从Cryomilled哺乳动物细胞中的蛋白质复合物亲和捕获
2016年12月9日
这里，我们描述协议破坏由固态研磨哺乳动物细胞在低温下，产生从所得细胞粉细胞提取物，并且在抗体偶联微米级的顺磁珠亲和捕获隔离感兴趣的蛋白质复合物。
该亲和捕获方案的总体目标是从哺乳动物细胞中分离内源性蛋白质复合物。这种方法可以帮助回答细胞和分子生物学中的关键问题，例如哪些蛋白质一起形成物理连接的功能模块。该技术的主要优点是可以同时观察到与目标靶蛋白相关的许多物理相互作用。
按照文本方案中的说明培养 1 到 8 克细胞。将生长培养基倒入一个大烧杯中。然后，将培养皿放在一个大矩形冰盘中的冰上。
向培养皿中加入 20 毫升冰冷的 1x 磷酸盐缓冲盐水或 PBS，并使用大型细胞刮刀从培养皿中释放细胞。将细胞转移至冰上预冷的 50 mL 试管中。在同一盘子中再加入 10 毫升冰冷的 1x PBS。
收集剩余的细胞并将其转移到 50 毫升试管中。对每道菜重复此过程。来自不同培养皿的细胞悬液可以混合，以减少样品数量和塑料浪费。
接下来，在 4 摄氏度下以 1， 000 x g 的离心速度将样品离心 5 分钟。离心后，小心地倒出上清液。将每个沉淀重悬于 10 毫升冰冷的 1x PBS 中。
将重悬的沉淀物巩固为每 50 ml 试管最多 5 个。用 10 毫升 PBS 清洗空管。将溶液添加到固结的样品中，并像以前一样离心。
去除上清液后，将沉淀重悬于 10 毫升冰冷的 1x PBS 中。从 20 毫升注射器中取出柱塞并将其放在一边。盖上注射器的喷嘴，将注射器放入 50 毫升试管中，然后将细胞悬液转移到那里。
在 4 摄氏度下以 1000 x g 离心 5 分钟。用连接到真空捕集系统的细头移液管吸出上清液，直到细胞的顶层开始被吸走。这会产生湿细胞沉淀。
打开注射器盖，插入柱塞，将细胞直接滴入装满液氮的大塑料烧杯中，该烧杯盛在聚苯乙烯泡沫塑料盒中的液氮浴中。强行将剩余的细胞从注射器中插入。接下来，将冷冻细胞倒入 50 毫升试管中。
松散地盖上试管，让多余的液氮蒸发。将它们在 80 摄氏度下放置过夜。第二天完全拧紧盖子。
冷冻细胞可以以这种方式储存在 80 摄氏度下，直到低温研磨。从 80 摄氏度冰箱中取出细胞珠，并将其放入液氮浴中的 50 毫升试管架中。将一个 50 毫升的罐子、两个 20 毫米的球和罐盖预冷在一个装有液氮的干净矩形冰桶中。
此外，对 PTFE 绝缘体进行预冷。使用一组冰球或袖子和冰球。在铣床上设置适当的平衡。
使用镊子，将两个预冷的 20 毫米研磨球和冷冻细胞放入预冷的研磨罐中。将液氮加入罐中至半满，盖上罐盖，然后将组件转移到研磨机中。将组件夹紧到位并执行三个铣削循环，使用 400rpm 的程序，三分钟，每分钟反向旋转，无间隔中断。
在铣削过程中听到球的嘎嘎声至关重要，这表明球正在碰撞并粉碎材料。如果听不到此声音，则表示未进行铣削。完成三个研磨周期后，将罐子移回液氮中，并让它暂时冷却。
小心地取下盖子。用镊子取出球，并使用预冷的抹刀将粉末转移到预冷的 50 毫升试管中。请注意，在罐子中加入液氮有助于去除结块在球上的粉末。
对于细胞提取物制备，称取 100 毫克细胞粉末放入预冷的 1.5 或 2 毫升微量离心管中。用空微量离心管去皮分析天平。使用液氮冷却的勺子或抹刀将细胞粉末分配到试管中。
在将试管放回液氮之前，请在分析天平上检查试管内分配的粉末的质量。打开装有细胞粉末的试管，在室温下静置 1 分钟以释放试管内的压力，并防止提取缓冲液加入粉末时立即冻结。向试管中加入 400 微升萃取剂，并补充有蛋白酶抑制剂。
短暂涡旋试管，然后保持冰。使用微尖超声仪给样品一个短暂的低能脉冲并分散任何聚集体。离心澄清提取物。
最后，去除上清液并继续进行亲和捕获。要预洗亲和介质，请将含有抗体偶联顺磁珠的试管放在磁力架上。微珠会在几秒钟内积聚在试管侧面，从而可以去除储存溶液。
然后，向珠子中加入 500 μL 提取缓冲液。以中速短暂涡旋混合。另外，在微型离心机中旋转试管，将所有内容物收集到试管底部。
然后将试管放在磁力架上并吸出溶液。通过将澄清的细胞提取物转移到含有预洗亲和培养基的试管中并短暂涡旋来启动亲和捕获。将试管在 4 摄氏度下孵育 30 分钟，并在旋转轮上连续温和混合。
珠子应在整个孵育过程中保持悬浮状态。吸出上清液，用 1 毫升冷提取缓冲液洗涤珠子 3 次。要洗脱蛋白质，请添加不含还原剂的 SDS 页面样品缓冲液，以减轻抗体链从珠子中释放。
在室温下搅拌孵育 5 到 10 分钟。收集并保存上清液，然后将样品置于 SDS 页面，然后使用标准技术进行蛋白质染色。可以切除单个蛋白质条带进行鉴定，或者可以通过仅对样品进行短暂电泳，在一次分析中表征整个样品。
包含用于亲和捕获的不溶性培养基的材料会影响回收的蛋白质组。此处显示的是磁珠、铁浸渍琼脂糖和传统琼脂糖。每种培养基都与抗 FLAG M2 抗体偶联，用于捕获加标到冷冻研磨 HEK 293 细胞产生的提取物中的 FLAG 标记的细菌碱性磷酸酶。
微米级磁珠显示出最干净的轮廓，表明非特异性蛋白质吸附水平相对较低。细胞裂解的方法也会影响恢复的蛋白质组。在这里，从冷冻研磨或超声处理的细胞提取物中对内源性蛋白质复合物进行亲和捕获。
当从低温研磨的细胞粉末中生产细胞提取物时，观察到的高质量污染物较少。尽管磁性介质可能表现出比其他培养基更低的背景，但抗体本身可能促进假阳性污染的吸附，尤其是在没有靶抗原的情况下。为了确定当抗体旁位被或未被占据时抗 FLAG 磁性介质产生的背景结合，在存在或不存在 3x FLAG 肽加标的情况下，使用 HEK 293T 细胞提取物进行了模拟亲和捕获实验。
