Name: Adenofection:用于研究分子伴侣在细胞地貌被耗尽，救援实验中的角色方法 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 34 s
Description: 学习腺病毒转染技术用于研究分子伴侣在细胞中的功能，通过耗竭-拯救实验在单细胞水平分析蛋白质动态与细胞完整性。该方法可在维持蛋白质稳态的同时精确操控蛋白水平，适用于有丝分裂和肌生成等关键生物学过程的功能研究。

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本工作由加拿大卫生研究院（资助号 7077）、贝里尼基金会和罗比基金会资助。

1. 培养基与溶液的制备（均需无菌过滤）
<ol>
	<li>C2C12 小鼠肌肉细胞（分化研究）
	<ol>
		<li>准备 500 ml C2C12 细胞培养维持用生长培养基：高糖 DMEM，添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。</li>
		<li>准备 100 ml C2C12 细胞分化用分化培养基（DM）：高糖 DMEM，添加 2% 马血清。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>HeLa 细胞（有丝分裂细胞研究）
	<ol>
		<li>准备 500 ml HeLa RFP-H2B 细胞培养维持与实验用 αMEM：αMEM 添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺（αMEM10%）。</li>
		<li>准备 500 ml 去核苷（不含脱氧核糖核苷/核糖核苷）αMEM 用于 HeLa RFP-H2B 细胞同步化：去核苷 αMEM 添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺（αMEM-minus10%）。</li>
		<li>准备 20 ml 不含酚红的 αMEM 用于 HeLa-RFP-H2B 活细胞成像：不含酚红的 αMEM 添加 10% 胎牛血清（FBS）和 2 mM L-谷氨酰胺。</li>
		<li>准备 100 mM 胸腺嘧啶核苷：将 24.2 mg 溶于 1 ml H2O 中，在 37 °C 下涡旋溶解。过滤除菌后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>常用溶液
	<ol>
		<li>准备 0.05% 胰蛋白酶/EDTA：含 0.05% 胰蛋白酶和 0.625 mM EDTA 的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）。过滤除菌，分装后于 -20 °C 保存。解冻后，分装液置于 4 °C 保存。</li>
		<li>准备 HBS2×：280 mM NaCl、50 mM HEPES、1.5 mM Na2HPO4。用 10 N NaOH 将 pH 精确调节至 7.01–7.05。过滤除菌后于 4 °C 保存。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 使用纤连蛋白包被细胞培养板并接种HeLa-RFP-H2B细胞
注意：在实验之前，每位操作者应优化细胞接种条件，以获得合适的细胞密度，因为不同操作者及不同细胞系之间可能存在差异。
<ol>
	<li>实验前一天，扩增 HeLa-RFP-H2B 细胞，确保在铺板当天细胞处于对数生长期。从一个 80% 汇合度的 10 cm 培养皿开始，在 10 cm 培养皿中连续进行两次 1/3 稀释。 
	注意：请规划实验所需的培养皿数量。每种实验条件需设置两个重复，一个用于短期活细胞成像，另一个用于提取蛋白，通过 Western blot 分析敲低效率和外源蛋白表达水平。额外准备一个培养皿，用于在病毒感染前测定细胞数量。</li>
	<li>在细胞铺板前，用 10 μg/ml 的纤连蛋白包被玻璃底培养皿。每个 35 mm 培养皿中加入 1 ml 1:100 稀释的 1 mg/ml 纤连蛋白溶液（用无菌 1×PBS 稀释），确保完全覆盖皿底表面，于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。</li>
	<li>孵育期间，将添加了 10% FBS 的 αMEM（αMEM10%）和 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 预热至 37 °C。</li>
