核酸的传递通过显微注射胚胎在世界范围内的农业害虫，地中海实蝇

该程序的总体目标是将核酸输送到重要的农业害虫 Ceratitis Capitata 的胚胎中，以最终扩展其控制的工具箱。该方法有助于在功能上校正固定生物体中的基因，并产生转基因菌株。该技术的主要优点是注射了非常少量的核酸即可达到所需的效果。

将蝇群的所有生命阶段保持在 25 摄氏度，湿度为 65%，12 小时的光/暗光周期，光相从上午 8 点开始。将海绵条插入笼子底部的一个小开口，通过毛细管作用为苍蝇提供水。你建立一个 6 升的笼子，装载一个 1， 500 到 2， 000 只蛹。

对于食物，在笼子里装入约 45 克 1 到 10 的酵母和糖混合物。要收集鸡蛋，请在笼子下方放置一个装满水的盘子。雌性会通过网眼产卵，然后卵会聚集在水中。

因为处女雌性可以卵子假设，所以要等到苍蝇至少一周大，然后再收集卵子，确保卵子都受精。要收集鸡蛋，请用细过滤器过滤水。然后使用巴氏移液器，将鸡蛋转移到装有约 0.5 升标准幼虫食物的塑料盒中。

如果产卵不足，则将成人食物的酵母含量提高至 25%将每个盒子放入透明容器中，其中含有一层麸皮以利于化蛹。用网盖盖住容器，让空气流通。大约 10 天后，检查跳入麸皮层进行化蛹的第三龄幼虫。

找到后，准备在接下来的几天检查蛹。要收集蛹，请使用软刷将它们从容器中扫起。最初，将蛹收集在一个小杯子里。

收集完成后，将蛹转移到新的成虫笼中。成虫应该在大约 10 天内出现。对于显微注射，请提前准备好载玻片。

将一条 2 厘米长的双面胶带贴在载玻片上，并用瓷笔标记边缘，为保持胚胎水分的油层做一堵墙。要收集新鲜产下的胚胎，让年轻的受精雌性在新托盘上产卵 30 分钟，然后收集胚胎。要从胚胎中取出绒毛膜，请将过滤器和鸡蛋浸入市售的 50% 漂白剂溶液中 5 秒钟。

不要过度漂白胚胎至关重要。立即将过滤器小心地浸入干净的超纯水中清洗漂白的胚胎。至少执行此作四次。

然后，将过滤器保存在透明的超纯水中，并在两小时内注射胚胎。接下来，使用细画笔收集大约 50 个胚胎并将它们放在浸有水的黑色滤纸盘上。在解剖立体显微镜下，将胚胎排在准备好的显微镜载玻片的双面胶带上。

将所有胚胎朝向同一方向。小心作胚胎很重要，因为用油漆刷刺穿胚胎膜可能会造成损害，从而降低胚胎的存活率。现在用一层氯三氟乙烯油覆盖胚胎。

油应包含在瓷器标记边界内。不要溢出边界。使用微量移液器，以每微升 1 至 2 微克的剂量向注射针头中加入几微升核酸溶液。

然后，将针头连接到显微注射装置，并将其设置为以 800 百帕和背压 150 百帕提供半秒注射。注射时，使用脚踏板触发器并使用微型纵器控制针头，同时使用载物台控件移动载玻片。确认注射团注已正确弹出，然后将针头与行中第一个胚胎的后极对齐。

通过移动载物台，将针头插入胚胎并注射核酸推注。注射的液体会引起内部压力的增加，导致胚胎轻微移动。松开踏板，立即但轻轻地从胚胎中取出针头。

注射部位会有一点细胞质渗漏。这是正常的。如果胚胎因注射而爆裂，则让胚胎干燥几分钟，然后再用油覆盖它们。

注射后，将载玻片转移到培养皿中。将一盘滤纸放入培养皿的盖子中。用水浸泡过滤器，并用石蜡膜封闭培养皿。

在 25 摄氏度下孵育腔室。注射后两天，全天多次检查载玻片是否有孵化的幼虫。在油中寻找幼虫，并使用细画笔将它们转移到装有胡萝卜幼虫食物的培养皿中。

每个培养皿最多可装载 200 只幼虫。幼虫不能在油中存活很长时间，因此请经常搜索。在盖子大部分关闭的情况下孵育幼虫，这样仍然有气流流向幼虫。

每天检查培养皿，一周后准备将培养皿放入装有麸皮的容器中收集幼虫。收集蛹，不久之后期待它们出现。后来用二氧化碳麻醉孵化的成虫，并检查它们是否有转化。

当筛选出来时，那种动员方法可能很关键。Medfly 成虫可以使用冰或 CO2 进行麻醉，但长时间接触可能会降低其他物种的存活率。使用 DS red wide 滤光片检查是否存在红色荧光。

或使用 EYFP 滤光片检查绿色荧光。将转化的个体转移到一个带有异性野生型成虫的小笼子中，以建立杂合菌株。在一项实验中，使用双菌株 RNA 沉默 inx5 基因表达。

未注射对照的成年种系似乎如预期的那样正常，而接受治疗的个体则表现出睾丸和卵巢发育不全。对两性个体腹部 inx5 转录本丰度的定量证实，与对照相比，该基因的表达显着降低。在第二个实验中，使用 β-2 微管蛋白启动子生成两个带有标记精子的菌株，以驱动不同的荧光标记物。

转基因雄性在体内和睾丸中表现出明显的荧光模式。通过该视频，我们提供了用于将核酸饲养和显微注射到麦果胚胎中的优化方案。一旦掌握，在 8 小时的工作日内最多可以注射 1， 000 个胚胎。

按照此程序，可以执行其他金属，如 thy-lino-crisp-er、cas-min-eta-geno-meta-tine 来开发新一代的麦蝇菌株。