Name: 创作和移植的糖尿病伤口愈合模型中脂肪源性干细胞 (ASC) 表 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习利用脂肪源性干细胞片结合人工皮肤治疗糖尿病大鼠慢性伤口的方法。该技术通过细胞片工程实现稳定移植，为全层皮肤缺损伴骨暴露的难愈性创面提供有效治疗策略。

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作者感谢日本顺天堂大学医学院整形外科的 Yukiko Koga 博士提供的实用建议。同时感谢日本东京女子医科大学医学院糖尿病中心的 Hidekazu Murata 先生提供的出色技术支持。本研究由日本文部科学省（MEXT）“创新系统开发项目”中的“跨学科前沿先进研究领域创新中心建设计划”——“细胞片组织工程中心（CSTEC）”资助。

以下所示的所有实验方案均经东京女子医科大学医学院动物福利委员会批准，并严格遵守《动物实验正当实施指南》的全部要求。
1. 动物、仪器、培养基和培养皿的准备
<ol>
	<li>使用含20%胎牛血清（FBS）和1%青霉素/链霉素的α最小必需培养基配制完全培养基。4 °C下保存数月，待用。</li>
	<li>采用成年雄性ZDF大鼠作为2型糖尿病肥胖模型。取雄性Lewis大鼠的脂肪垫分离脂肪组织，用于制备细胞片层。</li>
</ol>
2. rASCs 的分离与培养
<ol>
	<li>在异氟烷全身麻醉下，从Lewis大鼠（雄性，8 - 33周龄）获取脂肪组织。
	<ol>
		<li>准备啮齿类动物机械呼吸机和4%异氟烷。准备若干无菌棉签、清洁纱布、手术刀、持针器、手术剪、一把镊子和5-0尼龙缝线。对手术器械和用品进行灭菌处理。</li>
		<li>准备一个含有10 mL无菌磷酸盐缓冲液（PBS）的100 mm培养皿，用于临时保存获取的脂肪组织。手术开始前，使用天平称量含PBS的培养皿重量，以测定所采集脂肪组织的重量。将外科手术器械和用品摆放于无菌铺巾上。</li>
		<li>使用3%–4%的异氟烷麻醉大鼠 通过 使用啮齿类动物呼吸机，并在手术期间将大鼠维持于2-3%异氟烷。通过观察每只大鼠呼吸的深度和频率来监测麻醉深度。</li>
		<li>佩戴无菌手套后，将大鼠仰卧位放置于无菌手术巾上。使用电动剃刀剃除手术区域毛发，并用浸有70%乙醇的无菌纱布清洁大鼠腹部区域。</li>
		<li>用手术刀在大鼠下腹部外侧做一条长约5 cm的皮肤切口。暴露并分离腹外斜肌，随后暴露包绕附睾的附睾脂肪组织。轻柔地将附睾脂肪组织拉出。 
		注意：脂肪组织可取自大鼠腹部的任意一侧。</li>
		<li>仅切除附睾脂肪组织，避免损伤附睾、睾丸及附睾血管（图 S1将切除的脂肪组织浸泡在培养皿的PBS中以防止干燥，并称量组织重量。</li>
		<li>用5-0薇乔线缝合腹肌，用5-0尼龙线缝合皮肤。然后将每只手术后的大鼠单独放回一个笼子（每笼一只大鼠）。 
		注意：持续观察大鼠，直至其完全恢复。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从2-3 g脂肪组织（取自Lewis大鼠，并根据已报道的方法处理）中分离rASCs27简而言之，将切除的脂肪组织用0.1% A型胶原酶在37 °C下酶解1小时，以获得基质-血管组分（SVF；图S2）。
	<ol>
		<li>在生物安全操作台上准备数个100 µm细胞滤筛、数个50 mL离心管、数个15 mL离心管以及两把手术刀。开启离心机，并将水浴锅预热至37 °C。此外，取约50 mL无菌PBS加入50 mL离心管中，加入A型胶原酶至终浓度0.1%。</li>
		<li>使用两把手术刀将脂肪组织切成小块。</li>
		<li>将所有切碎的脂肪组织转移至一个50 mL离心管中，并加入PBS至总体积为15 mL。</li>
		<li>将50 mL离心管直立静置5分钟。弃去上层，收集下层液体（除沉淀物外）。</li>
		<li>向含有上层的 PBS 的 50 mL 管中加入 0.1% 的 A 型胶原酶溶液，以酶解消化脂肪组织。 
		注意：将约 20 mL PBS 按每 2 - 3 g 脂肪组织的量置于 37 °C 水浴中预热。</li>
		<li>在37 °C水浴中，以120 - 130 rpm的速度轻轻倾斜并摇动50 mL离心管1小时。</li>
		<li>振荡后将50 mL离心管直立静置5分钟。</li>
		<li>使用100 µm细胞滤网过滤溶液，并将滤液转移至新的50 mL离心管中。将过滤后的溶液分装至两个15 mL离心管中。</li>
		<li>将15 mL离心管中的溶液以700 x g离心5分钟 g小心移除上层上清液，保留5 mL下层溶液。切勿吸走沉淀物。</li>
		<li>向每个15 mL离心管中加入约5 mL完全培养基，最多可加至10 mL，并小心地重悬沉淀。</li>
		<li>重复步骤 2.2.8 - 2.2.9，然后获取 SVF。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>准备两根60 cm的2 培养皿。在700 × g离心5分钟两次后收集SVF。重悬SVF，并将10 mL SVF溶液接种至每个60 cm²培养皿中2 培养皿</li>
	<li>在37 °C、5% CO₂条件下培养培养皿24小时2 培养箱</li>
	<li>配制磷酸盐缓冲液（PBS）和0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA），4 °C可保存数月，备用。</li>
