在小鼠犁鼻急性组织切片定义细胞群的深入生理学分析
2016年9月10日
在这里，我们描述了一种生理学方法，该方法允许使用全细胞膜片钳记录来识别和深入分析小鼠犁鼻器官急性冠状组织切片中确定的感觉神经元群。
该程序的总体目标是对小鼠犁鼻器官急性组织切片中确定的感觉神经元群进行单细胞电生理分析。这种方法可以帮助阐明化学感觉领域的关键问题，例如不可见化学检测的机制。该技术的主要优点是，通过记录急性组织切片中的感觉神经元，可以在其天然环境中研究这些细胞。
要开始此过程，在牺牲动物后，通过口腔插入一把大手术剪刀来去除其下颌骨，并分别切割每一侧的下颌骨和肌肉。接下来，用中等镊子去除上颌和鼻尖周围的皮肤，以便更好地接触门牙。然后用骨剪刀在喙方向上以 45 度角切掉门牙的最大部分，以方便从鼻腔中取出 VNO 胶囊。
不要切开牙根，以免损坏 VNO 胶囊的尖端。之后，用中等镊子抓住坚硬的上颚，然后小心地以平角切成一块。用冰冷的溶液 S2 反复冲洗舷腔。然后用微型弹簧剪刀剪开犁骨尖端和下巴之间的骨积液。
插入剪刀尖端，使弯曲部分指向远离 VNO 的。并在 VNO 囊的外侧，在左侧和右侧以小步骤小心地切割骨头。要取出 VNO 胶囊，请切开尾部的犁骨，并使用中等镊子小心地将犁骨从鼻腔中取出。
立即将 VNO 转移到冰凝胶袋上的立体显微镜下的小培养皿中，在那里应进行解剖的其余步骤。接下来，用少量冰冷的 S2 冲洗 VNO，以防止组织变干。然后，用中等镊子抓住犁骨的后部，分离含有 VNO 软组织的软骨胶囊。
为此，将胶囊定位为背视图，以便可以看到两个 VNO 之间的分割。使用细镊子的尖端将两个软骨 VNO 胶囊与中央骨分开，同时保持犁骨固定在后部。确保去除之前附着在犁骨上的内侧软骨壁。
去除 VNO 周围的软骨时，仅在软骨囊的边缘使用镊子。并且要非常小心，不要损坏脆弱的感觉上皮。要去除剩余的软骨，请将 VNO 的弯曲侧侧转向培养皿的底部，并使用镊子牢固地固定一侧的软骨。
然后小心地将第二个细镊子从背面以软骨和 VNO 之间的非常平坦的角度移动，以松开组织和软骨之间的连接。为避免损伤感觉上皮，将 VNO 放在其尾尖，慢慢地将 VNO 从软骨上剥离。从胶囊中撬动 VNO 后，去除所有剩余的小软骨部分，因为在切片过程中，任何剩余的软骨碎片都会使组织与周围的琼脂糖分离。
接下来，将一小滴冰冷的 S2 放在第一个解剖的 VNO 上，以防止组织损伤。要嵌入 VNO，请用融化的 S3 将两个小培养皿填充到边缘。之后，将每个 VNO 浸入琼脂糖中并水平来回移动数次，以去除细胞外溶液膜以及其表面的任何气泡。垂直放置 VNO，喙尖朝向培养皿底部。
随后，将两个培养皿放在凝胶冰袋上，等待琼脂糖凝固。琼脂糖开始凝固后，不要改变 VNO 方向，因为这会使组织与周围的琼脂糖分离。在此过程中，使用小刮刀将琼脂糖块从小培养皿中取出到大培养皿的盖子中，然后将琼脂糖倒置，使 VNO 的喙尖朝上。
接下来，使用手术刀将块切成金字塔形，注意不要损坏嵌入的组织。然后，使用强力胶将金字塔形块固定到振动切片机标本板的中心。然后等待大约一分钟，让胶水完全干燥。
将标本切成 150 至 200 微米厚的切片。在解剖显微镜下简要检查切片形态。然后将所有切片转移到充氧室直至使用。
在此步骤中，将 VNO 切片转移到成像室，并使用与第一毫米厚的合成纤维相连的不锈钢锚固定切片位置。不要用任何合成纤维线覆盖组织切片。接下来，将成像室转移到记录装置中，并在室温下用含氧 S2 连续灌注切片。
将抽吸毛细管调整到溶液表面，以产生恒定的浴液交换。然后调整八合一多桶 Profusion 铅笔，使其靠近包含血管的 VNO 切片的非感觉部分。然后，使用填充有 150 毫摩尔氯化钾的 L 形琼脂桥连接参比电极和浴液。
随后用移液管溶液 S4 填充膜片移液管。将移液器安装在连接到头部载物台的氯化银涂层电极上，无需刮掉涂层并牢固连接。然后在进入浴槽之前对贴膜移液管施加轻微的正压。监控移液器并确保其介于 4 兆欧和 10 兆欧之间。
使用红外优化 DIC 的 CCD 相机可视化 VNO 切片，并使用荧光照明和适当的滤光片立方体识别表达 FPR-rs3 i-Venus 的细胞或类似标记的神经元。使用手轮接近细胞体以获得最大灵敏度。由于正压，一旦移液器吸头靠近，细胞胞膜上的小凹痕就会变得可见。
然后释放正压并施加轻微的负压以吸入细胞膜，以获得 1 至 20 GiΩ 的高电阻密封。随后进行短促而轻柔的抽吸，以破坏细胞膜并建立整个细胞结构。在该图中，冠状 VNO 组织切片的共聚焦图像显示了荧光 FPR-rs3 Tau Venus 阳性神经元在犁鼻感觉上皮中的分布。
FPR-rs3 Tau Venus 阳性神经元在管腔边界处表现出单个顶端树突，末端为旋钮状结构。这里显示的是 VSN 体细胞执行的全细胞膜片钳记录。以下是 TTX 敏感快速激活钠电流和 FPR-rs3 正 VSN 的批发膜片钳记录的代表性迹线。
控制条件下的电压步长记录揭示了电压相关的快速和瞬态向内电流。1 微摩尔的 TTX 治疗会强烈降低电流。此处显示的数字减去迹线显示了 TTX 敏感电压门控钠电流。
代表性的电流钳迹线显示去极化和超极化，以及逐步注入正负电流时产生的动作电位序列。一旦掌握，两个 VNO 的整个解剖和组织切片过程可以在大约一小时内完成。遵循此程序，可以执行其他方法，例如细胞外松散补丁记录或钙成像，以便在分析更大的神经元群时提高通量。
看完这个视频，你应该对如何从口腔犁鼻器官制作急性组织切片，以及如何从犁鼻感觉神经元进行单细胞电生理记录有很好的了解。
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概述
本文描述了一种使用全细胞膜片钳记录来识别和分析小鼠犁鼻器感觉神经元的生理学方法。该方法允许对急性组织切片进行深入的电生理分析，从而提供有关化学感受机制的见解。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 生理学
- 化学感受
背景
- 犁鼻器对于检测信息素和其他化学信号至关重要。
- 了解感觉神经元的功能可以揭示化学检测的机制。
- 全细胞膜片钳记录允许对神经元活动进行详细分析。
- 急性组织切片保持了神经元的原生环境。
研究目的
- 对感觉神经元进行单细胞电生理分析。
- 阐明化学感受的机制。
- 在其原生环境中研究感觉神经元的功能性。
使用的方法
- 从小鼠犁鼻器制备急性冠状组织切片。
- 使用全细胞膜片钳记录来分析神经元活动。
- 采用精细的手术技术来接触犁鼻器。
- 分析感觉神经元对化学刺激的反应。
主要结果
- 识别犁鼻器中的特定感觉神经元群体。
- 了解这些神经元的电生理特性。
- 展示了使用急性组织切片进行分析的优势。
- 为理解化学检测机制做出贡献。
结论
- 该方法为研究感觉神经元提供了一个稳健的框架。
- 研究结果增强了对化学感受机制的认识。