	<li>孵育 45 分钟后，开始准备细胞悬液。在无菌操作台中，吸除 10 cm 培养皿中的培养基，用 1.5 ml 0.05% 胰蛋白酶/EDTA 轻柔冲洗两次，最后一次吸除时留下 0.5 ml 胰蛋白酶/EDTA。</li>
	<li>在 37 °C、5% CO2 条件下孵育细胞 2–3 分钟。轻敲培养皿并借助显微镜观察，确认所有细胞均已脱落。加入 10 ml αMEM10%，轻轻吹打数次以充分分散细胞。取 10 μl 细胞悬液，使用血细胞计数板进行细胞计数。</li>
	<li>吸除玻璃底培养皿中的纤连蛋白溶液。在细胞铺板前，切勿让纤连蛋白干燥。</li>
	<li>每 35 mm 培养皿中加入 2 ml αMEM10%，接种 1.5×105 个细胞，并在 37 °C、5% CO2 条件下孵育。30–45 分钟后在显微镜下检查，确保细胞分布均匀，避免细胞聚集于培养皿中心。</li>
	<li>如有必要，可轻柔地交叉晃动培养皿以重新分布细胞。除实验所需条件外，额外多铺一个 35 mm 培养皿，用于在病毒感染前测定细胞数量。</li>
	<li>继续培养细胞至次日，使其密度达到至少 50%。细胞密度过低（低于 50%）会导致病毒感染效率显著下降、单个细胞蛋白表达差异增大以及细胞毒性增加。 
	注意：使用纤连蛋白包被玻璃培养皿可改善细胞生长状态和形态，并促进细胞正常进行有丝分裂。通常可用价格更低的市售明胶替代。</li>
</ol>
3. 利用磷酸钙沉淀法在HeLa-RFP-H2B细胞中进行腺病毒感染及通过siRNA转染实现内源蛋白敲低
注意！ 操作病毒时需要采取特殊预防措施，并对所有接触过病毒的材料进行妥善处理。
注意！ 在我们的实验中，CaPi 沉淀物通常会产生更多不良影响，例如对涉及囊泡运输（例如，自噬）的生物过程造成干扰。因此，建议使用阳离子脂质转染试剂（见下文），并在分析前至少等待 48 小时。
注意：对照腺病毒携带一个无关基因（即， LacZ）或不携带任何基因的腺病毒，以最低量的携带目的基因的重组腺病毒实现所有腺病毒感染中的最低感染复数（MOI），通常为10–20 pfu/细胞。
注意：该步骤已被证明有助于在大量细胞群体中实现每细胞表达量的标准化。
<ol>
	<li>细胞接种后24小时，对额外接种的培养皿中的细胞进行计数。吸除培养基，用1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA冲洗一次。再次加入1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 直至所有细胞脱落。用1 ml移液器充分吹打分散细胞，使用血细胞计数板计数每毫升细胞数量。</li>
	<li>确定转导细胞所需的病毒量，转导复数（MOI）为每个细胞感染2个噬斑形成单位（PFU）的目的蛋白（POI）和每个细胞18个PFU的空载体例如， LacZ) 以达到每个细胞20 PFU的总量。同时，分别以4 PFU的杆状病毒（Actin 和 αTubulin，分别带有GFP和RFP标签）进行共转导。使用以下腺病毒转导（adenofection）方案转导细胞。病毒使用方法如Fuchs所述 等 14</li>
	<li>在无菌操作台中为每种条件准备一个1.5 ml塑料离心管，并加入400 μl预热的αMEM-minus培养基10%.</li>
	<li>将病毒分装样品置于冰上缓慢融化，必要时用病毒储存液稀释，以确保移液体积大于1 μl，从而减少移液误差。</li>
	<li>根据每种条件计算出的病毒量，加入至各含有400 μl αMEM-minus的1.5 ml塑料管中10% 用移液器轻轻混匀。立即将病毒原液放回 -80 °C 保存，以维持其活性。</li>
	<li>吸弃细胞培养基，轻轻将病毒混合液逐滴加入。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 在超净台中，每15分钟轻轻振荡培养板一次，持续1小时，使病毒充分覆盖细胞。使用少量培养基有助于病毒与细胞充分接触。</li>
	<li>孵育后，轻轻吹打加入1.6 ml αMEM-无血清培养基10% 向每块培养板中加入试剂，使总体积达到 2 ml，通过添加 2 mM 胸腺嘧啶核苷启动细胞同步化，并在 37 °C、5% CO₂ 条件下将细胞继续孵育 2 小时2.</li>
	<li>同时，按照CaPi转染法配制siRNA转染混合物（参见 图1）。如果无需siRNA，则用无菌水替代siRNA的用量，以进行对照实验 空转染.</li>
	<li>为每种条件计算200 μl混合液，每个重复共需400 μl。以下示例基于终浓度为50 nM的siRNA，需根据每种目标蛋白进行相应调整。在1.5 ml塑料离心管中，用移液器加入50 μl 1 M CaCl₂2 和11 μl 20 μM siRNA加入至139 μl无菌H2O，涡旋混匀。短暂离心后，小心逐滴加入200 μl HBS2x（280 mM NaCl，50 mM HEPES，1.5 mM Na2HPO4，pH 7.01–7.05。 
