Name: 自动声胶肽受体激动剂的效价测定测定的连续稀释 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-10T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: 学习自动化声胶肽样品连续稀释技术，通过减少肽吸附到塑料器皿来提高药物发现中效价测定的准确性。该方法利用声学非接触式分配消除样品残留误差，增强数据质量和可重复性，支持先导化合物识别与优化。

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1. 肽的系列稀释
<ol>
	<li>配制检测缓冲液：在Hanks平衡盐溶液（HBSS）中加入25 mM HEPES、0.1% BSA和0.5 mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX），调节pH至7.4。</li>
	<li>使用大量试剂分液器，向五块384孔低容量检测板的每孔中系统加入5 µl检测缓冲液。
	<ol>
		<li>根据制造商说明，使用内部软件创建加样程序，向384孔板的每个孔中加入5 µl体积的液体。</li>
		<li>将分配卡式管路浸入检测缓冲液中，并用液体预冲洗管路。</li>
		<li>将384孔低容量检测板放置于板架上。</li>
		<li>按下开始。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有肽样品（无论储存介质如何）用检测缓冲液稀释，配制成100倍浓度的肽储备液。 
	注意：根据具体情况，用于筛选的肽段可提供于磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）中 （例如， DMSO 会对具有二级修饰（如聚乙二醇化）的肽产生不利影响。</li>
	<li>将25 µl 100倍浓度的肽段储备液加入声学兼容的384孔聚丙烯微孔板的第1至第5列中。该微孔板指定为“源板A”。确保源板（而非目标板）为平底，并符合声学仪器制造商规定的特定声学公差要求。</li>
	<li>向A板的A23和A24孔中各加入25 µl 100倍参考对照品。</li>
	<li>向A源板的第11-15列加入10 µl检测缓冲液，向第21-22列加入30 µl检测缓冲液。</li>
	<li>向第二个经声波验证合格的384孔聚丙烯微孔板的第6-10列和第16-20列中每孔加入10 µl检测缓冲液。该板标记为“源板B”。</li>
	<li>将源板 A 和 B 在 300 × g 离心 1 分钟。需放置适当的平衡板。</li>
	<li>使用集成在自动化机器人系统中的声波液体分配器，将A源第1列中的100倍浓度肽储备液用检测缓冲液依次进行三步1:100的中间稀释。 
	注意：编程需要进行板式重排，并使用剂量反应软件（由声学液体分配仪制造商提供），以实现从源 A 到源 B 的三次声学转移（参见 图1 用于板布局）。步骤1.9详细说明了本实验室在自动化机器人控制下所使用的液体分配器（参见 材料表):
	<ol>
		<li>将源板和检测板装入自动化系统中的板架区域。</li>
		<li>打开自动化机器人软件，加载平板重格式化和剂量反应程序扩展方案，点击“运行”。 
		注意：自动化系统指示一台声波液体分配器将源板A第1-5列中的250 nl液体转移至源板B第6-10列中，同时使用另一台可处理较大液体体积的声波液体分配器加入15 µl检测缓冲液进行补足以实现混匀。随后，自动化系统将源板B转移至集成离心机中，在300 × g条件下离心1分钟（所有离心步骤均包含适当的配平板）。源板B随后被送回声波液体分配器，将其中第6-10列的250 nl液体转移至源板A第11-15列，并加入15 µl检测缓冲液进行补足以实现混匀。自动化系统再将源板A转移至集成离心机中，在300 × g条件下离心1分钟。接着，源板A被送回声波液体分配器，将其中第11-15列的250 nl液体转移至源板B第16-20列，并加入15 µl检测缓冲液进行补足以实现混匀。随后，自动化系统将源板B转移至集成离心机中，在300 × g条件下离心1分钟。 
