</li>
	<li>以胫骨位置为参考，从肌腱向膝关节方向，将针头插入胫前肌中央。由于胫前肌组织较薄，注射时不宜过深（针头插入深度为2/3 mm，角度约为10°至20°），避免穿透肌肉本身（图1A）。</li>
	<li>注射后不要立即拔出针头，应停留2–3秒，以防止CTX溶液从肌肉中渗漏。</li>
	<li>实验结束后，将小鼠置于加热板（37 °C）上的笼子中，直至其苏醒，因为所使用的麻醉剂和乙醇会导致体温下降。</li>
</ol>
2. 胫骨前肌分离
注意：可根据实验需求，在注射心脏毒素后的不同时间点分离肌肉组织。
<ol>
	<li>通过颈椎脱位处死小鼠。</li>
	<li>用70%乙醇喷洒后肢。在操作过程中，可将动物固定在支撑物上以保持其稳定。</li>
	<li>在近端肌腱水平（足部上方）切开皮肤，将剪刀的一侧刀片插入皮肤下方，沿朝向膝盖的方向向上剪开皮肤。借助镊子提起皮肤，完全暴露肌肉。仔细去除目标区域的所有皮肤和毛发。</li>
	<li>消除 筋膜 通过使用尖头镊子或精细显微解剖剪，在胫骨对侧肌肉最外周区域进行缓慢捏压或剪切图1B）。破裂后，轻柔地移除 筋膜 使用细头镊子操作；避免损伤下方肌肉。 
	注意： 与其他肌肉和器官一样，TA 也被覆盖 筋膜 （小腿深筋膜），一种位于皮肤深层的薄层结缔组织，需将其去除以方便分离其下方的肌肉。</li>
	<li>观察足部上方的趾长伸肌腱和胫骨前肌（TA）肌腱，二者相邻。趾长伸肌（EDL）肌肉的肌腱位于TA肌腱稍下方。成年小鼠的肌腱肉眼可见。.</li>
	<li>采用以下两种技术之一去除趾长伸肌（TA肌）：
	<ol>
		<li>用精细的显微解剖剪剪断两条肌腱，并用镊子夹住肌腱向近端牵拉。将两条肌腱分开，轻轻向相反方向牵拉以分离肌肉。</li>
		<li>借助细尖镊子，将镊尖从趾长伸肌腱下方穿过，分离远端趾长伸肌腱与趾长伸肌腱图1C，上图）。轻轻将镊子滑入TA下方，以分离其下方的肌肉（图1C，底部图片）。</li>
		<li>用镊子托住肌肉下方使其略微抬起，切断胫骨前肌（TA）肌腱，并轻轻向上牵拉，直至仅膝关节下方区域仍与肌肉相连图1D，左图）。用剪刀沿肌肉边缘在膝关节下方切断胫前肌（TA）。图1D，右图）。 
		注意： 如果肌肉仍轻微附着在两侧，可使用精细的显微解剖剪帮助分离。 
		注意： 如果镊子不易置于趾长伸肌（TA）下方，则有可能 筋膜 尚未完全去除，可能仍可见于肌肉表面。此时，应彻底清除 筋膜 在继续之前。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 新鲜冷冻肌肉技术
<ol>
	<li>放置少量黄蓍胶或类似的冷冻粘合剂（例如， 最佳切割温度（OCT）包埋剂置于软木切片上。如有需要，可在冷冻前于软木切片背面进行标记图2A).</li>
	<li>为了获得肌肉的横切面，将TA肌肉的远端肌腱插入刺槐豆胶中并使其沉入，保留约3/4的肌肉露在外面，确保肌肉与软木塞呈垂直位置图2A).</li>
	<li>将异戊烷注入铝罐（或金属杯、玻璃烧杯）中。将盛有异戊烷的容器悬置于装有液氮的杜瓦瓶内，注意避免液氮进入容器中。 
	注意： 异戊烷需要达到适当的温度（-150 至 -160 °C）才能实现组织的最佳冷冻。当容器底部出现一些白色固体颗粒且异戊烷变得略微黏稠时，即表示已达到正确温度。 
	注意： 在固体颗粒形成之前不要冷冻样品，以免产生冰冻伪影。另一方面，如果异戊烷完全凝固，请将其置于室温下直至融化，确保仍有部分白色颗粒存在。</li>
	<li>使用 Mixter 镊子，迅速将带有肌肉的软木塞浸入异戊烷中，保持肌肉朝下，并确保软木塞完全浸没于液体时即松开镊子。如此操作后，当标本漂浮时，液体中仅应可见软木塞的背面。</li>
	<li>将样品置于异戊烷中1分钟。</li>
	<li>使用 Mixter 钳（或类似型号的钳子）夹取肌肉组织，浸入液氮中至少 2 min。</li>
	<li>将样本分别用带标签的铝箔纸包裹，并立即置于干冰（-70 °C）中，或直接储存于 -80 °C 超低温冰箱中。 
	注意： 在整个操作过程中，从步骤 3.4 到 3.7，保持适当的温度并防止样本解冻至关重要（例如在转移至 -80 °C 冰箱过程中，温度升高会导致组织内存在的水微晶发生不受控的融化和再冻结，最终引起组织假象的形成或肌纤维的破坏（在组织切片上表现为肌纤维中央出现较大的白色空洞）。</li>
</ol>
4. 冷冻肌肉的冰冻切片
<ol>
	<li>将冷冻切片机腔室温度设置为 -20 至 -22 °C。</li>
	<li>将样品台、刀片和样品放入冷冻切片机腔室内，使其平衡至少30分钟。</li>
	<li>放置少量冷冻剂（例如， 在标本台（OCT包埋剂）上滴加适量OCT包埋剂，于包埋剂凝固前将带有标本的软木塞浸入其中。同时，将刀片装入刀片架中。</li>
	<li>使用提供的螺丝对齐样本和刀片，使样本架与刀片架方向一致图2B).</li>
	<li>将切片厚度设为 10 μm，然后开始切片。每转动一次驱动轮，样品架即向刀片方向推进一段可控距离。</li>
	<li>将切片置于偏振片上（每张载玻片放置8至10个切片）图 2C).</li>
	<li>切片后，将载玻片置于 -80 °C 保存。 
	注意： 样本若得到妥善处理和保存，可存放于-80 °C冰箱中，并可重复用于后续切片。</li>
</ol>
5. 常规组织学染色（苏木精） &amp;#38; 伊红染色)
注意：可根据分析需要对肌肉切片进行多种组织学染色。用于形态学和形态计量学分析的常规组织学染色为苏木精染色。 &amp;#38; 伊红（H&amp;#38;E) 双染色法。苏木精将细胞核染成深紫色。细胞核染色后用伊红（粉红色/红色）进行对比染色，伊红可染嗜酸性结构，例如细胞质中的肌纤维。
<ol>
	<li>将带有切片的冷冻载玻片在室温下完全风干 10 - 15 分钟，将载玻片放入染色架中，并将染色架置于染色缸内。</li>
	<li>用苏木精染色 1 分钟。</li>
	<li>将染色缸置于较弱的自来水流下冲洗 10 分钟，以洗去苏木精。</li>
	<li>如果将使用醇溶性伊红溶液，则将载玻片浸入 95% 乙醇中 5 分钟（若使用水溶性伊红溶液，则跳过此步骤）。</li>
	<li>用伊红溶液复染 1 分钟。</li>
	<li>用水冲洗以去除多余的伊红溶液。 
	注意：每次使用新的苏木精或伊红染液批次时，应优化染色时间。</li>
	<li>将样本依次在梯度乙醇中脱水：50% 和 70% 乙醇（各数秒），迅速浸入 95% 乙醇，随后在 100% 乙醇中更换两次，每次 5 分钟。</li>
	<li>在二甲苯中更换两次进行透明化处理，每次 5 分钟或更长时间。此步骤必须在通风橱中进行。</li>
	<li>使用基于二甲苯的封片介质封片，将数滴封片介质滴加在载玻片上，然后盖上盖玻片。也可将封片介质滴加在盖玻片上，再将盖玻片覆盖于载玻片。
	<ol>
		<li>避免载玻片与盖玻片之间产生气泡。为消除气泡，封片后保持载玻片垂直，并用钝头镊子（或类似钝头工具）轻轻按压盖玻片，挤出多余的封片介质和气泡。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将载玻片置于通风橱中数小时或过夜，使二甲苯完全挥发后再进行分析。</li>
	<li>对 H&amp;#38;E 染色的小鼠再生肌肉切片进行形态学和形态计量学分析，每只小鼠至少采集一个完整肌肉切片的非重叠连续图像。使用明场显微镜以 20 倍放大倍数采集图像。 
	注意：建议至少使用 5 只小鼠，以确保测量结果具有统计学意义。 
	注意：可使用图像分析软件进行分析，例如免费下载软件 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/）。</li>
</ol>