	注意：液滴越小，沉淀物也越小，从而获得更高的转染效率。使用 200 μl 移液器通过空气吹打轻轻混匀三次。</li>
	<li>将混合物在室温下孵育 30 分钟。逐滴缓慢加入 200 μl 转染混合物至每孔，并横向轻轻振荡。将培养板转移至 37 °C、5% CO₂ 培养箱中2 16 小时。</li>
	<li>第二天，用 2 ml 温热的 HEPES（6.7 mM KCl、150 mM NaCl、10 mM HEPES，pH 7.3）洗涤细胞两次，然后加入 2 ml αMEM-无血清培养基10%一次不要同时处理超过四块细胞培养板，因为温度变化会影响细胞周期的长度。</li>
	<li>在倒置荧光显微镜下以20-40倍（空气）放大倍数观察感染效率，并在荧光和透射光通道中每种条件下各采集三张代表性图像用于记录。7小时后，加入2 mM胸腺嘧啶脱氧核苷，于37 °C、5% CO₂条件下继续孵育16小时。2.</li>
	<li>次日，即siRNA转染和病毒感染后48小时，用2 ml温热的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞两次，随后在2 ml αMEM中孵育7小时10% 无酚红用于活细胞成像，含酚红用于蛋白质提取。</li>
	<li>转染后48小时收集各实验组细胞，制备蛋白提取物并进行Western blot分析，以检测基因敲低效率及内源性蛋白的表达水平15. 
	注意：使用针对目标蛋白的抗体以及适当的上样对照抗体。应通过上样不同递减量的对照细胞裂解液（转染对照siRNA）来确定敲低效率，以获得滴定曲线。即， 1，½，¼，⅛</li>
</ol>
4. 使用阳离子脂质转染试剂在HeLa细胞中进行腺病毒转导及通过siRNA转染实现内源蛋白敲低
注意：本文介绍的实验方案适用于无需细胞同步化和/或无法使用磷酸钙法进行siRNA转染的实验，例如为避免某些细胞系中出现不良的细胞毒性效应。本方案在腺病毒感染后包含细胞重铺板步骤，以确保获得适宜的细胞密度。我们仅测试过阳离子脂质转染试剂。
注意！ 操作病毒时需要采取特殊预防措施，并对所有接触过病毒的材料进行妥善处理。
<ol>
	<li>接种 1.75 × 10⁶ 个细胞5 每35 mm培养皿接种2.5 ml αMEM培养基中的细胞10% 并在37 °C、5% CO₂条件下孵育2额外准备与实验条件数量相同的35 mm培养皿，用于在病毒转导前计数细胞数量。</li>
	<li>培养细胞至次日，使细胞密度至少达到50%。细胞密度低于50%会导致病毒转导效率显著下降、单个细胞蛋白表达水平变异增加以及细胞毒性增强。</li>
	<li>细胞接种后一天，计数额外接种的培养皿中的细胞数量。吸除培养基，用1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA洗涤一次。再次加入1 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA，于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 直至所有细胞脱落，用1 ml移液器充分分散细胞，并计数每毫升的细胞数量。</li>
	<li>确定转导所需的病毒量，以达到每个细胞感染复数（MOI）为20-40个感兴趣蛋白（POI）的空斑形成单位（PFU），以及每个细胞0-20个PFU的空载体例如， LacZ)，使每个细胞的总空斑形成单位（PFU）达到40个。</li>
	<li>在无菌操作台中为每种条件准备一个1.5 ml塑料离心管，并加入400 μl预热的αMEM10%.</li>
	<li>将病毒分装样品置于冰上缓慢融化，必要时用病毒储存液稀释，以确保移液体积大于1 μl，从而减少移液误差。</li>
	<li>根据每种条件计算出的病毒量，加入至各含有 400 μl αMEM 的 1.5 ml 塑料管中10% 用移液器轻轻混匀。立即将病毒原液放回 -80 °C 保存，以维持其活性。</li>
	<li>吸弃细胞培养基，轻柔地将病毒混合液逐滴加入。将细胞置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 在生物安全柜中，每15分钟轻轻振荡培养板一次，共1小时，使病毒稀释液充分覆盖细胞。使用少量培养基有助于病毒与细胞充分接触。</li>
	<li>同时，按照转染方法准备siRNA转染混合物。若无需siRNA，则用等量无血清培养基替代siRNA以进行对照实验 空转染.