	<li>初次接种后（24 h），用 PBS 洗涤细胞 3 次，以去除未贴壁的细胞和碎片。加入新鲜的完全培养基。</li>
	<li>在第3天，对即将达到亚融合状态的细胞进行传代。加入1 mL 0.25%胰蛋白酶-EDTA，于37 °C、5% CO₂条件下孵育细胞2 孵育 3 - 5 分钟。 
	注意：胰蛋白酶消化步骤需在10分钟内完成，以防止细胞损伤。</li>
	<li>胰蛋白酶消化后，在光学显微镜下观察细胞，以确认所有细胞已完全从培养皿上脱落。随后，向培养皿中加入9 mL完全培养基。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞数量进行计数。</li>
	<li>以 1.7 x 10 的密度传代培养细胞3 细胞/厘米²2 每3天传代一次，直至第3代。将传代后的细胞在37 °C、5% CO₂的湿润环境中培养2 培养箱</li>
</ol>
3. rASC 片层的制备
<ol>
	<li>准备多个直径为35 mm的温度响应性培养皿。在5% CO2培养箱中，于37 °C条件下用胎牛血清（FBS）或含FBS的完全培养基预包被培养皿，时间超过1小时。 
	注：直径为35 mm的温度响应性培养皿为市售产品。</li>
	<li>准备一个37 °C的加热板，并将后续实验操作均在该加热板上进行。 
	注：所有使用温度响应性培养皿的操作均需在37 °C加热板上进行，以防止细胞自发从培养皿上脱落。
	<ol>
		<li>在实验前将操作中使用的完全培养基预热至37 °C。</li>
		<li>将来自Lewis大鼠的第3代rASCs以1.5 × 105 个细胞/皿的密度接种至直径为35 mm的温度响应性培养皿中，总体积为2 mL完全培养基，培养3天。 
		注：当接种rASCs至新的培养皿时，应在培养箱内缓慢前后左右摇动培养皿，以实现rASC的均匀接种和形成厚度均一的细胞片层。</li>
		<li>接种后第3天，将培养皿置于37 °C加热板上，更换培养基：弃去2 mL原培养基，加入含16.4 µg/mL L-抗坏血酸磷酸镁盐n-水合物（AA）的新鲜完全培养基2 mL。 
		注：溶解后的AA可在-30 °C下保存数月。</li>
		<li>继续培养4–5天，每隔2天更换一次含AA的新鲜培养基。</li>
		<li>在光学显微镜下观察ASCs的增殖情况及细胞片层的形成，判断连续的细胞片层中是否存在细胞间隙。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将细胞片层从培养箱转移至实验台面，静置15–20分钟，使其冷却至室温；此时可观察到细胞以完整片层形式自发脱落。用镊子从培养皿表面收获rASC细胞片层。 
	注：通常情况下，rASC片层可用镊子直接操作。若细胞片层较脆且易碎，必要时可使用转移膜将细胞片层从培养皿转移至伤口部位。</li>
</ol>
4. 全层皮肤缺损伤口模型的制备及rASC片的移植
<ol>
	<li>准备啮齿类动物呼吸机和4%异氟烷。准备若干无菌棉签、清洁纱布、5-0尼龙缝线、手术刀、骨膜剥离器、持针器、手术剪和一把镊子。对手术器械和用品进行灭菌处理，并将其摆放于无菌手术单上。</li>
	<li>准备磷酸盐缓冲液（PBS），并将其与人工皮肤及非粘附性敷料一同置于室温下。预先将人工皮肤裁剪为15 × 10 mm，非粘附性敷料裁剪为20 × 15 mm。使用前，将人工皮肤的内层胶原海绵部分用生理盐水浸润。 
	注意：人工皮肤由两层构成：外层为硅胶膜，内层为胶原海绵。</li>
	<li>选用ZDF大鼠（16–18周龄，雄性，体重500–600 g）作为2型糖尿病和肥胖症的伤口愈合模型。</li>
	<li>通过啮齿类动物呼吸机吸入4%异氟烷对ZDF大鼠进行麻醉。诱导麻醉时使用4–5%异氟烷，术中维持麻醉浓度为3–4%。通过夹捏足趾观察每只大鼠的呼吸深度和频率，以监测麻醉深度。</li>
	<li>佩戴无菌手套后，将大鼠俯卧位放置于无菌手术单上。使用浸有70%乙醇的无菌纱布清洁大鼠头部，用电剃刀剃除手术区域毛发，再用浸有70%乙醇的无菌纱布清洁剃毛后的皮肤。</li>
	<li>在麻醉后的ZDF大鼠头部制造一个方形全层皮肤缺损（15 × 10 mm2），去除从表皮至骨膜的全部皮肤组织。使用手术刀切除皮肤及皮下组织，并用骨膜剥离器去除骨膜。</li>
	<li>在细胞移植前，立即将35 mm温敏性培养皿中的rASCs从培养箱转移至室温环境。</li>
	<li>观察35 mm温敏性培养皿上的rASCs在形成创面后自发从培养皿表面以片状脱落。在温敏性培养皿上培养7天后收获rASC片。吸除培养液，用PBS洗涤rASC片三次。将rASC片浸泡于PBS中直至移植，以防止干燥。</li>
	<li>使用镊子立即将rASC片覆盖于颅骨缺损区域。若细胞片较脆且易碎，可使用膜作为支架，辅助将细胞片从培养皿转移至创面部位。</li>
	<li>用人工皮肤（15 × 10 mm2）覆盖rASC片及创面，并使用5-0尼龙缝线进行约10针缝合以闭合创口。为保护创面，再在人工皮肤上方覆盖非粘附性敷料（20 × 15 mm2），并用5-0尼龙缝线固定，以维持湿润的创面环境并吸收渗出液。 
	注意：ZDF大鼠通常在敷料应用后数天内会自行将其移除。因此，移植后需定期监测大鼠状态。通常需在全身麻醉下每2天更换一次非粘附性敷料。</li>
	<li>每只术后大鼠单独饲养于独立笼具中，直至完全恢复（每笼一只）。观察期结束后，采用经批准的过量异氟烷方法处死大鼠。</li>
</ol>

