从小鼠成年心脏窦房结分离、培养及功能表征心肌细胞的方法

本实验的总体目标是从小鼠中分离出可自发激活的窦房结心肌细胞，用于短期或中期的电生理学或成像实验。分离的窦房结心肌细胞对于研究心脏起搏机制至关重要，特别是用于研究特定离子电流或细胞内钙释放的时间调控。然而，目前仅有相对较少的实验室使用小鼠分离的窦房结心肌细胞，部分原因在于仅依靠书面方法很难掌握该操作技术。

准备好所有用于分离的溶液后，用剪刀去除动物胸部的毛发。然后使用外部组织镊子和解剖剪剪开肋骨，暴露胸腔。用两毫升预热的含肝素完全台氏液冲洗胸腔。

在解剖显微镜下，使用内用剪刀和解剖镊小心地移除肺和胸腺。在轻轻夹住心脏心尖的同时，仔细剪断下腔静脉和主动脉，将心脏从胸腔中取出。随后将心脏转移至其中一个硅胶解剖皿中，并用 2 至 4 毫升预温的含肝素完全Tyrode's溶液冲洗。

将心脏调整至后部血管朝上并可见的位置。接着，用大头针从心尖处将心脏固定在硅胶解剖皿中以 immobilize 心脏。随后，找到心室与心房之间的沟槽。

使用内用解剖剪，在靠近心室的沟槽处进行切口。根据需要，用额外的预温肝素化完全台氏液冲洗沟槽和切口，以清晰暴露心房和瓣膜。随后沿沟槽继续剪开，将心房与心室分离。

随后，将心房组织转移至第二个硅胶解剖皿中，并用3 mL预热的含肝素完全台氏液冲洗。然后，在轻轻拉伸组织标本的同时，通过下腔静脉将组织固定。接着翻转组织，使动物的右心房位于实验者左侧，左心房位于实验者右侧。

为了分离正确的组织，获取并识别方位至关重要。接下来，通过上腔静脉以及左右心耳将组织固定在针板上。清除残留的脂肪或其他组织，以获得清晰的标本视野。

随后，通过切开腔静脉来打开心房的前壁。根据需要旋转培养皿，以分离上腔静脉和下腔静脉。根据需要重新调整固定针的位置，以清晰显露房间隔。

然后沿房间隔剪开以去除左心房。重新用针固定标本，轻轻拉伸，并清除窦房结后方的脂肪组织。接着去除右心耳，然后沿界嵴剪开以游离窦房结，界嵴呈一条深橙色条带，位于心耳边缘。

重新固定或解除固定结节组织，并将其横向切割成三个大小相等的条状。在此步骤中，使用细窄的火焰抛光移液管，将三个窦房结组织条转移至三个小圆底管中的第一个，该管内含有 2.5 毫升低钙镁台氏液，孵育 5 分钟。5 分钟后，将组织条转移至第二个含有 2.5 毫升低钙镁台氏液的小圆底管中。

通过轻轻旋转离心管或使用细口移液器轻轻吹打来清洗组织条。切勿倒置离心管。然后将组织条转移至第三个含有 2.5 毫升低钙镁 Tyrode's 溶液的小型圆底管中，并重复洗涤步骤。

随后，将组织条转移至含有 2.5 毫升低钙镁 Tyrode 液（含酶）的大号圆底试管中。每隔五分钟轻轻旋转混匀试管。酶消化后，使用细口火焰抛光的移液管将组织条轻柔转移至三个含改良 KB 溶液的小号圆底试管中的第一个。

然后将组织条依次通过第二和第三个小的圆底管，以洗涤组织，再转移至含有KB溶液的大圆底管中。使用较大的火焰抛光移液管，在大圆底管中通过持续吹打使细胞解离，注意保持解离管始终浸没在35°C水浴中，并避免向溶液中引入气泡。我们发现，以大约每秒一次（即1赫兹）的频率用力吹出溶液效果最佳。

现在向组织中加入 75 µL 氯化钠氯化钙适应溶液。轻轻涡旋混匀，并孵育 5 分钟。继续按照书面方案中所述的步骤逐次添加氯化钙。

钙再适应后，通过静置约10分钟或在2,000 × g条件下离心3分钟收集窦房结心肌细胞。对于急性分离的细胞，使用移液管轻轻移除并弃去约5毫升上清液。然后将细胞在室温下保存最多8小时，用于膜片钳实验。

随后，可采用膜片钳记录技术对分离得到的窦房结心肌细胞进行功能评估，以检测其自发性动作电位和膜电流。分离的窦房结心肌细胞可在培养条件下维持活性长达六天。培养的细胞保持了与急性分离的窦房结心肌细胞极为相似的整体形态，其平均长度、宽度、横截面积以及膜电容与急性分离的细胞相比均无显著变化。

这些细胞适用于多种实验研究，例如电流和电压钳制记录。此处展示的示例包括自发性动作电位和起搏电流。一旦掌握相关技术，窦房结的解剖、细胞分离以及钙离子重灌注可在约两小时内完成，从而快速获得可用于实验的细胞。

在进行该操作时，需牢记组织的方向对于良好的解剖至关重要，且应按照文中所述优化酶解和机械解离步骤。完成该操作后，分离得到的窦房结心肌细胞可用于多种实验，包括单细胞电生理学、钙成像和免疫细胞化学。此外，这些细胞也可在培养条件下维持，用于需要基因操作或报告分子表达的实验。

观看本视频后，您应能充分掌握如何从成年小鼠中分离窦房结心肌细胞。祝您的实验顺利成功。