	<ol>
		<li>以下示例针对终浓度为 50 nM 的 siRNA，需根据每种目标蛋白进行相应调整。每次腺病毒感染时，准备一个 1.5 ml 塑料离心管，其中含有 150 µl 无血清培养基和终浓度为 416 nM 的 siRNA（例如，6.25 µl 20 µM siRNA + 144 µl 无血清培养基）和一个1.5 ml塑料管，内含6.25 µl阳离子脂质转染试剂 + 144 µl无血清培养基。</li>
		<li>用200 μl移液器反复吹打每个塑料管中的内容物数次以混匀。将两个管中的内容物合并，再用200 μl移液器反复吹打数次混匀。室温孵育5分钟。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>孵育病毒后，轻轻吹打重悬，加入1.8 ml αMEM10% 向每块培养板中加入适量液体，使总体积达到 2.2 ml，随后立即缓慢逐滴加入 siRNA 转染混合物至每块培养板中，并轻轻横向摇晃混匀。将培养板转移至 37 °C、5% CO₂ 培养箱中培养。2 24 小时</li>
	<li>第二天，将每个35 mm培养皿中的细胞重新接种到四个新的35 mm培养皿中，每皿加入2.5 ml αMEM10% 每个样品继续孵育，在37 °C、5% CO₂条件下再培养24小时2.</li>
	<li>次日，即siRNA转染和病毒感染后48小时，从每种条件下的一个培养板中收集细胞，用于制备蛋白提取物并进行Western blot分析，以检测基因敲低效率及内源性蛋白的表达水平15. 
	注意：使用剩余的培养板进行细胞固定，采用选定的固定方案，并用目标抗体对样本进行免疫荧光分析14.</li>
</ol>
5. 有丝分裂细胞的活细胞成像与数据分析
<ol>
	<li>使用配备加湿/5% CO2/温控培养室的倒置显微镜对有丝分裂细胞进行短期活细胞成像实验。 
	注：本研究中使用的是转盘共聚焦显微镜（40X，0.75 NA），配备在-50 °C下工作的EMCCD冷却电荷耦合相机。</li>
	<li>在开始采集前，确认培养室已达到37 °C的适宜温度。 
	注：根据显微系统不同，此过程可能需要数小时。</li>
	<li>在采集前1小时将培养皿放入显微镜培养室，以确保培养基充分平衡，避免因温度变化导致焦距漂移。监测细胞的有丝分裂状态。此时，应有10-15%的细胞处于有丝分裂早期（前期至前中期）。</li>
	<li>在平衡期间，根据前期实验结果设定采集参数。通常情况下，两个通道（488和594）的曝光时间设置为0.2-3秒，激光强度为100%，灵敏度为121-130，在本实验条件下效果良好。 
	注：应首先进行初步测试，以确定能够获得适当分辨率且光漂白最小、不会损伤细胞或干扰有丝分裂进程的最低激光强度和最适采集时间/间隔。</li>
	<li>每种条件下选择多个视野，以获得足够数量的待分析细胞，同时不超出采集时间间隔。使用转盘共聚焦系统时，典型的实验设置包括四种不同条件，每块培养板7个视野，两个荧光通道（488和594），在75分钟内以1.5-2分钟为间隔进行采集。</li>
	<li>选择处于有丝分裂起始阶段的细胞，在完成所有视野选择后重新调整焦距，并尽快开始图像采集。</li>
	<li>至少监测系统稳定性三个时间点，必要时重新调整焦距。</li>
	<li>完成首次75分钟的短期活细胞成像后，可重新选择新的有丝分裂细胞视野，进行第二轮电影序列采集，以增加可分析的细胞数量。</li>
	<li>根据所使用的荧光标记物，确定明确的分析标准，用于评估细胞的有丝分裂表型。有丝分裂异常可能包括有丝分裂持续时间延长（从核膜破裂至后期）、染色体排列紊乱、纺锤体摆动以及细胞皮层出泡14等现象。</li>
</ol>
6. LifeAct-TagGFP2 腺病毒在分化中的 C2C12 小鼠成肌细胞中的转导
注意：腺病毒感染转染方案也适用于难以感染的正在分化的小鼠 C2C12 成肌细胞。
<ol>
	<li>在35 mm培养皿中，以生长培养基将2 × 105个C2C12细胞接种于塑料表面或所选基质上。 