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以下作者披露了与本出版物相关的财务关系：Teruo Okano 是 Cell Seed 公司的创始人及董事会成员，该公司从东京女子医科大学获得技术与专利授权；Teruo Okano 和 Masayuki Yamato 均为 Cell Seed 公司的股东。东京女子医科大学从 Cell Seed 公司获得研究经费。其他作者声明，他们与本出版物无相关的财务关系。

成功培养rASC片的关键步骤如下：1）在温度响应型培养皿上进行培养时，必须将温度维持在约37 °C。在制备rASC片的过程中，所有操作均在37 °C的加热板上进行，所有试剂均预热至37 °C，以防止细胞从培养皿上自发脱落31。2）必须密切监测受体ZDF大鼠，防止其移除非粘附性敷料，这对于rASC片的成功移植至关重要。若敷料被移除，必须立即更换新的非粘附性敷料，以防止移植的ASC片从伤口部位脱落。
采用该方法，通常在将第3代细胞接种于温度响应性培养皿后5至7天内获得rASC细胞片。生成rASC细胞片所需的培养时间可根据初始细胞密度以及添加含AA的完全培养基的时间进行调整。若rASC细胞片在细胞培养过程中从培养皿脱落，应重新制备rASC细胞片，并额外准备培养皿以应对细胞脱落的情况。
本方案的局限性如下：1）使用温度响应性培养皿时，必须严格控制温度，确保整个过程中温度维持在约37 °C。2）获取rASC细胞片后，必须使用特殊医疗器械以维持湿润环境，因为rASC细胞片对干燥条件敏感。3）...

全球糖尿病患者人数正在不断增加，2015年已达到4亿人1；据估计，15%至25%的糖尿病患者存在下肢糖尿病溃疡恶化的风险2。下肢糖尿病溃疡难以治愈，即使完全康复后也可能需要长期的治疗和康复训练。漫长的治疗周期常常显著降低患者的生活质量。因此，必须开发能够减轻或防止病情恶化的新型疗法，以治疗糖尿病创面。为了评估糖尿病创面的愈合效果，我们优化了一种在大鼠中建立的糖尿病溃疡创面愈合模型，该模型可模拟实际临床条件，并评估了利用细胞片工程技术移植脂肪来源干细胞（ASC）片是否能够加速创面愈合。
间充质基质细胞（MSCs）因其具有自我更新能力、免疫调节作用以及向多种细胞谱系分化的潜能，在促进伤口愈合方面展现出巨大潜力3。脂肪来源的基质细胞（ASCs）是一类来源于脂肪组织的MSCs，相较于其他组织来源的MSCs，其具有多种优势，包括更强的促血管生成潜能和旁分泌活性4,5。脂肪组织在人体内相对丰富，且易于获取，可通过微创手段进行采集。因此，ASCs已被用于伤口愈合的实验性研究6,7。
既往研究显示，将单细胞MSC悬液直接注射到伤口周围区域可加速伤口愈合8,9。然而，尽管在糖尿病溃疡模型中注射单细胞悬液可促进伤口愈合，但移植细胞在伤口部位的存活时间尚不明确。
在本研究中，我们应用了使用温度响应性培养皿的细胞片工程技术。这些培养皿的表面共价结合有温度响应性聚合物N-异丙基丙烯酰胺10。接枝的聚合物层可实现细胞在培养皿表面黏附或脱离的温度调控。当温度为37 °C时，培养皿表面呈疏水性，细胞能够黏附并增殖；而当温度降至32 °C以下时，表面变为亲水性，细胞则会自发从表面脱离。通过简单降温，即可将培养的细胞以完整细胞间连接和细胞外基质（ECMs）保持完整的连续细胞片形式收获；因此，无需使用胰蛋白酶等会破坏细胞外基质的蛋白水解酶11。因此，细胞片工程技术能够保留细胞间的连接结构，并提高细胞移植的效果。
