利用诱导体细胞扇形分析（ISSA）研究木材形成及茎次生发育相关基因与启动子

诱导体细胞区段分析的总体目标是提供一种中高通量的技术，用于在相对较短的时间内对树木次生茎组织中的基因和启动子结构进行功能表征。该方法有助于回答一些关键问题，例如特定基因在何时何地表达，以及它们在木材形成和茎次生发育等重要生物学过程中的作用。该技术的主要优势在于其高效、简便且相对快速，适用于多种树木物种。

首先，准备一个洁净的50毫升螺口管，加入19毫升新鲜的、37摄氏度预热的LB培养基（含适当抗生素用于细菌筛选）。加入1毫升农杆菌（A. tumefaciens）培养物，于600纳米波长处测定光密度（OD）。若OD值高于0.1，则用预热的LB培养基进一步稀释。将农杆菌培养物置于摇床培养箱中培养，直至OD600值达到0.4至0.6之间。

达到此状态后，在 4 °C、1,000 × g 条件下离心 15 分钟。倒出管中的液体，并立即用 1 毫升预冷的 MS 培养基重悬细胞沉淀。将悬液转移至洁净的 2 毫升微量离心管中，置于冰上保存，待用时取出。

在春季或初夏开始实验，选择形成层活跃且生长迅速的植株。若韧皮部可轻易与木质部分离，则表明形成层活性良好。在植株基部附近选取一段笔直的茎段，并去除所有叶片和侧枝。

使用锋利的解剖刀，通过在韧皮部上间隔五毫米处制作两条平行的20毫米切口，然后在底部末端作一条横切口，将两条纵切口平分，从而切出一个一平方厘米的形成层窗口。将韧皮部条向上剥离，暴露正在发育的木质部组织。然后使用移液器加入足量的接种培养基，使暴露的木质部表面完全润湿。

立即把韧皮部条重新插入茎中，并用封口膜紧密固定。对所有目标基因或启动子重复上述接种步骤，在已有切口上下至少1厘米处、并呈90度偏移的位置创建新的形成层窗口。此外，与实验组接种物相同，需在同一茎或不同茎上接种阳性对照和阴性对照载体。

定期监测茎的生长情况，当观察到径向生长至少达到五毫米时，采集组织进行β-葡萄糖醛酸酶（beta-glucuronidase）或GUS检测。采集测试材料时，首先从茎上切除形成层窗口区域，去除不属于新生长部分的任何组织。对于涉及成熟木质部和韧皮部细胞或组织形态的研究，将韧皮部从木质部分离剥离。

或者，对于需要保持形成层区域完整或评估启动子表达模式的研究，可使用剃须刀片将形成层窗口横向切开，制成厚度在0.5至1毫米之间的圆片。将收获的形成层窗口组织分别放入14毫升的圆底试管中，用pH为7的0.1摩尔磷酸缓冲液冲洗两次，每次5分钟，确保组织完全浸没。第二次冲洗结束后，注意彻底去除所有多余的溶液。

接下来，向每个试管中加入 5 mL GUS 试剂。如果试剂未能完全覆盖组织样本，则需添加更多试剂。将试管在 55 °C 下避光孵育 10 分钟。

随后，将离心管置于摇床中，在 37 摄氏度避光条件下以温和振荡继续孵育 12 至 16 小时。从培养箱中取出后，随机选取部分离心管，使用 pH 范围为 0 至 7 的石蕊试纸检测 GUS 试剂的 pH 值。若其中任何样品的 pH 值低于 6，则标记这些样品，并检查其余各管。

标记并剔除 pH 值低于 6 的所有离心管。将离心管中的 GUS 试剂倾出，加入足量 70% 乙醇以浸没组织。将样品置于 4 °C 保存，待用。

使用干净的镊子将样本管中的所有形成层窗口组织取出，并置于小型托盘或培养皿上，以便进行显微观察。将样本置于解剖显微镜的物镜下，放大倍数为1X至4X，识别并统计呈现亮蓝色染色的细胞或组织数量。在韧皮部已被去除的示例中，计数位于发育中木质部表面的形成层组织中的扇区数量。

对于切成圆片的样品，统计不同细胞或组织类型中出现的扇形区域数量。确保观察圆片的两面，并将跨越两个圆片的扇形区域进行匹配，以避免数量被高估。仅将含有扇形区域的组织放回含有70%乙醇的离心管中，并保存至需要时使用。

对所有额外采集的形成层窗口（包括阳性和阴性对照）重复上述分析。为了准确识别和分类扇区，建议您熟悉茎的次生解剖结构与发育过程，包括茎对损伤的响应机制。该图显示了多个成功转化的区域，表现为蓝色染色区域。

一个示例的韧皮部剥离窗口显示了多个转化区域，从两种树木物种中收获的圆盘展示了转化区域及随后的径向生长情况。还可观察到多种组织类型中的转化现象。此处可在白杨茎的周皮、韧皮部、伤口薄壁组织以及多个其他组织区域中观察到转化区域。

该图像显示了形成层衍生物中基因启动子表达的结果。在此示例中，我们观察到在将来自尾叶桉的多种CesA启动子转化至桉树杂交种茎段的实验中，每种组织类型中染色所占的比例。韧皮部、发育中及已发育木质部中的表达以百分比表示。

每厘米接种形成层的平均转化事件数也可针对每个感兴趣的启动子或基因进行计算。该表格显示了利用圆盘 harvesting 法分析桉树和杨树样本中典型扇区所获得的数据，这些样本使用了阳性对照或感兴趣的启动子进行转化。一旦掌握，该技术可为解析次生茎发育过程中形成层分化复杂特性提供一种快速、高效且广泛应用的方法。

观看本视频后，您应能够很好地掌握如何准备植物和细菌材料，如何转化、培养和收获茎段，以及如何鉴定和分类转基因组织以进行表型评估。