	注意：在明胶或Matrigel包被的培养皿中，细胞分化效果更佳。额外准备一皿用于在病毒转导前测定细胞数量。</li>
	<li>次日，细胞应达到约80%融合度。用预温的PBS洗涤细胞两次，加入2 ml分化培养基（DM），诱导成肌细胞分化。</li>
	<li>次日记为分化第1天（D1），用腺病毒LifeAct-TagGFP2转导肌细胞，以在活细胞中可视化肌动蛋白细胞骨架。按照3.2节所述方法，从额外培养皿中计数细胞数量。参照表1中的示例，计算每细胞5 PFU的LifeAct-TagGFP2腺病毒和每细胞45 PFU的AdLacZ，总病毒量为每细胞50 PFU。病毒使用方法如文献14所述。</li>
	<li>在无菌操作台中，为每种实验条件准备一个1.5 ml塑料离心管，并加入400 μl预温的DM。</li>
	<li>将病毒分装样品在冰上缓慢解冻，必要时用培养基稀释病毒原液，确保移液体积大于1 μl，以减少移液误差。</li>
	<li>根据各实验条件，将相应量的病毒颗粒加入含400 μl DM的1.5 ml塑料管中，用移液器轻柔混匀。立即将病毒原液放回-80 °C保存，以维持其活性。</li>
	<li>吸除培养皿中的培养基，轻柔地逐滴加入病毒混合液。将细胞置于37 °C、5% CO2条件下孵育，并在无菌操作台中每15分钟轻轻摇动培养皿一次，持续1小时，确保病毒均匀覆盖细胞。</li>
	<li>孵育结束后，轻柔地向每皿加入1.6 ml DM，继续在37 °C、5% CO2条件下孵育2小时。</li>
	<li>同时，按照CaPi转染法配制空白转染混合液。每种实验条件配制200 μl混合液。以下示例为总体积400 μl的混合液配制方法：
	<ol>
		<li>在1.5 ml塑料离心管中，加入50 μl 1 M CaCl2至150 μl无菌H2O中，涡旋混匀。短暂离心后，逐滴缓慢加入200 μl HBS2x（280 mM NaCl，50 mM HEPES，1.5 mM Na2HPO4，pH 7.01–7.05）。使用200 μl移液器通过空气吹打轻轻混合三次。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>室温孵育混合液30分钟。将200 μl转染混合液缓慢逐滴加入每皿中，并横向轻轻摇动混匀。将培养皿转移至37 °C、5% CO2条件下继续孵育16小时。</li>
	<li>次日，用2 ml预温的HEPES缓冲液（6.7 mM KCl，150 mM NaCl，10 mM HEPES，pH 7.3）洗涤细胞两次，加入2 ml DM。在倒置荧光显微镜下以20–40倍（空气物镜）放大观察感染效率，并为每种实验条件在荧光和透射光通道下各采集三张代表性图像用于记录。</li>
	<li>根据实验设计需求，继续培养数天以观察向肌管细胞的分化过程。细胞可进行固定后免疫荧光分析，或直接用于活细胞成像研究。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本文介绍了一种可用于进行耗竭-挽救实验的方法，适用于对蛋白质过表达敏感的细胞生物学过程的功能分析，特别是那些影响蛋白质复合物和大分子结构化学计量比及动态特性的过程。有丝分裂是细胞形态动力学精细调控的典型例子，涉及细胞整体结构最显著且最引人注目的变化。通过联合使用腺病毒感染（adenofection）和 commercially available BacMam 试剂，以较低但可检测的水平引入肌动蛋白（actin）和微管蛋白（tubulin）标记物用于细胞成像，可清晰地揭示分子伴侣复合物 BAG3-HSPB8 在正常有丝分裂细胞重塑中的作用。在 Fuchs et al. 最近的一项研究中，我们已证明 BAG3 的耗竭会导致纺锤体定向缺陷，这与无法形成稳定的有丝分裂期肌动蛋白皮层以及富含肌动蛋白的回缩纤维的组装障碍有关14。通过重新表达野生型 BAG3-GFP，可恢复正常的纺锤体动态，并同时纠正因 BAG3 沉默而导致的 HSPB8 水平下降。这表明，腺病毒感染能够恢复生理相关性的分子伴侣复合物，且该复合物的恢复与纺锤体动态功能的恢复相一致。
使...