此外，与细胞注射相比，细胞片移植可提高细胞存活率12。在本实验方案中，选择Zucker糖尿病肥胖（ZDF）大鼠作为具有伤口愈合延迟特征的2型糖尿病和肥胖模型。ZDF大鼠约在4周龄时自发出现肥胖，随后在8至12周龄之间在肥胖基础上发展为2型糖尿病，表现为与胰岛素抵抗相关的高血糖、血脂异常和高甘油三酯血症13。此外，还可观察到伤口愈合延迟、外周血管血流减少以及糖尿病肾病14,15,16。因此，ZDF大鼠可能是研究难治性皮肤溃疡（如糖尿病性溃疡）愈合过程的合适模型。
人类与啮齿类动物在伤口愈合机制上的差异与皮肤解剖结构的差异相关。正常大鼠的伤口愈合主要依赖伤口收缩，而人类的伤口愈合则基于再上皮化和肉芽组织形成。通常，在啮齿类动物模型中使用的伤口固定技术有助于最小化伤口收缩，并促进肉芽组织的逐步形成17，尽管非糖尿病大鼠的伤口几乎完全通过收缩实现闭合。然而，ZDF大鼠的糖尿病性伤口收缩功能受损，其伤口愈合主要通过再上皮化和肉芽组织形成进行；因此，这一过程更类似于人类的伤口愈合14。
临床上常遇到清创后暴露骨组织的糖尿病创面。既往研究曾采用在无胸腺裸鼠背部制备直径12 mm的全层皮肤缺损模型18,19，或在正常小鼠背部制备直径10 mm的全层皮肤缺损模型20。为了建立一种严重的糖尿病创面的临床前模型，本研究在2型糖尿病合并肥胖的大鼠背部，按照先前描述的方法21，制备了更大尺寸（15 × 10 mm2）的全层皮肤缺损，该缺损暴露骨组织且去除骨膜。
通过同种异体移植正常Lewis大鼠的脂肪来源干细胞（ASC）制备大鼠ASC（rASC）片层。在临床实践中，自体移植不可行，因为患有溃疡的糖尿病患者常伴有严重的糖尿病并发症，如难以控制的高血糖水平和高体重指数，这些并发症会导致伤口愈合障碍，从而增加从这些患者体内获取脂肪组织的难度。此外，来自糖尿病动物的ASC表现出特性改变和功能受损22。因此，本文所述方案介绍来自正常大鼠的rASC片层在糖尿病大鼠中的同种异体移植及其与人工皮肤的联合应用。
本方案中使用的双层人工皮肤可防止伤口自发收缩，促进新的结缔组织基质的合成，并且结构类似于真正的真皮23。在本方案中，将人工皮肤置于rASC细胞片上，并用尼龙线固定，以防止因大鼠皮肤松弛导致的伤口收缩或扩大。此外，人工皮肤为ASC细胞片提供了三维支架，维持移植的ASC细胞片及伤口处的湿润环境，并保护伤口免受感染和外界机械力的影响。最后，在伤口上方覆盖一层非粘连性敷料，以保护伤口免受外部冲击，维持湿润的伤口环境，并吸收渗出液。
rASC 片层具有薄、柔韧且可变形的特性，可黏附于跳动的心脏等运动中的受体部位24。细胞片层工程技术已被用于多种组织的重建，并可产生治疗效果25,26。 具有临床治疗潜力的 ASC 片层可能加速多种类型伤口的愈合。此外，同种异体移植 ASC 片层联合人工皮肤的使用，可能适用于治疗难治性溃疡或烧伤，例如外周动脉疾病或胶原血管病患者中所见的溃疡，也可用于营养不良或正在使用类固醇的患者。该策略可提高 ASC 移植的效率。ZDF 大鼠伤口愈合模型可产生严重的伤口状况，其伤口愈合过程类似于人类，并能在小型实验动物中模拟临床病理条件。