		注意：最后，剂量反应实验方案指导声波液体处理系统从源板A和源板B中各4个连续稀释的孔中转移所需体积，以在检测板中建立完整的11个浓度点、每个点设复孔的剂量反应曲线（检测板已在上述步骤1.2中预先加入5 µl检测缓冲液）。自动化系统将检测板转移至内置离心机，以300 × g离心1分钟。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 细胞制备
<ol>
	<li>在37 ºC水浴中快速解冻表达目标小鼠GLP-1受体的中国仓鼠卵巢（CHO）冷冻细胞，并将其重悬于20 ml分析缓冲液中。</li>
	<li>将细胞悬液在室温（RT）下以200 × g离心5分钟。需使用适当的平衡。</li>
	<li>弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于10 ml分析缓冲液中。</li>
	<li>用台盼蓝将细胞储备液按1:1稀释，使用自动细胞计数仪测定活细胞密度。将细胞重悬于分析缓冲液中，浓度为每毫升1.6 × 106个细胞（相当于每孔分析板中8,000个细胞）。</li>
	<li>使用大量试剂分配器将5 µl细胞悬液加入分析板的每孔中（每孔已含有5 µl分析缓冲液中系列稀释的多肽），并在室温下孵育30分钟。</li>
</ol>
3. HTRF cAMP 检测实验
<ol>
	<li>使用前将HTRF cAMP检测试剂盒置于室温下30分钟。</li>
	<li>分别用裂解缓冲液（制造商提供的cAMP检测专用配方）将每种HTRF试剂（cryptate和d2）按1:20比例稀释。 
	注意：警告：裂解缓冲液含有氟化钾（KF），具有毒性且为致畸物13。处理时，含KF的检测板应密封后焚烧，所有液体废弃物在排入下水道前必须用水稀释至&#60;1 mmol/L。</li>
	<li>使用多通道试剂分配器向检测板的所有孔中加入5 µl cryptate试剂。</li>
	<li>使用多通道试剂分配器向检测板的第1至22列孔中加入5 µl d2试剂。</li>
	<li>立即手动移液5 µl裂解缓冲液至检测板A23-D24孔，作为非特异性结合（NSB）对照孔；向E23-P24孔中加入5 µl d2试剂。</li>
	<li>将检测板在室温下以200 × g离心1分钟，以充分混匀各孔内容物。</li>
	<li>覆盖检测板以减少蒸发和光漂白，并在室温下孵育1小时。</li>
	<li>使用酶标仪在320 nm激发光下检测荧光共振能量转移（FRET）信号，分别在620 nm和665 nm处读取发射光信号。</li>
</ol>
4. 数据分析
<ol>
	<li>使用平均非特异性结合（NSB）值从所有孔中扣除背景。</li>
	<li>根据665 nm/620 nm的比值计算%Delta F，方法如下： 
	比值 = (A665nm/A620nm) × 104 
	Delta F = ((样本比值 - RatioNSB) / RatioNSB) × 100 
	其中，RatioNSB 为未加d2试剂的孔的比值。</li>
	<li>计算未刺激细胞与用最大浓度GLP-1配体刺激的细胞之间的%激活率，方法如下： 
	%激活 = (%Delta F样本 - %Delta F未刺激细胞) / (%Delta F GLP-1刺激细胞 - %Delta F未刺激细胞) × 100</li>
	<li>通过四参数逻辑分析法分析浓度-反应曲线，并以参照对照定义的%激活率为纵坐标作图1。</li>
</ol>