在哺乳动物细胞中实现基因表达的功能性失活是解析蛋白质功能的金标准。基于位点特异性核酸酶（如锌指核酸酶以及成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CAS9）的新兴基因组编辑技术，现已能够实现靶向基因缺失和突变的细胞系构建1,2。这些新技术将彻底改变我们研究蛋白质功能的方式，并加深对人类疾病遗传机制的理解。然而在某些情况下，长期或完全的基因敲除并不理想，可能引发细胞的继发性代偿机制。当涉及增殖能力有限的原代细胞培养物，或需要在多种细胞类型中筛选大量突变时，构建基因修饰细胞系的方法也可能受到限制。这在确定细胞生物学过程对蛋白质结构需求的依赖性时尤为常见。为此，通过RNA干扰实现可逆性基因敲低，从而在不同细胞背景下进行瞬时耗竭-挽救实验，仍然是开展目标蛋白结构-功能分析的一种简单而强大的方法3。然而，该方法的主要局限在于难以在大部分细胞群体中高效实现基因沉默，并将目标蛋白或其变体以接近生理水平重新表达。这一点至关重要，有助于全面开展研究，将单细胞水平上观察到的功能效应（低效表型）与基于细胞群体的检测结果（例如蛋白质-蛋白质相互作用）进行关联分析。
使用经典的转染方法，几乎无法在大量细胞群体中实现外源蛋白的均一且低水平表达。通过重组病毒（如腺病毒）转导细胞通常能够实现更为均一的外源蛋白表达。然而，腺病毒的摄取依赖于CAR受体，而该受体在非人源细胞中缺失，或仅在某些人源细胞类型中弱表达。此外，腺病毒进入细胞会激活调控细胞形态和黏附的信号通路4-6。这在研究细胞形态动力学的调控机制时显然是不可取的。我们在对分子伴侣复合物BAG3-HSPB8在细胞分裂和肌动蛋白动态中的功能进行分析时，就遇到了这一难题。已有先驱性研究描述了该伴侣复合物在应激条件下参与蛋白质质量控制和自噬的作用7,8。然而，这些研究大多依赖于蛋白过表达，其前提是伴侣蛋白在应激状态下通常会上调。这使得一个问题仍未解决：BAG3与HSPB8形成的复合物是否在正常分裂的细胞中发挥作用——这些细胞像许多癌细胞类型一样，本底表达这些伴侣蛋白9。特别是考虑到HSPB家族伴侣蛋白与细胞骨架动态之间日益明确的关联10，该伴侣复合物是否参与调控控制有丝分裂进程的肌动蛋白结构重塑，成为我们关注的重点。为解决这一问题，我们希望开发一种高效的基因敲低-回补实验方法，该方法不应干扰有丝分裂进程或细胞形态，并能维持蛋白质稳态，以避免对调控细胞形态变化的大分子复合物动态造成继发性干扰。因此，理想情况下，目标基因的敲低与回补应同时进行。
使用腺病毒与阳离子聚合物或脂质形成的复合物已被报道可促进基因转导 体外 和 体内11,12例如，磷酸钙（CaPi）似乎会与腺病毒形成沉淀，通过非CAR依赖性途径增强病毒的结合与进入13事实上，我们发现将基于腺病毒的细胞转导与阳离子化合物转染相结合，可提高耗竭-挽救实验的效率。这使得我们能够根据细胞系和目标基因的不同，将病毒使用量减少3至20倍，并获得更宽的调控窗口，从而在大多数目标细胞群体中将外源蛋白的表达水平调节至接近内源水平，同时对细胞形态的影响降至最低。在此条件下，我们还能实现内源蛋白表达的高效敲低（&#62;75%）。本文逐步描述了该方法，并提供证据表明，通过检测热休克蛋白家族应激诱导的分子伴侣水平未发生显著变化，蛋白质稳态未受到明显干扰，因此该方法适用于功能分析 生理功能 通过延时视频显微镜观察分子伴侣的行为。该方案可与细胞同步化程序兼容，并可利用市售的杆状病毒共同表达低水平的荧光标记物，从而在有丝分裂进程中对正常的肌动蛋白和纺锤体动态产生最小干扰。我们进一步展示了该方法的多功能性，其适用于 &#34;难以转导&#34; 小鼠C2C12细胞，对成肌细胞向肌管的分化无显著影响 体外.