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;-MEM 谷氨酰胺</td><td>Invitrogen</td><td>32571-036</td><td>加利福尼亚州卡尔斯巴德</td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>Japan Bioserum Co Ltd.</td><td>S1650-500</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>胶原酶A</td><td>Roche Diagnostics</td><td>10 103 578 001</td><td>德国曼海姆</td></tr><tr><td>60 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; Primaria 细胞培养皿</td><td>BD Biosciences</td><td>353803</td><td>新泽西州富兰克林湖</td></tr><tr><td>杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）</td><td>Life Technologies</td><td>1490-144</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）</td><td>Life Technologies</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>L-抗坏血酸磷酸镁盐 n-水合物</td><td>Wako</td><td>013-19641</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 温度响应性细胞培养皿（Upcell&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;）</td><td>CellSeed</td><td>NUNC-174904</td><td>日本东京</td></tr><tr><td>微型加热板（MP-1000）</td><td>Kitazato Science Co., Ltd.</td><td>1111</td><td></td></tr><tr><td>啮齿类动物机械呼吸机</td><td>Stoelting</td><td>#50206</td><td>伊利诺伊州伍德代尔</td></tr><tr><td>4% 异氟烷</td><td>Pfizer Japan</td><td>114-13340-3</td><td>日本东京</td></tr><tr><td>人工皮肤（Pelnac&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;）</td><td>Smith &amp; Nephew</td><td>PN-R40060</td><td>&amp;nbsp;日本东京</td></tr><tr><td>非粘连性敷料（Hydrosite plus&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;）</td><td>Smith &amp; Nephew</td><td>66800679</td><td>在美国称为 Allevyn non-adhessing&lt;sup&gt;&amp;reg;&lt;/sup&gt;</td></tr><tr><td>5-0 尼龙缝线</td><td>Alfresa</td><td>EP1105NB45-KF2</td><td></td></tr><tr><td>20 CELLSTAR 管</td><td>greiner bio-one</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 离心管</td><td>Corning Incorporated</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>14 GOLDMAN-FOX 骨膜剥离器</td><td>Hu-Friedy</td><td>P14</td><td>伊利诺伊州芝加哥</td></tr></tbody></table>