<ol><li>Morgan, J. E., Partridge, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Muscle satellite cells.</a> Int J Biochem Cell Biol. 35 (8), 1151-1156 (2003).</li>
<li>Roca, I., Requena, J., Edel, M. J., Alvarez-Palomo, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+Precursors+from+iPS+Cells+for+Skeletal+Muscle+Cell+Replacement+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Myogenic Precursors from iPS Cells for Skeletal Muscle Cell Replacement Therapy.</a> J Clin Med. 4 (2), 243-259 (2015).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Dumont, N. A., Wang, Y. X., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+and+extrinsic+mechanisms+regulating+satellite+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Intrinsic and extrinsic mechanisms regulating satellite cell function.</a> Development. 142 (9), 1572-1581 (2015).</li>
<li>Hawke, T. J., Garry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myogenic+satellite+cells%3A+physiology+to+molecular+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology.</a> J Appl Physiol. 91 (1985), 534-551 (1985).</li>
<li>Saclier, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+activated+macrophages+orchestrate+myogenic+precursor+cell+fate+during+human+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Differentially activated macrophages orchestrate myogenic precursor cell fate during human skeletal muscle regeneration.</a> Stem Cells. 31 (2), 384-396 (2013).</li>
<li>Pillon, N. J., Bilan, P. J., Fink, L. N., Klip, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-talk+between+skeletal+muscle+and+immune+cells%3A+muscle-derived+mediators+and+metabolic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Cross-talk between skeletal muscle and immune cells: muscle-derived mediators and metabolic implications.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 304 (5), E453-E465 (2013).</li>
<li>Bentzinger, C. F., Wang, Y. X., Dumont, N. A., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+dynamics+in+the+muscle+satellite+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Cellular dynamics in the muscle satellite cell niche.</a> EMBO Rep. 14 (12), 1062-1072 (2013).</li>
<li>Costamagna, D., Costelli, P., Sampaolesi, M., Penna, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Inflammation+in+Muscle+Homeostasis+and+Myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Role of Inflammation in Muscle Homeostasis and Myogenesis.</a> Mediators Inflamm. 2015, (2015).</li>
<li>Charge, S. B., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+regulation+of+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular regulation of muscle regeneration.</a> Physiol Rev. 84 (1), 209-238 (2004).</li>
<li>Arnold, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+monocytes+recruited+after+skeletal+muscle+injury+switch+into+antiinflammatory+macrophages+to+support+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory monocytes recruited after skeletal muscle injury switch into antiinflammatory macrophages to support myogenesis.</a> J Exp Med. 204 (5), 1057-1069 (2007).</li>
<li>Chang, C. C., Chuang, S. T., Lee, C. Y., Wei, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cardiotoxin+and+phospholipase+A+in+the+blockade+of+nerve+conduction+and+depolarization+of+skeletal+muscle+induced+by+cobra+venom%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Role of cardiotoxin and phospholipase A in the blockade of nerve conduction and depolarization of skeletal muscle induced by cobra venom.</a> Br J Pharmacol. 44 (4), 752-764 (1972).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Mann, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+repair+and+fibrosis+development+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Aberrant repair and fibrosis development in skeletal muscle.</a> Skelet Muscle. 1 (1), (2011).</li>
<li>Pessina, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+and+optimized+strategies+for+inducing+fibrosis+in+vivo%3A+focus+on+Duchenne+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skelet+Muscle%22%5BJournal%5D)">Novel and optimized strategies for inducing fibrosis in vivo: focus on Duchenne Muscular Dystrophy.</a> Skelet Muscle. 4 (1), 7(2014).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

