从冷冻研磨的哺乳动物细胞中进行蛋白质复合物亲和捕获

本亲和捕获实验方案的总体目标是从哺乳动物细胞中分离内源性蛋白质复合物。该方法有助于解答细胞生物学和分子生物学中的关键问题，例如哪些蛋白质会共同形成物理连接的功能模块。该技术的主要优势在于，可同时观察到与目标蛋白相关的多种物理相互作用。

按照文本方案所述，培养一至八克细胞。将培养基倒入一个大烧杯中，然后将培养皿置于盛有冰块的大号长方形冰盘上，冰上放置。

向培养皿中加入 20 毫升预冷的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），使用大号细胞刮刀将细胞从培养皿上刮下。将细胞转移至预先在冰上预冷的 50 毫升离心管中。向同一培养皿中再加入 10 毫升预冷的 1× PBS。

收集剩余的细胞并转移至50毫升离心管中。对每个培养皿重复此操作。不同培养皿的细胞悬液可合并，以减少样品数量和塑料废弃物。

接下来，在 4 °C 条件下以 1,000 × g 离心样品 5 分钟。离心后，小心倒掉上清液。将每个沉淀重悬于 10 mL 冰冷的 1× PBS 中。

将重悬的沉淀物每至多五个合并至一个50毫升离心管中。用10毫升PBS清洗空管。将溶液加入合并后的样品中，并按之前步骤进行离心。

吸出上清液后，将沉淀物重悬于10毫升冰预冷的1×PBS中。取下20毫升注射器的活塞并暂置一旁。封闭注射器的喷嘴，将注射器放入50毫升离心管中，然后转移细胞悬液至该管内。

在 1000 × g、4 °C 条件下离心 5 分钟。使用连接真空 trap 系统的细尖移液器吸去上清液，直至细胞顶层开始被吸入。由此获得湿的细胞沉淀。

打开注射器帽，插入推杆，将细胞直接滴入盛有液氮的大塑料烧杯中，该烧杯置于泡沫箱内的液氮浴中。用力将注射器中剩余的细胞全部推入。随后，将冷冻后的细胞倒入50毫升离心管中。

松开管盖，使多余的液氮挥发。在 -80 °C 下静置过夜。次日将管盖完全拧紧。

冷冻的细胞可在负80摄氏度条件下以此方式保存，直至进行低温研磨。将细胞珠从负80摄氏度冰箱中取出，并置于盛有液氮的50毫升试管架中。将一个50毫升研磨罐、两个20毫米研磨球以及罐盖放入装有液氮的洁净矩形冰桶中进行预冷。

同时，预冷一个聚四氟乙烯（PTFE）绝缘体。可使用一组垫片或套筒-垫片组合。在研磨机上设置适当的平衡重。

用镊子将两个预冷的 20 毫米研磨球和冷冻的细胞放入预冷的研磨罐中。向罐中加入液氮至半满，盖上罐盖，并将整个组件转移至研磨仪中。将组件固定牢固，运行三次研磨循环，程序设置为 400 rpm，持续 3 分钟，每分钟反转旋转方向，中间不暂停。

研磨过程中必须能听到球体的碰撞声，这表明球体正在碰撞并粉碎材料。若听不到此声音，则说明研磨未正常进行。完成三次研磨循环后，将研磨罐移回液氮中，短暂静置以重新冷却。

小心打开盖子。用镊子取出研磨球，并使用预冷的刮勺将粉末转移至预冷的50毫升离心管中。注意：向研磨罐中加入液氮有助于松动粘附在研磨球上的结块粉末。

进行细胞提取物制备时，将100毫克细胞粉末称量至预冷的1.5或2毫升微量离心管中。用空的微量离心管对分析天平去皮归零。使用液氮冷却的药匙或刮勺将细胞粉末转移至管中。