在糖尿病伤口愈合模型中构建与移植脂肪源性干细胞（asc）片层

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

人工皮肤在临床实践中已取得显著的治疗效果。然而，对于血液循环障碍或创面较大的糖尿病患者，人工皮肤治疗可能需要较长时间。基于细胞的疗法已成为治疗糖尿病溃疡的一种新技术，而细胞片工程技术则提高了细胞移植的疗效。已有大量研究报告指出，脂肪来源的干细胞（ASCs）作为一种间充质基质细胞（MSC），因其在脂肪组织中相对丰富且易于获取，与其他组织来源的MSC相比具有更高的可及性，因而展现出良好的治疗潜力。因此，ASCs似乎是用于治疗的理想干细胞来源。本研究中，利用温度响应性培养皿及含抗坏血酸的常规培养基，成功制备了来自正常Lewis大鼠附睾脂肪组织的ASC细胞片。随后将ASC细胞片移植至Zucker糖尿病肥胖（ZDF）大鼠的创面，ZDF大鼠是2型糖尿病和肥胖的动物模型，其伤口愈合能力受损。在大鼠颅后背侧制造创面后，将ASC细胞片移植至创面，并以双层人工皮肤覆盖细胞片。接受ASC细胞片移植的ZDF大鼠其伤口愈合情况优于未接受细胞片移植的ZDF大鼠。该方法存在一定局限性，即ASC细胞片对干燥环境敏感，需维持湿润的创面环境。因此，使用人工皮肤覆盖ASC细胞片以防止其干燥。同种异体ASC细胞片联合人工皮肤的移植策略，也可能适用于其他难治性溃疡或烧伤，例如外周动脉疾病和胶原血管病相关的创面，以及营养不良或正在使用类固醇的患者。因此，该治疗方法可能是改善糖尿病创面愈合治疗选择的第一步。

本方案旨在建立一种针对难治性糖尿病创面的新型细胞治疗策略。简而言之（如图1所示），采用细胞片工程技术从正常大鼠获取同种异体rASC细胞片，并将其与双层人工皮肤结合，移植至糖尿病大鼠的全层皮肤缺损部位。良好的rASC细胞片示例见图2A，不良示例见图2B，二者均展示于图2中。当将ASC细胞接种至新的培养皿时，应于培养箱内缓慢地前后左右轻摇培养皿，以实现rASC细胞的均匀接种和厚度一致的细胞片形成（图2A）。若rASC细胞无法在培养皿表面均匀贴附并生长，则无法获得完整连续的ASC细胞片（图2B）。图3展示了在室温下成功收获的、完整连续的ASC细胞片，表明ASC细胞已均匀贴附于培养皿表面。通常情况下，rASC细胞片可用镊子进行操作。若有必要，可使用转移膜将细胞片从培养皿转移至创面部位，尤其适用于细胞片较脆或易碎的情况。 
图...

脂肪来源的干细胞（ASCs）可从正常大鼠的脂肪组织中轻松分离和获取。利用细胞片工程技术可制备ASC片，并将其移植到具有全层皮肤缺损且骨组织外露的Zucker糖尿病肥胖大鼠体内，随后覆盖双层人工皮肤。