此处，我们介绍一种在骨骼肌中诱导急性损伤的实验方案即， 肌肉内注射CTX）。它被广泛用作研究骨骼肌再生动态的有力工具 体内CTX 注射可诱导肌纤维退化，这是由于肌膜去极化及纤维收缩所致。12，并触发一系列导致肌肉再生的事件。根据实验需求，在注射和损伤后的特定时间点解剖获取骨骼肌，用于后续组织学分析。解剖所得的肌肉组织可包埋于冷冻保护介质后冷冻保存，或进行石蜡包埋。然而，这些方法需经多聚甲醛预固定步骤，可能产生组织学伪影，进而影响后续分析结果。直接冷冻组织可避免此问题。值得注意的是，许多一抗仅在新鲜冷冻的肌肉切片上或在该条件下表现出更佳的免疫反应活性。13，这使得该实验方法更加可靠。形态计量分析通常在时间序列实验中进行，以便评估相同年龄、具有特定基因突变和/或接受药物处理的小鼠组间再生过程的差异。尽管CTX诱导损伤的实验方案本身具有高度可重复性，但其可能的局限性在于CTX注射操作依赖于操作者，存在操作者间变异。为克服这一局限性，建议整个时间序列实验由同一操作者完成。
肌肉再生的程度可以通过健康肌纤维、坏死...