将试管放回液氮之前，先在分析天平上检查试管内分装粉末的质量。打开装有细胞粉末的试管，室温下静置一分钟，以释放管内压力，防止加入提取缓冲液时立即冻结。向试管中加入400 µL提取剂，并补充蛋白酶抑制剂。

短暂涡旋混匀离心管，然后置于冰上。使用微尖超声波破碎仪对样品进行短暂的低能量脉冲处理，以分散任何聚集体。通过离心澄清提取物。

最后，移除上清液并进行亲和捕获。为预洗涤亲和介质，将含有抗体偶联的超顺磁性微珠的管子置于磁铁上。数秒内微珠将聚集于管壁一侧，从而可去除储存液。

然后，向珠子中加入 500 µL 裂解缓冲液。中速短暂涡旋振荡以混匀。将离心管放入小型离心机中瞬时离心，使管内所有液体沉降至管底。

然后将离心管置于磁力架上，吸除上清液。将澄清的细胞提取物转移至含有预洗涤亲和介质的离心管中，短暂涡旋振荡以启动亲和捕获。在4°C条件下，将离心管于旋转摇床中持续轻柔混匀孵育30分钟。

孵育过程中，磁珠应始终保持悬浮状态。吸除上清液，并用一毫升冷裂解缓冲液将磁珠洗涤三次。为洗脱蛋白质，加入不含还原剂的SDS-PAGE上样缓冲液，以减少抗体链从磁珠上脱落。

在室温下振荡孵育5至10分钟。收集并保存上清液，然后对样品进行SDS-PAGE电泳，再采用标准技术进行蛋白质染色。可切取单个蛋白质条带用于鉴定，或通过短时间电泳整个样品，从而在一次分析中对全部样品进行表征。

用于亲和捕获的不溶性介质的材料可能影响回收的蛋白质组。图中所示为磁珠、掺铁琼脂糖和传统琼脂糖。每种介质均偶联了抗FLAG M2抗体，并用于捕获添加到经冷冻研磨的HEK 293细胞提取物中的FLAG标签细菌碱性磷酸酶。

微米级磁珠显示出最清晰的谱型，表明非特异性蛋白质吸附水平相对较低。细胞裂解方法也会影响回收的蛋白质组。在此，内源性蛋白质复合物从冷冻研磨或超声处理的细胞提取物中进行了亲和捕获。

当细胞提取物由冷冻研磨的细胞粉末制备时，观察到的高分子质量污染物更少。尽管磁性介质的背景信号可能低于其他介质，但抗体本身可能会促进假阳性污染的吸附，尤其是在其靶抗原不存在的情况下。为了确定抗FLAG磁性介质在抗体互补位结合或未结合时所产生的背景结合水平，使用HEK 293T细胞提取物进行了模拟亲和捕获实验，并在有或无3x FLAG肽添加的情况下进行。

在缺乏相应表位的情况下，alpha FLAG 培养基会捕获一定可检测水平的背景蛋白，这些背景蛋白可通过 3x FLAG 多肽进行竞争性洗脱，并可被 SDS-PAGE 上样缓冲液更彻底地洗脱。在 37 至 50 千道尔顿范围内观察到一种主要的污染蛋白条带。当存在竞争性表位时，无论是采用 3x FLAG 还是基于 SDS 的洗脱方法，背景蛋白的结合均显著减少，两者效果相当。

在进行该实验操作时，务必做到仔细、迅速且精确。记录实验过程及观察到的任何变异情况，以明确哪些步骤对实验结果最为关键。完成本操作后，可进一步采用其他方法，如质谱分析、速率区带离心和电子显微镜技术，以分析混合物的组成、均一性程度以及其中组成大分子复合物的大小和形态。

在该技术发展之后，亲和捕获为蛋白质组学领域的研究人员探索生理条件下蛋白质复合物的组成提供了前所未有的详细途径，这至今仍是全球范围内持续进行的研究重点。观看本视频后，您应能够充分理解如何准备哺乳动物细胞用于低温研磨，以及如何对目标蛋白质进行亲和捕获。