<table><tbody><tr><td>C2C12 小鼠成肌细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>腺病毒定制设计</td><td>Welgen</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&amp;reg; 肌动蛋白-GFP，BacMam 2.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10582</td><td></td></tr><tr><td>CellLight&amp;reg; Tubulin-RFP，BacMam 2.0</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>C10614</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良的 Eagle&amp;rsquo;高糖DMEM培养基</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清（FBS）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>纤连蛋白</td><td>Sigma</td><td>F1141</td><td></td></tr><tr><td>35 mm 玻璃底培养皿</td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-1.5-20-C 型外壳</td><td></td></tr><tr><td>HeLa-RFP-H2B</td><td>萨宾·艾洛博士惠赠，Qu&amp;eacute;bec，加拿大</td><td></td><td>Klebig C &lt;em&gt;等&lt;/em&gt; 2009</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310-1</td><td></td></tr><tr><td>新西兰马血清</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>L-谷氨酰胺</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine&amp;reg; RNAiMAX 转染试剂</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>13778-150</td><td></td></tr><tr><td>α-最低必需培养基（MEM）</td><td>Wisent</td><td>310-101-CL</td><td></td></tr><tr><td>不含脱氧核糖核苷/核糖核苷的α最低必需培养基（MEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>12000-022</td><td></td></tr><tr><td>不含酚红的α最低必需培养基（MEM）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>41061-029</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>生物基础</td><td>S0404</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-10</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>rAV&lt;sup&gt;巨细胞病毒&lt;/sup&gt;-LifeAct-TagGFP2</td><td>IBIDI</td><td>60121</td><td></td></tr><tr><td>siRNA 双链</td><td>Dharmacon</td><td>定制设计</td><td></td></tr><tr><td>胸腺嘧啶脱氧核苷</td><td>Sigma</td><td>T9250</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶 2.5%</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15090-046</td><td></td></tr></tbody></table>

腺病毒转染：通过耗竭-拯救实验研究分子伴侣在细胞形态动力学中作用的方法

Adenofection: A Method for Studying the Role of Molecular Chaperones in Cellular Morphodynamics by Depletion-Rescue Experiments

细胞分裂和细胞分化等细胞过程受细胞形态变化的调控，而这些形态变化在很大程度上依赖于细胞骨架结构的正确重塑。这一过程涉及在特定时间和位置组装和解聚高级大分子结构，对由蛋白质过表达引起的扰动尤为敏感。因此，迫切需要能够维持蛋白质稳态并保持接近正常细胞形态的方法，以确定目标蛋白质在多种细胞过程中所发挥的功能作用。基于RNA干扰的瞬时蛋白耗竭-挽救实验是分析蛋白质功能及其结构需求的有力手段。然而，将目标蛋白以最接近其生理水平的方式重新引入细胞，仍是一个实际挑战。本文介绍了一种称为腺转染（adenofection）的方法，该方法最初用于研究分子伴侣及其相互作用蛋白在分裂细胞正常功能中的作用，以及其与肌动蛋白重塑的关系。通过靶向3'非翻译区（3'UTR）的siRNA双链体，将HeLa细胞中的BAG3蛋白耗竭；同时利用重组腺病毒与转染试剂联合，将GFP标记的BAG3蛋白重新导入&#62;75%的细胞中。腺转染能够在BAG3耗竭的HeLa细胞中以接近生理水平表达BAG3-GFP蛋白，且不引发应激反应。内源性热休克蛋白伴侣分子（蛋白稳态的主要应激诱导调控因子）的表达水平未受影响。此外，通过在细胞转导-转染时加入驱动荧光标记物表达的杆状病毒，我们能够以最小干扰正常有丝分裂进程的方式，通过延时显微成像分析有丝分裂细胞的动态过程。腺转染方法同样适用于难以感染的小鼠细胞，并可用于成肌细胞向肌管分化过程中的功能分析。因此，腺转染为研究参与依赖高级细胞骨架动态的敏感生物学过程的蛋白质结构与功能提供了多功能的技术手段。

使用阳离子脂质转染 BAG3-GFP 质粒 DNA 在 HeLa 细胞中表现出异质性表达，部分细胞中该蛋白的表达水平几乎无法检测，而另一些细胞则含有非常高水平的 BAG3（图 2A）。在这些细胞中，蛋白质稳态失衡表现为 BAG3-GFP 在核周区域聚集形成聚集体（图 2A，箭头所示）。相比之下，使用携带 BAG3-GFP 的腺病毒感染细胞，则表现出更均一的低水平表达以及准确的 BAG3-GFP 定位（图 2B，仅感染）。值得注意的是，在腺病毒感染过程中加入阳离子脂质（即，腺病毒颗粒的转染），可在相似的感染复数（MOI）下显著提高每个细胞中 BAG3-GFP 的表达水平，同时在大多数细胞中维持表达的均一性（图 2B，腺转染）。
腺病毒感染法可高效敲低内源性BAG3，并在接近内源性水平下重新引入BAG3-...