在没有同源表位的情况下，α FLAG 培养基确实捕获了可检测水平的背景蛋白，这些蛋白可以用 3x FLAG 肽竞争性地逃避，而 SDS 页面样品缓冲液可以在更大程度上逃避。观察到主要污染物种类在 37 到 50 道尔顿之间。在存在竞争性表位的情况下，基于 3x FLAG 和 SDS 的洗脱液相对而言不受背景蛋白结合的影响。
在尝试此程序时，仔细、快速和精确地工作很重要。跟踪您的程序和观察到的任何变化，以了解哪些步骤对您的结果最关键。在此程序之后，可以执行其他方法，例如质谱、速率区带离心和电子显微镜，以分析混合物的组成、其均匀性水平以及组成大分子复合物的大小和形状。
亲和捕获技术开发后，为蛋白质组学领域的研究人员铺平了道路，以无与伦比的细节探索生理蛋白质复合物的组成，这仍然是一项正在进行的全球研究工作。观看此视频后，您应该对如何制备用于低温研磨的哺乳动物细胞以及如何对目标蛋白质进行亲和捕获有很好的了解。
概述
本文介绍了一种详细的协议，用于在低温条件下使用固态研磨来破坏哺乳动物细胞。该过程包括制备细胞提取物和通过抗体耦合的顺磁性珠的亲和捕获来分离蛋白质复合物。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 分子生物学
- 蛋白质化学
背景
- 理解蛋白质相互作用在细胞和分子生物学中至关重要。
- 亲和捕获技术允许同时观察多种蛋白质相互作用。
- 低温条件下的固态研磨提高了细胞破坏效率。
- 该方法可以促进哺乳动物细胞中蛋白质复合物的研究。
研究目的
- 从哺乳动物细胞中分离内源性蛋白质复合物。
- 提供一种研究蛋白质相互作用的可靠方法。
- 提高蛋白质复合物分离技术的效率。
所用方法
- 使用冰冷的PBS进行细胞培养和收获。
- 低温研磨细胞以产生细粉。
- 制备含有蛋白酶抑制剂的细胞提取物。
- 使用抗体耦合的顺磁性珠进行亲和捕获。
主要结果
- 从破坏的哺乳动物细胞中成功分离出蛋白质复合物。
- 展示了低温研磨在细胞破坏中的效率。
- 亲和捕获在蛋白质复合物分析中的有效应用。
- 在多次试验中结果具有可重复性。
结论
- 所描述的协议是研究蛋白质相互作用的有价值工具。
- 低温条件下的固态研磨显著提高了细胞破坏效率。
- 该方法可以应用于细胞生物学中的各种研究问题。
常见问题
Executive Industry Relevance
This protocol enables biopharma R&D teams to isolate endogenous protein complexes from mammalian cells using cryomilled cell powder and antibody-coupled paramagnetic beads, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving native protein interactions and reducing non-specific binding, the method enhances predictive confidence in protein-protein interaction data, informing lead identification and portfolio triage decisions. The approach addresses a key discovery-stage challenge: obtaining reproducible, physiologically relevant interactome profiles to reduce biological risk in downstream therapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by isolating physically-linked functional modules of target proteins.
- Operational Value: Reduces macromolecular dissociation and enzymatic degradation during extract preparation, improving complex integrity.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through high-fidelity capture of endogenous complexes, minimizing false positives in interaction mapping.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Produces clarified cell extracts suitable for downstream affinity-based assays and interaction screening.
- Operational Value: Utilizes micron-scale magnetic beads that eliminate size exclusion limits and allow rapid magnetic separation, increasing throughput.