<ol><li>Naylor, J., Rossi, A., Hornigold, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acoustic+Dispensing+Preserves+the+Potency+of+Therapeutic+Peptides+throughout+the+Entire+Drug+Discovery+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Acoustic Dispensing Preserves the Potency of Therapeutic Peptides throughout the Entire Drug Discovery Workflow.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 90-96 (2016).</li>
<li>Campbell, J. E., Drucker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacology%2C+physiology%2C+and+mechanisms+of+incretin+hormone+action%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.Metab%22%5BJournal%5D)">Pharmacology, physiology, and mechanisms of incretin hormone action.</a> Cell.Metab. 17 (6), 819-837 (2013).</li>
<li>Hui, H., Farilla, L., Merkel, P., Perfetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+short+half-life+of+glucagon-like+peptide-1+in+plasma+does+not+reflect+its+long-lasting+beneficial+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.J.Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The short half-life of glucagon-like peptide-1 in plasma does not reflect its long-lasting beneficial effects.</a> Eur.J.Endocrinol. 146 (6), 863-869 (2002).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+contact-free+volume+transfers+minimize+compound+loss+in+dose-response+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, contact-free volume transfers minimize compound loss in dose-response experiments.</a> J.Biomol.Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Ekins, S., Olechno, J., Williams, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispensing+Processes+Impact+Apparent+Biological+Activity+as+Determined+by+Computational+and+Statistical+Analyses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dispensing Processes Impact Apparent Biological Activity as Determined by Computational and Statistical Analyses.</a> PLoS ONE. 8 (5), 62325(2013).</li>
<li>Goebel-Stengel, M., Stengel, A., Tache, Y., Reeve, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+using+the+optimal+plasticware+and+glassware+in+studies+involving+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.Biochem%22%5BJournal%5D)">The importance of using the optimal plasticware and glassware in studies involving peptides.</a> Anal.Biochem. 414 (1), 38-46 (2011).</li>
<li>McDonald, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+Contaminants+Leach+from+Disposable+Laboratory+Plasticware%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bioactive Contaminants Leach from Disposable Laboratory Plasticware.</a> Science. 322 (5903), 917(2008).</li>
<li>Belaiche, C., Holt, A., Saada, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonylphenol+ethoxylate+plastic+additives+inhibit+mitochondrial+respiratory+chain+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonylphenol ethoxylate plastic additives inhibit mitochondrial respiratory chain complex I.</a> Clin Chem. 55 (10), 1883-1884 (2009).</li>
<li>Sackmann, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technologies+That+Enable+Accurate+and+Precise+Nano-+to+Milliliter-Scale+Liquid+Dispensing+of+Aqueous+Reagents+Using+Acoustic+Droplet+Ejection%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Technologies That Enable Accurate and Precise Nano- to Milliliter-Scale Liquid Dispensing of Aqueous Reagents Using Acoustic Droplet Ejection.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 166-177 (2016).</li>
<li>Grant, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+accurate+compound+concentration+in+cell-based+screening%3A+validation+of+acoustic+droplet+ejection+technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Achieving accurate compound concentration in cell-based screening: validation of acoustic droplet ejection technology.</a> J.Biomol.Screen. 14 (5), 452-459 (2009).</li>
<li>Turmel, M., Itkin, Z., Liu, D., Nie, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Innovative+Way+to+Create+Assay+Ready+Plates+for+Concentration+Response+Testing+Using+Acoustic+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">An Innovative Way to Create Assay Ready Plates for Concentration Response Testing Using Acoustic Technology.</a> J.Lab.Autom. 15 (4), 297-305 (2010).</li>
<li>Butler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+site-specific+retargeting+jump-in+platform+cell+line+to+support+biologic+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.Screen%22%5BJournal%5D)">Use of the site-specific retargeting jump-in platform cell line to support biologic drug discovery.</a> J.Biomol.Screen. 20 (4), 528-535 (2015).</li>
<li>Panchal, S., Verma, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sodium+fluoride+in+maternal+and+offspring+rats+and+its+amelioration%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pac.J.Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of sodium fluoride in maternal and offspring rats and its amelioration.</a> Asian Pac.J.Reprod. 3 (1), 71-76 (2014).</li>
<li>Hanson, S. M., Ekins, S., Chodera, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+error+in+experimental+assays+using+the+bootstrap+principle%3A+understanding+discrepancies+between+assays+using+different+dispensing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J.Comput.+Aided+Mol.Des%22%5BJournal%5D)">Modeling error in experimental assays using the bootstrap principle: understanding discrepancies between assays using different dispensing technologies.</a> J.Comput. Aided Mol.Des. 29 (12), 1073-1086 (2015).</li>
<li>Harris, D., Olechno, J., Datwani, S., Ellson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient%2C+Contact-Free+Volume+Transfers+Minimize+Compound+Loss+in+Dose-Response+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22J.Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Gradient, Contact-Free Volume Transfers Minimize Compound Loss in Dose-Response Experiments.</a> J.Biomol. Screen. 15 (1), 86-94 (2010).</li>
<li>Chan, G. K. Y., Wilson, S., Schmidt, S., Moffat, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+potential+of+high-throughput+drug+combination+assays+using+acoustic+dispensing%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Unlocking the potential of high-throughput drug combination assays using acoustic dispensing.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 125-132 (2016).</li>
<li>Roberts, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+and+challenges+of+direct+acoustic+dosing+into+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.Lab.Autom%22%5BJournal%5D)">Implementation and challenges of direct acoustic dosing into cell-based assays.</a> J.Lab.Autom. 21 (1), 76-89 (2016).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突披露。

