在糖尿病伤口愈合模型中构建与移植脂肪源性干细胞（ASC）片层

本实验的总体目标是验证脂肪来源干细胞片联合人工皮肤对糖尿病大鼠大面积全层皮肤缺损创面愈合的影响。该方法有助于解答关于慢性创面愈合的关键问题，例如伴有骨外露的糖尿病大型创面的修复。该技术的主要优势在于利用细胞片技术将细胞以固态片状形式移植至创面，从而实现活性高、稳定性好的移植效果。

对于脂肪垫供体，应选用8至33周龄的Lewis大鼠。在手术部位准备好若干无菌棉签、纱布、手术刀、持针器、手术剪、镊子以及5-0尼龙缝线。用于临时放置组织时，将100毫升培养皿中加入10毫升PBS。

称量装有磷酸盐缓冲液的培养皿，以确定所收获组织的质量。将大鼠麻醉后，将其仰卧位放置在无菌手术单上。然后，剃除手术区域的毛发，并使用70%乙醇进行多次交替擦拭，清洁暴露的皮肤。

现在，在侧下腹部做一切口，长度为三厘米。接着，暴露并分离腹外斜肌。然后，暴露围绕附睾的附睾脂肪组织。

接下来，仔细分离附睾脂肪组织。注意避免损伤附睾、睾丸及附睾血管。将组织转移至盛有PBS的培养皿中。

然后，缝合供体大鼠，并按照标准的术后护理程序进行处理。从收获的2至3克脂肪组织中分离ASCs。使用0.1% A型胶原酶消化组织1小时，以获得基质血管组分（SVF）。

SVF纯化后，将其悬浮于20毫升培养基中。将细胞悬液分至两个60平方厘米的培养皿中，在标准条件下培养24小时。次日，用PBS洗涤培养皿三次，以去除未贴壁的细胞和碎片。

最后一次洗涤后，重新加入新鲜的完全培养基。随后继续传代培养细胞，直至培养第三天细胞接近亚汇合状态。然后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶EDTA进行短暂孵育。

从培养板中取出细胞。注意细胞暴露于活性胰蛋白酶的时间不要超过10分钟。观察并计数细胞后，以每平方厘米1,700个细胞的密度进行传代培养。

随后每隔三天传代一次细胞，并完成三次传代后再继续实验。第三次传代复苏的大鼠ASCs后，将150,000个细胞接种至直径为35毫米的温度响应性培养皿中，并加入2毫升培养基。将培养皿置于培养箱中培养三天，以形成均一的细胞片层。

三天后更换培养基，并添加每毫升16.4微克的AA。随后继续培养细胞，每隔一天更换一次含AA的培养基。在含AA的培养基中培养四到五天后，观察ASCs的增殖情况。注意观察细胞之间以及连续细胞层中是否存在间隙。

当形成连续的细胞层后，即可将这些细胞用于模型实验。需要时，将培养板置于室温下15至20分钟，收集细胞层。由于培养板具有温度敏感性，细胞会自发地以连续片状脱离，可用镊子将细胞片完整取出。

对于肥胖伤口愈合模型，使用16至18周龄、体重在500至600克之间的成年雄性ZDF大鼠。将大鼠置于手术区域并进行麻醉，在剃除头部毛发前，先用70%乙醇清洁头部。随后剃除手术区域的毛发，并用70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤进行清洁。

在此期间，将装有温度敏感性脂肪干细胞的培养皿转移至实验台。在细胞片脱离培养皿之前，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞片三次。收集细胞片后，将其浸泡于 PBS 中，待使用时取出。

细胞准备好后，在大鼠头部制作一个15毫米×10毫米的全层皮肤缺损。首先，去除皮肤组织直至骨膜层。然后，使用手术刀和手术剪切除皮肤及皮下组织。

为了完成缺损修复，使用骨膜刮匙去除骨膜。然后将细胞片覆盖于缺损处。干细胞片具有柔软且灵活的特性。

使用镊子将其延伸至缺损的每个角落。现在，用一块使用前已浸透生理盐水的 10 × 15 毫米人工皮肤覆盖细胞片和缺损区域，并用 5-0 尼龙缝线进行约 10 针缝合以关闭伤口。为保护伤口，使用 5-0 尼龙缝线将一块 15 × 20 毫米的非粘性敷料固定在人工皮肤上方。

计划每隔一天观察一次敷料，因为大鼠 invariably 会将其移除，必要时应及时更换敷料。在两组各六只 Zucker 糖尿病肥胖大鼠中，采用所述方案制备颅骨缺损。实验组大鼠接受大鼠脂肪干细胞片治疗，对照组则不予治疗。

14天后，治疗组的伤口明显小于对照组。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在大鼠身上制造暴露骨组织的大面积伤口，并使用脂肪来源的干细胞对这类伤口进行治疗。在实施该操作过程中，务必在整个使用温度响应性培养皿的过程中严格控制温度管理。

否则，细胞可能会自发从培养皿上脱落，从而延误实验进程。