哺乳动物成体的骨骼肌由多核肌细胞（肌纤维）的束状结构（肌束）组成，这些细胞特化用于收缩功能。每条肌纤维均为细长的合胞体，外被肌膜（质膜），内部含有肌原纤维，而肌原纤维由规则且重复排列的收缩蛋白（肌动蛋白和肌球蛋白丝）构成。在成体生命阶段及静息状态下，骨骼肌的肌核更新率极低1；事实上，位于肌纤维周边、肌膜下方的肌核停滞于细胞周期的G0期，无法进行增殖1,2。
骨骼肌在受损后具有独特的再生能力，经过一系列紧密关联的组织重塑事件后可恢复稳态。在发生急性损伤或创伤后，首先出现变性过程，随后启动再生过程，该过程涉及多种细胞群体，包括位于肌肉组织中的固有细胞群体——卫星细胞（SCs）。事实上，在无任何外界环境刺激的情况下，卫星细胞处于静息状态，定位于肌膜与基底膜之间的特化微环境之中3,4。在损伤或疾病发生后，卫星细胞被激活，进而增殖、迁移至受损区域，并最终分化，形成新的肌纤维5。激活的卫星细胞与多种细胞群体建立相互作用，主要是与被募集至损伤部位的炎性细胞之间的交互作用6-8。这种细胞间的交互作用使细胞遵循一种受调控的模式，通过分子信号引导结构改变，最终实现组织稳态9。除卫星细胞外，炎性细胞、间质细胞、血管生成过程以及再神经化事件也共同参与修复过程，以协调一致的方式恢复这一高度有序且特化的组织结构。
人们对骨骼肌再生的不同方面具有浓厚的研究兴趣，不仅是为了理解肌肉的生理学特性，也是为了改进需要更深入了解整个再生过程的治疗策略。目前已有多种实验方法可用于研究不同细胞群体的身份与功能、信号通路以及参与其中的分子机制。急性损伤的小鼠模型是研究该过程多个方面的有力工具。多种常用的诱导急性肌肉损伤的技术使研究人员能够追踪再生过程。 体内从过程的最初阶段到最终分析。本方案详细描述了从注射蛇毒来源的心脏毒素（cardiotoxin, CTX）诱导肌细胞溶解并启动再生过程，到组织样本分析的全部步骤。在向小鼠注射CTX后，可根据实验需求在不同时间点处死动物，解剖分离骨骼肌组织并进行后续处理。最后，本文介绍了组织切片的染色方法，用于形态学观察和基础定量分析。该方案可用于急性骨骼肌再生的研究。 体内 以高度可重复的方式10.

<table><tbody><tr><td>来自&amp;nbsp;&lt;em&gt;Naja mossambica mossambica&lt;/em&gt;的 心脏毒素</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>C9759</td><td></td></tr><tr><td>BD Micro-Fine+ 胰岛素注射器，30 G × 8 mm 针头，0.3 mL</td><td>BD</td><td>324826</td><td></td></tr><tr><td>刺梧桐胶</td><td>MP BIOMEDICALS,LLC</td><td>104792</td><td></td></tr><tr><td>2-甲基丁烷（异戊烷）</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>78-78-4.</td><td></td></tr><tr><td>OCT 冰冻切片包埋剂（Killik 溶液）</td><td>Bio-optica</td><td>&amp;nbsp;05-9801</td><td></td></tr><tr><td>Feather 微切片刀 S35</td><td>Bio-optica</td><td>&amp;nbsp;01-S35</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 玻片</td><td>Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>09-OPLUS</td><td></td></tr><tr><td>Dumon #5 镜面抛光镊子&amp;nbsp;</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>11251-23</td><td></td></tr><tr><td>直型锐/锐手术剪</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Noyes 直型手术剪</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>15012-12</td><td></td></tr><tr><td>精细直型虹膜剪，锐/锐，10.5 cm</td><td>2BIOLOGICAL INSTRUMENTS</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt 封片剂</td><td>Bio-optica</td><td>09-00100</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>BIOSIGMA</td><td>VBS651</td><td></td></tr><tr><td>二甲苯</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>214736</td><td></td></tr><tr><td>乙醇 100%</td><td>sigma-Aldrich</td><td>02860-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>苏木精</td><td>J.T. BAKER</td><td>3873</td><td></td></tr><tr><td>伊红</td><td>SIGMA ALDRICH</td><td>HT110116</td><td></td></tr><tr><td>冰冻切片机</td><td>LEICA</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr></tbody></table>