在糖尿病伤口愈合模型中构建与移植脂肪源性干细胞（ASC）片层

人工皮肤在临床实践中已取得显著的治疗效果。然而，对于糖尿病患者伤口的人工皮肤治疗……

本实验的总体目标是验证脂肪来源干细胞片联合人工皮肤对糖尿病大鼠大面积全层皮肤缺损创面愈合的影响。该方法有助于解答关于慢性创面愈合的关键问题，例如伴有骨外露的糖尿病大型创面的修复。该技术的主要优势在于利用细胞片技术将细胞以固态片状形式移植至创面，从而实现活性高、稳定性好的移植效果。对于脂肪垫供体，应选用8至33周龄的Lewis大鼠。在手术部位准备好若干无菌棉签、纱布、手术刀、持针器、手术剪、镊子以及5-0尼龙缝线。用于临时放置组织时，将100毫升培养皿中加入10毫升PBS。称量装有磷酸盐缓冲液的培养皿，以确定所收获组织的质量。将大鼠麻醉后，将其仰卧位放置在无菌手术单上。然后，剃除手术区域的毛发，并使用70%乙醇进行多次交替擦拭，清洁暴露的皮肤。现在，在侧下腹部做一切口，长度为三厘米。接着，暴露并分离腹外斜肌。然后，暴露围绕附睾的附睾脂肪组织。接下来，仔细分离附睾脂肪组织。注意避免损伤附睾、睾丸及附睾血管。将组织转移至盛有PBS的培养皿中。然后，缝合供体大鼠，并按照标准的术后护理程序进行处理。从收获的2至3克脂肪组织中分离ASCs。使用0.1% A型胶原酶消化组织1小时，以获得基质血管组分（SVF）。SVF纯化后，将其悬浮于20毫升培养基中。将细胞悬液分至两个60平方厘米的培养皿中，在标准条件下培养24小时。次日，用PBS洗涤培养皿三次，以去除未贴壁的细胞和碎片。最后一次洗涤后，重新加入新鲜的完全培养基。随后继续传代培养细胞，直至培养第三天细胞接近亚汇合状态。然后，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶EDTA进行短暂孵育。从培养板中取出细胞。注意细胞暴露于活性胰蛋白酶的时间不要超过10分钟。观察并计数细胞后，以每平方厘米1,700个细胞的密度进行传代培养。随后每隔三天传代一次细胞，并完成三次传代后再继续实验。第三次传代复苏的大鼠ASCs后，将150,000个细胞接种至直径为35毫米的温度响应性培养皿中，并加入2毫升培养基。将培养皿置于培养箱中培养三天，以形成均一的细胞片层。三天后更换培养基，并添加每毫升16.4微克的AA。随后继续培养细胞，每隔一天更换一次含AA的培养基。在含AA的培养基中培养四到五天后，观察ASCs的增殖情况。注意观察细胞之间以及连续细胞层中是否存在间隙。当形成连续的细胞层后，即可将这些细胞用于模型实验。需要时，将培养板置于室温下15至20分钟，收集细胞层。由于培养板具有温度敏感性，细胞会自发地以连续片状脱离，可用镊子将细胞片完整取出。对于肥胖伤口愈合模型，使用16至18周龄、体重在500至600克之间的成年雄性ZDF大鼠。将大鼠置于手术区域并进行麻醉，在剃除头部毛发前，先用70%乙醇清洁头部。随后剃除手术区域的毛发，并用70%乙醇交替擦拭暴露的皮肤进行清洁。在此期间，将装有温度敏感性脂肪干细胞的培养皿转移至实验台。在细胞片脱离培养皿之前，移除培养基，并用 PBS 洗涤细胞片三次。收集细胞片后，将其浸泡于 PBS 中，待使用时取出。细胞准备好后，在大鼠头部制作一个15毫米×10毫米的全层皮肤缺损。首先，去除皮肤组织直至骨膜层。然后，使用手术刀和手术剪切除皮肤及皮下组织。为了完成缺损修复，使用骨膜刮匙去除骨膜。然后将细胞片覆盖于缺损处。干细胞片具有柔软且灵活的特性。使用镊子将其延伸至缺损的每个角落。现在，用一块使用前已浸透生理盐水的 10 × 15 毫米人工皮肤覆盖细胞片和缺损区域，并用 5-0 尼龙缝线进行约 10 针缝合以关闭伤口。为保护伤口，使用 5-0 尼龙缝线将一块 15 × 20 毫米的非粘性敷料固定在人工皮肤上方。计划每隔一天观察一次敷料，因为大鼠 invariably 会将其移除，必要时应及时更换敷料。在两组各六只 Zucker 糖尿病肥胖大鼠中，采用所述方案制备颅骨缺损。实验组大鼠接受大鼠脂肪干细胞片治疗，对照组则不予治疗。14天后，治疗组的伤口明显小于对照组。观看本视频后，您应能够充分掌握如何在大鼠身上制造暴露骨组织的大面积伤口，并使用脂肪来源的干细胞对这类伤口进行治疗。在实施该操作过程中，务必在整个使用温度响应性培养皿的过程中严格控制温度管理。否则，细胞可能会自发从培养皿上脱落，从而延误实验进程。