- 未来的研究可以在此方法基础上进一步探索该领域的问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This method enables precise electrophysiological characterization of defined neuronal populations in native tissue, supporting target validation in chemosensory drug discovery. By preserving physiological context, it enhances predictive confidence in early-stage screening of compounds targeting GPCR-mediated pathways. The approach aids mechanistic de-risking for targets involved in social behavior, stress response, and neuroendocrine regulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of specific chemosensory neuron subtypes expressing defined GPCR repertoires.
- Operational Value: Supports target de-risking through direct measurement of neuronal excitability and signal transduction in native tissue.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a physiologically relevant platform for assessing ligand-induced activity in primary sensory neurons.
- Operational Value: Enables standardized electrophysiological readouts for compound screening in acute slices.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates biomarker alignment by linking receptor activation to downstream neuronal firing patterns.
- Operational Value: Supports continuity from target hit validation to preclinical functional assessment.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing functional validation of chemosensory targets prior to lead optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of receptor-ligand interactions in native neuronal populations.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible electrophysiological outputs for compound effect assessment.
- Analytics: Generates voltage- and current-clamp data to characterize neuronal response kinetics and threshold properties.
- Translational Research: Links electrophysiological phenotypes to chemosensory function for predictive modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for profiling multiple chemosensory receptor systems across genetically defined models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence through direct measurement of native neuronal physiology.
- Operational Value: Promotes assay reproducibility via standardized slice preparation and recording conditions.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by reducing false positives from non-physiological systems.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of chemosensory targets based on functional validation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in electrophysiology, tissue dissection, and fluorescence-guided cell identification.
- Dependent on vibratory microtome, patch-clamp amplifier, and perfusion system for slice viability.
- Necessitates standardized oxygenated artificial cerebrospinal fluid and temperature control for consistent results.
- Adaptation to other chemosensory systems depends on availability of genetically labeled neuronal lines.
- Limited throughput constrains large-scale screening but supports secondary validation of hits from high-throughput assays.