通过注射心脏毒素诱导急性骨骼肌再生

Induction of Acute Skeletal Muscle Regeneration by Cardiotoxin Injection

骨骼肌再生是一种生理性过程，发生在成体骨骼肌受到损伤或疾病影响时。由急性损伤诱导的骨骼肌再生是一种广泛应用且强有力的研究模型系统，可用于研究参与肌肉再生的各种事件、机制及不同作用分子。事实上，深入了解这一过程对于更好地理解导致骨骼肌退变的病理状态至关重要，并有助于发现新的靶向治疗策略。本研究介绍了一种在小鼠中通过单次肌内注射心脏毒素（CTX）诱导急性骨骼肌再生的详细且可重复的实验方案。CTX属于蛇毒毒素家族，可引起肌纤维的肌溶解，从而最终触发再生过程。通过肌肉切片的组织学分析来评估骨骼肌再生的动态变化。该方案还详细说明了胫骨前肌的解剖、冷冻和切片等实验操作步骤，以及广泛用于后续形态学和形态计量学分析的常规苏木精与伊红染色（Hematoxylin &amp;#38; Eosin staining）方法。

H&amp;E 染色可用于评估骨骼肌再生过程中特定时间点的组织形态学变化。图3展示了对野生型小鼠损伤胫前肌（TA）进行的时间进程分析。肌肉分别在注射 CTX 后第 3、7、15 和 30 天被分离，如图3A所示。H&amp;E 染色的横切面代表性图像显示了骨骼肌修复随时间的动态变化过程（图3B-E）。损伤后第 3 天，肌肉的结构完全被破坏，退化的肌纤维（坏死区域）和单核细胞均清晰可见（图3B）。这一异质性细胞群体主要包括瞬时扩增的卫星细胞（成肌细胞）、从血液中募集的炎性细胞11，以及参与再生过程的间质细胞和内皮细胞，这些过程在损伤部位被激活。在此背景下，新生的再生肌纤维由成肌细胞融合并分化形成。再生区域的主要特征是出现具有中央细胞核和深染细胞质的小型嗜碱性肌纤维（图3C）。此阶段仍可见炎症反应，但其程度逐渐减弱。随着时间推移，再生肌纤维的尺寸逐渐增大，形成具有中央细胞核的嗜酸性再生肌...