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科研

JoVE Journal

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医学

创作和移植的糖尿病伤口愈合模型中脂肪源性干细胞 (ASC) 表

我们开发了一种微创技术，通过分离中央动脉和神经以及颅侧神经血管束，建立兔缺血性耳部伤口模型。随后，通过皮下隧道切断所有皮下组织。该手术对皮肤的损伤极小，可安全用于糖尿病动物。...

一种简化的小鼠缺血性伤口模型制备技术

本方案描述了从脂肪抽吸物中分离脂肪源性基质细胞以及制备4...

使用抽脂术获取的脂肪源性基质细胞修复颅骨临界尺寸缺损模型

本方案演示了小鼠胰岛的分离及其在脱细胞支架上的接种。将支架支持的胰岛移植到链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病小鼠的附睾脂肪垫中。胰岛在移植部位存活，并逆转了高血糖状态。...

支架支持的胰岛移植至糖尿病小鼠附睾脂肪垫

本研究报道了一种在猪模型中通过内镜进行脂肪组织来源的基质细胞（ADSC）片移植以预防广泛内镜黏膜下剥离术（ESD）后食管狭窄的成功方法。...

ADSC片移植预防食管大面积内镜下黏膜剥离术后狭窄

本文介绍了一种在大鼠模型中将脂肪组织来源的干细胞（ASC）片层制备并移植到缝合不充分的结直肠吻合口上的方法。这一新型应用表明，ASC片层可减少结直肠吻合口漏的发生。...

移植脂肪组织来源的干细胞片以减少大鼠模型部分结肠切除术后渗漏

本方案描述了一种小鼠胰岛分离及将其移植至腹股沟皮下白色脂肪组织的方法。将分离的同系小鼠胰岛利用基底膜水凝胶移植到小鼠受体体内。监测受体的血糖水平，并对胰岛移植物进行组织学分析。...

小鼠胰岛的腹股沟皮下白色脂肪组织（ISWAT）移植模型

本方案描述了一种改进的ADSC分离方法，与文献报道相比，该方法可获得极高的细胞产量，并节省大量时间。本研究还提供了一种简单的方法，可在长期冻存后获得相对大量的活细胞。...

从脂肪组织中获取间充质干细胞及长期冷冻保存后基质血管组分表征的技术

雄性SD大鼠链脲佐菌素诱导的糖尿病伤口模型是目前研究1型糖尿病伤口愈合最常用的模型。本方案描述了构建该模型所使用的方法，同时提出并解决了可能遇到的挑战，并探讨了糖尿病伤口的进展过程及其血管生成特征。...

1型糖尿病大鼠伤口模型构建方案

本方案描述了一项前瞻性、随机、对照的临床研究，旨在评估人脐带间充质干细胞注射治疗慢性糖尿病足溃疡的效果。...

一项针对人脐带间充质干细胞注射治疗糖尿病足溃疡的前瞻性、随机对照研究

本研究提出了一种用于慢性伤口愈合的核-壳结构3D生物打印支架的制备方案。从间充质干细胞中分离提取细胞外囊泡，并将其载入由海藻酸盐构成的芯层，壳层则由羧甲基纤维素和海藻酸盐裂解酶组成。该设计可实现支架的可控降解及细胞外囊泡的高效释放。...

利用同轴3D生物打印支架优化细胞外囊泡递送以管理慢性伤口

学习利用脂肪源性干细胞片结合人工皮肤治疗糖尿病大鼠慢性伤口的方法。该技术通过细胞片工程实现稳定移植，为全层皮肤缺损伴骨暴露的难愈性创面提供有效治疗策略。

在糖尿病伤口愈合模型中构建与移植脂肪源性干细胞（ASC）片层

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