- Assay Readiness: Delivers low-background proteomes when combined with cryomilling, enhancing signal-to-noise in compound screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains native complex composition from discovery through preclinical validation, supporting biomarker alignment.
- Mechanistic De-risking: Enables comparison of lysis methods (e.g., cryomilling vs. sonication) to assess impact on contaminant profiles and complex homogeneity.
- Risk-Adjusted Advancement: Facilitates go/no-go decisions by quantifying background binding via mock capture experiments with peptide spike-ins.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target engagement to lead optimization, where reliable complex isolation informs mechanistic understanding and assay design.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by isolating endogenous complexes for further analysis.
- Screening: Generates reproducible extracts with consistent protein concentration, enabling reliable compound evaluation in interaction assays.
- Analytics: Provides quantitative outputs compatible with mass spectrometry, rate-zonal centrifugation, and electrophoresis for complex characterization.
- Translational Research: Connects discovery-phase interaction data to preclinical continuity through preserved native-state complexes.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable platform for interactome analysis applicable across multiple targets and projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through cryomilled powder handling and magnetic bead manipulation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, reducing late-stage failure due to flawed biological assumptions.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering comparable interaction profiles across lysis methods and bead types.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic handling, cell disruption, and affinity capture techniques.
- Dependent on access to cryomilling equipment, liquid nitrogen infrastructure, and magnetic separation tools.
- Necessitates cross-team standardization of extract preparation and bead washing protocols to ensure reproducibility.
- Involves adaptation considerations when transferring the method to different mammalian cell lines or tissue sources.
- Includes practical limitations such as the need to monitor ball collision during milling and prevent premature freezing of extraction buffer.