本方案描述了采用自动化声波移液技术对肽样品进行系列稀释的成功应用，浓度范围可达3 × 106，且所需样品量少于1 µl。该方法的主要优势在于，通过减少样品与实验容器及塑料耗材（如移液枪头）的接触——这些耗材通常用于试剂转移和混合——从而最大限度地降低肽在塑料器皿上的吸附，提高数据质量。尽管声波移液技术并未完全排除塑料耗材的使用，但已显著减少了其使用量。此外，去除基于枪头的移液操作还可消除样品交叉污染，避免误差在整个系列稀释过程中累积，从而实现可靠且可重复的浓度-反应曲线制备14,15。
其他研究团队已报道，将溶解在DMSO中的测试化合物通过声波转移直接递送至细胞，用于长期检测（&#62;48小时），除倒置检测板并在一定时间内孵育外，无需额外的混匀步骤16,17。DMSO具有高度极性，与必须在PBS中配制和保存的生物样品相比，更易于与水溶液混合。因此，在采用自动化方法进行肽样品的声波转移时，我们增加了回补和离心步骤，以确保充分混匀，从而实现准确的样品系列稀释。我们的经验表明，仅靠离心不足以确保水相样品的完全混合，因此开...

GLP-1R 是治疗2型糖尿病的已知药物靶点2该受体的天然肽类激动剂GLP-1具有一个 体内 半衰期为2-3分钟3GLP-1 与其G蛋白偶联受体结合后，通过内源性G蛋白激活腺苷酸环化酶，从而在下游生成第二信使cAMP。检测累积的cAMP可提供一种可靠的检测方法，用于监测受体激活状态，并筛选具有理想理化性质的GLP-1类似物。该检测方法需对测试样品进行系列稀释以构建浓度-反应曲线，而在处理肽类样品时尤为复杂。基于移液头的系列稀释制备过程中可能产生的误差此前已有报道。1,4,5肽类物质会吸附于塑料器皿，导致效价评估结果不可靠。通过在缓冲液中添加牛血清白蛋白（BSA）并使用硅化处理的塑料器皿，可在一定程度上减少肽的损失，但蛋白质结合仍具有不可预测性。特别是已有文献报道GLP-1在不同实验容器中的结合存在显著差异。6此外，实验室塑料器皿中使用的稳定剂可能会从吸头和微孔板中渗出，进入水相测定缓冲液，从而干扰蛋白质功能7, 8因此，有必要采用减少接触塑料器皿的方法，以提高测量结果的准确性。
声学液体分配器将高频声波聚焦于液体样品表面，从而将精确的纳升级液滴喷射到相邻的检测板中9。在制药行业中，声学喷射技术已广泛用于大规模合成化合物库的制备与筛选，并且该技术在小分子应用方面已得到充分验证10。据我们所知，我们是首个描述采用声学分配技术进行重组肽和合成肽制备的研究团队，并且我们此前已报道过该方法相较于传统的基于移液头的方法具有更高的准确性1。
本文介绍了一种将非接触式声波转移技术用于制备肽段系列稀释液和直接稀释液，并将其整合到全自动微孔板操作机器人系统中的方法。此前已有多种涉及样本声波转移的方法被报道11。我们采用两步法来制备中间储备浓度，并对肽类似物进行系列稀释，以生成完整的剂量-反应曲线。将制备好的肽段与表达靶标小鼠GLP-1R的细胞共同孵育，利用 commercially available 均相时间分辨荧光（HTRF）检测法测定细胞内cAMP的累积量，作为肽激动剂活性的读数。该检测方法稳定可靠，适用于高通量384孔板格式，常规应用于检测方法开发和药物筛选项目12。