本文描述了一种在成年小鼠中诱导急性骨骼肌再生的详细方案，以及对肌肉进行后续操作的方法，例如解剖、冷冻、切片、常规染色和肌纤维横截面积分析。

骨骼肌再生是一种生理性过程，发生在成体骨骼肌中，以应对损伤或疾病。由急性损伤诱导的……

本实验的总体目标是建立一种小鼠骨骼肌急性损伤模型，以在体内研究从再生过程的最初阶段到最终完成的整个再生过程。小鼠肌肉急性损伤模型是研究再生过程多个方面的有力工具。该技术的主要优势在于其涉及的所有步骤均具有高度可重复性。开始此操作时，将几滴70%乙醇滴加到麻醉小鼠的后肢上。为了清晰观察胫骨前肌的准确位置，用手术刀去除小腿前部的毛发。为了注射心脏毒素溶液，将100 µL该溶液吸入注射器中。将注射器垂直持握，排出气泡。然后，以胫骨位置为引导，从肌腱朝向膝盖的方向，将针头插入胫前肌（TA）的中心部位。注射时不要刺入过深，并避免穿透肌肉本身。在拔出针头前等待两到三秒，以防止肌肉中的心脏毒素泄漏。在安乐死动物的后肢上滴加几滴70%乙醇。在近端肌腱水平处剪开皮肤，然后将剪刀的一个刀片插入皮下，沿朝向膝盖的方向剪开皮肤。将皮肤拉起，完全暴露肌肉。仔细清除目标区域的所有皮肤和毛发。随后，通过缓慢捏住或剪除肌肉的最外周部分，去除筋膜。一旦筋膜破裂，借助尖头镊子轻轻将其去除，注意避免损伤下方的肌肉。观察足部上方的胫前肌远端肌腱，然后将镊子尖端从肌腱下方穿过，分离胫前肌远端肌腱与趾长伸肌肌腱。轻轻将镊子滑入胫前肌肌腱下方，以分离其与下方肌肉的连接。将镊子置于肌肉下方，以保持肌肉略微抬起。剪断胫骨前肌肌腱，并轻轻向上牵拉，直至仅膝下区域仍与肌肉相连。随后，沿剪刀紧贴肌肉边缘，在膝下方剪断胫骨前肌。取少量阿拉伯胶置于一片软木切片上。将趾长伸肌（TA）的远端肌腱插入阿拉伯胶中，使约四分之三的肌肉露在外部，并确保肌肉与软木呈垂直位置。随后，用异戊烷填充一个铝罐。将异戊烷罐悬置于装有液氮的杜瓦瓶中。当异戊烷达到适当温度时，罐底会形成白色固体颗粒。迅速将带有肌肉的软木塞浸入异戊烷中，保持肌肉朝下的位置。当标本漂浮时，液体中应仅可见软木塞的反面。将样品置于异戊烷中一分钟。之后，将肌肉组织浸入液氮中至少两分钟。然后，将样本分别用带标签的铝箔包裹，并立即放入干冰中。在操作过程中，保持适当的温度并防止样本解冻至关重要。在此步骤中，将样本台、刀片和样本放入冷冻切片机腔室内，使其平衡至少30分钟。接下来，将少量冷冻包埋剂涂于样品台表面，赶在包埋剂凝固前，将带有样品的软木塞浸入OCT包埋剂中。将刀片安装至刀片架上。将样品放入相应的样品架中。以10微米的厚度切片。然后将切片置于偏振片上。切片完成后，将载玻片在80摄氏度下保存。在化学通风橱中，将带有切片的冷冻载玻片于室温下完全风干 10 至 15 分钟。然后将载玻片放入染色缸中。用苏木精染色 1 分钟。随后，将染色槽置于较弱的自来水流下冲洗10分钟，以洗去苏木精。接着，用伊红溶液对切片复染1分钟，然后用水冲洗以去除多余的伊红溶液。随后，将样品依次置于50%、70%的梯度乙醇中脱水。之后，将样品迅速浸入95%乙醇，再经两次100%乙醇更换处理。用二甲苯更换两次，每次至少五分钟，以清除样品。将二甲苯基封片剂滴加数滴至每张载玻片上，然后盖上盖玻片进行封片。将载玻片置于通风橱中数小时或过夜。图中显示了急性骨骼肌损伤的实验方案。以下是损伤后指定天数经毒素处理肌肉的苏木精-伊红染色切片的代表性图像。一些坏死的肌纤维（由黑色实线圈出）可能已被炎性细胞侵入。虚线标记了浸润的单核细胞区域。黑色圆圈指示了一个细胞核位于中央的未成熟肌纤维。此处可见大量再生的嗜酸性肌纤维，其细胞核位于中央，由黑色圆圈标出。该图显示了TA肌肉切片中中心核肌纤维大小值的平均值。此图展示了注射 cardiotoxin 后6、15和30天的肌纤维横截面积分布。通过该操作流程，骨骼肌切片可用于执行不同的组织学和免疫荧光实验方案，以鉴定肌肉组织的特定特征。观看本视频后，您应能充分理解如何研究急性损伤后骨骼肌再生过程的不同方面。

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发育生物学

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模拟丁氏滚压法对竹叶青蛇毒诱导大鼠肌肉损伤的影响

本文所述方案可通过单细胞质谱流式细胞术对肌肉干细胞和祖细胞进行鉴定和高维分析，并通过荧光激活细胞分选（FACS）对其进行纯化，以深入研究其功能。该方法可用于研究疾病模型中的再生动态，并评估药物干预的效果。...

利用高维单细胞质谱流式技术在急性骨骼肌损伤过程中体内鉴定与分析成肌祖细胞

了解通过注射心脏毒素诱导小鼠急性骨骼肌损伤与再生的完整实验方案。该方法利用胫骨前肌损伤模型，结合组织切片与横截面积分析，为再生医学研究提供高可重复性的体内研究工具。

通过注射心脏毒素诱导急性骨骼肌再生

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