<table><tbody><tr><td>汉克斯&amp;rsquo; 平衡盐溶液</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>3-异丁基-1-甲基黄嘌呤</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7018</td><td>以DMSO配制为0.5 M的储存液</td></tr><tr><td>GLP-1（7-36）酰胺</td><td>Bachem</td><td>H-6795</td><td>以 PBS 配制为 1 mg/ml 的储存液，称为“100倍参考对照”</td></tr><tr><td>测试肽段</td><td>在MedImmune内部生产</td><td></td><td>根据需要以不同浓度提供于DMSO或PBS中</td></tr><tr><td>100倍肽段储备液</td><td>在MedImmune内部生产</td><td></td><td>将测试多肽用测定缓冲液稀释至最终所需浓度的100倍</td></tr><tr><td>0.4% 台盼蓝溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Cedex XS 细胞分析仪</td><td>Innovatis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>康宁384孔低容量板</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4514</td><td></td></tr><tr><td>Echo认证的384孔聚丙烯微孔板</td><td>Labcyte Inc.</td><td>P-05525</td><td></td></tr><tr><td>Echo认证储液槽</td><td>Labcyte Inc.</td><td>ER-0055</td><td></td></tr><tr><td>Echo 550 液体处理仪</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>液滴转移体积以2.5 nl为增量</td></tr><tr><td>Echo 525 液体处理仪</td><td>Labcyte Inc.</td><td></td><td>液滴转移体积，以25 nl为增量</td></tr><tr><td>ACell 台式自动化系统&amp;nbsp;</td><td>HighRes Biosolutions</td><td>MC522</td><td></td></tr><tr><td>生命科学机器人用 Cellario 实验室自动化排程软件</td><td>HighRes Biosolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multidrop Combi 试剂分配器</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>5840300</td><td>被称为“大量试剂分配器”</td></tr><tr><td>HTRF cAMP 动态 2 试剂盒</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEJ</td><td></td></tr><tr><td>EnVision 多功能酶标仪</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

用于肽类激动剂效价测定实验中系列稀释的自动化声波移液技术

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

与小分子药物发现类似，筛选肽类激动剂需要对肽进行系列稀释以生成浓度-反应曲线。肽类筛选具有更高的复杂性，因为传统的基于移液枪头的样品操作方法会使肽暴露于大量塑料器皿表面，从而增加肽通过吸附作用损失的风险。减少肽与塑料器皿的过度接触可降低因黏附导致的肽损失，从而减少效价预测中的误差。我们此前已描述了非接触式声波移液技术在此类应用中的优势。 体外 高通量筛选肽类激动剂1在此，我们讨论一种完全集成的自动化解决方案，用于在微孔板中非接触式声波制备肽类系列稀释液，并以筛选小鼠胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）的肽类激动剂为例进行说明。我们的方法可实现基于细胞的高通量筛选以检测激动剂，并且易于扩展，以支持更高的样品通量，或允许增加检测板的复制数量例如，针对更多靶细胞系的检测 panel）。

我们常规采用两步法通过声波转移技术稀释多肽。第一步，将声波分配器与自动化系统对齐，用于在两个源板上制备四种多肽储备液的中间稀释液（图1a、b）。第二步，使用声波分配器进一步将源板A和B中的储备稀释液稀释，为每种待测多肽生成11个浓度点的浓度梯度（图1c）。每个多肽浓度梯度在检测板上从左到右以复孔形式点样，使得每块384孔检测板可同时筛选16种不同的多肽（图1c）。通过向检测板各孔补充检测缓冲液，确保每个孔中的总体积保持恒定（图1d）。同时，将参比多肽阳性对照以最大有效浓度转移至目标板中。
使用荧光酶标仪读取微孔板数据，并展示一个包含16种肽段（每个样本设两个复孔）的示例微孔板的热图（图 2a）。所使用的cAMP累积检测是一种反向竞争性检测，因此低值（显...

在传统的基于移液头的连续稀释过程中，多肽吸附到塑料器皿上会显著影响活性测定结果，并干扰对药物发现过程中先导化合物筛选和优化阶段所依赖的构效关系的理解。本文描述了多肽样品自动化声学非接触式连续稀释的方法。

与小分子药物发现类似，筛选肽类激动剂需要对肽进行系列稀释，以生成浓度-反应曲线。

本自动化肽样品系列稀释方案的总体目标是最大限度减少肽在塑料器皿上的吸附，从而为药物发现提供准确的效价测定结果。该方法可提高数据的质量和可重复性，同时去除基于移液吸头的移液操作，避免样品交叉污染，防止误差在整个系列稀释过程中传递。该技术的主要优势在于通过减少肽在塑料器皿上的吸附，提高数据质量。这对于推动药物发现中的构效关系研究或先导化合物鉴定项目尤为重要。根据文本方案配制检测缓冲液，并为大量分液器创建分液程序后，将分液盒管路浸入检测缓冲液中，并用液体进行预冲洗。将一块384孔低体积检测板放置在板架上。然后按下开始按钮。将25 µL的100倍浓度肽原液分别加入声学兼容的384孔平底聚丙烯微孔板的第1至第5列中，该板指定为源板A。将25 µL的100倍浓度参考对照加入A23和A24孔中。然后向第11至第15列每孔加入10 µL检测缓冲液，向第21至第22列每孔加入30 µL检测缓冲液。接下来，向指定为源板B的第二个经声学验证的384孔聚丙烯微孔板的第6至第10列以及第16至第20列中，每孔加入10 µL的检测缓冲液。将源板A和源板B在300 ×g下离心1分钟。然后，将源板和检测板装载到机器人系统的板架区域中。然后根据文本方案运行机器人软件，使用系统中集成的声波液体分配器制备连续三步的1:100中间稀释液。首先将源板A的第1至第5列转移至源板B的第6至第10列。完成第一次1:100稀释后，让自动化系统将源板B转移至集成的离心机中，在300 × g条件下离心1分钟，然后将该板返回至声波液体分配器。接着，在将溶液从源板B转移至源板A以进行第二次1:100稀释后，自动化系统会将源板A转移至离心机离心，随后将其返回至液体分配器。最后，在自动化系统将100倍稀释的溶液从A板转移至B板第三次后，再次对B板进行离心。随后，如文本方案所述，利用A板和B板中的肽段稀释液在检测中制备完整的浓度-反应曲线。此步骤至关重要，因为基于吸头的对比方法会因肽段吸附于塑料耗材而导致样品活性显著下降。在37摄氏度水浴中快速解冻表达目标小鼠GLP1受体的冻存CHO细胞，并用20毫升测定缓冲液重悬细胞。在室温下以200 × g离心细胞悬液5分钟。弃去上清液，并用10毫升测定缓冲液重悬细胞沉淀。用台盼蓝将细胞原液按1:1稀释，使用自动细胞计数仪测定活细胞密度。随后用检测缓冲液将细胞重悬，调整浓度至每毫升160万个细胞。使用多通道试剂分配器，向含有梯度稀释肽段的检测板各孔中加入5微升细胞悬液，室温孵育30分钟。进行环磷酸腺苷检测实验时，使用裂解缓冲液将每种均相时间分辨荧光（HTRF）试剂分别稀释至1:20。使用多通道试剂分配器向所有检测板的孔中各加入5 µL的荧光螯合物试剂。然后向检测板的第1至第22列各孔中加入5 µL的D2试剂。接下来，将5 µL D2试剂加入E23至P24孔中。立即使用手动移液器向A23至D24孔中各加入5 µL裂解缓冲液，作为非特异性结合对照孔。将检测板在室温下以200 × g离心1分钟，以混匀各孔溶液。然后盖上培养板，37℃孵育1小时。孵育结束后，使用酶标仪在320纳米激发波长下检测FRET信号，并在620纳米和665纳米处分别读取发射波长信号。按照文中的实验方案分析数据。环磷酸腺苷检测实验中声波转移的第一步是，在两个源板中制备四种肽段储备液的中间稀释液，如图所示。第二步，声波分配仪将A板和B板中的储备液进一步稀释，为16种不同的肽段各自生成11个浓度点，并每个浓度设两个复孔。通过缓冲液补足体积，确保检测板中每个孔的总体积保持恒定。图中显示了一个示例板的热图，该板包含16种肽段，通过环磷酸腺苷（cyclic AMP）累积实验重复检测。紫色表示较低的数值，代表较高的环磷酸腺苷浓度。这些浓度-反应曲线展示了重复检测点的一致性。样品一代表该检测的阳性对照。样品二、三和四无活性，在图中以平坦的线条表示。样品五至十六代表具有活性的测试肽段。本文介绍的方法可用于在较宽的效价范围内生成完整的浓度-反应曲线。掌握该技术后，可在三小时内完成实验，但具体时间将取决于需要制备的样品数量。在进行该操作时，需牢记多肽属于生物样品，应按照生物样品的规范进行处理。为保持其完整性，应避免反复冻融。该技术将为肽类药物发现领域的研究人员提供新的途径，并实现准确的活性预测，从而推动构效关系的研究。观看本视频后，您应能充分理解用于肽溶液系列稀释的自动化声波移液技术，该方法可最大限度减少因吸附导致的肽损失，并提高测量结果的准确性。请务必注意，操作具有皮摩尔级活性的生物活性肽可能极为危险，应始终采取预防措施，例如使用个人防护装备。

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