我们介绍一种可保持细胞完整性和蛋白质稳态的耗竭-挽救实验方法。腺病毒转染技术能够在单细胞水平上，对依赖精细调控的肌动蛋白动态的生物学过程（如有丝分裂和肌细胞生成）中的蛋白质进行功能分析。

细胞分裂和细胞分化等细胞过程受细胞形态变化的调控，这些变化主要依赖于细胞骨架的正确重塑……

该方法的总体目标是能够在保持细胞完整性和蛋白质稳态的条件下进行耗竭-挽救实验，从而在单细胞水平上对生物过程进行功能分析。该方法有助于解答有关蛋白质功能及其在细胞动态过程（如有丝分裂和细胞分化）中结构需求的关键问题。该技术的主要优势在于，能够在大部分细胞群体中，将近生理水平的目标蛋白质去除的同时，重新引入该蛋白质的变异体。首先用纤维连接蛋白包被玻璃底培养皿。具体操作为：用无菌 PBS 将浓度为 1 毫克/毫升的纤维连接蛋白储备液按 1:100 比例稀释。向每个35毫升培养皿中加入1毫升溶液，以覆盖整个表面。在37摄氏度和5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育期间，将添加了10%胎牛血清的α-MEM培养基和0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液预热至37摄氏度。孵育45分钟后，开始准备细胞悬液。从一个10厘米的HeLa-RFP-H2B细胞培养皿中吸除培养基，并用1.5毫升0.05%胰蛋白酶EDTA轻轻冲洗两次。最后一次吸液后，在培养板中留下 0.5 毫升胰蛋白酶 EDTA，于 37 摄氏度和 5% 二氧化碳条件下孵育细胞 2 至 3 分钟。轻轻敲击培养板，在显微镜下观察细胞层，以确认所有细胞均已脱落。然后加入 10 毫升培养基，轻轻吹打数次以分离细胞，并将细胞悬液转移至 15 毫升离心管中。使用血细胞计数板对10微升细胞悬液样本进行计数。接着，从玻璃底培养皿中吸除纤连蛋白溶液。在接种细胞前，切勿让纤连蛋白干燥。制备细胞悬液，每2毫升培养基中接种1.5 × 10⁵个细胞至35毫米培养皿中。根据实验条件数量，额外多接种一个35毫米培养皿，用于病毒转导前的细胞计数。在培养箱中孵育30至45分钟。孵育结束后，在显微镜下观察细胞，确保细胞分布均匀，如图所示。随后将培养皿放回培养箱，继续培养至次日。接种后的第二天，确保细胞密度至少达到50%。细胞密度低于50%会导致病毒转导效率降低、单个细胞的蛋白表达差异增大以及细胞毒性增加。随后，按照之前的方法从额外接种的培养皿中收集细胞并计数。计算实现高效转导所需的病毒体积。为每种实验条件标记一个1.5毫升微量离心管，并向每管中加入400微升预热的不含血清的α-MEM培养基。将病毒分装液在冰上缓慢解冻后，将所需体积的每种病毒加入对应管中，并用移液器轻轻吹打混匀。接着，吸除细胞培养皿中的培养基，然后逐滴加入病毒混合液。将细胞置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育。在1小时的时间内，每隔15分钟，在无菌操作台内轻轻摇动培养板，使病毒均匀覆盖细胞。使用少量培养基有助于病毒与细胞充分接触。孵育后，轻轻吸取 1.6 毫升不含添加剂的 α-MEM 培养基加入每孔板中，使总体积达到 2 毫升。随后加入 2 毫摩尔的胸腺嘧啶核苷以启动细胞同步化，再将细胞继续孵育 2 小时。同时，在微量离心管中加入 139 微升无菌水、50 微升 1 摩尔氯化钙和 11 微升 20 微摩尔 siRNA，配制 siRNA 转染混合液。若无需 siRNA，可用无菌水替代 siRNA 的体积，以进行空载转染。将 2× HBSS 溶液逐滴缓慢加入氯化钙-siRNA 混合物中。使用 200 微升移液器通过空气吹打轻轻混匀两次，较小的沉淀物有助于提高转染效率。随后在室温下孵育该混合物 30 分钟。孵育结束后，将 200 微升混合液缓慢逐滴加入每孔中，并轻轻振荡混匀。将培养板置于 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下孵育 16 小时。第二天，从培养箱中取出培养皿，转移至组织培养操作台。用两毫升预热的 HEPES 缓冲液冲洗细胞两次后，加入两毫升不含 HEPES 的 α-MEM 培养基，然后放回培养箱中继续培养。7 小时后，在培养板中加入 2 毫摩尔的胸腺嘧啶核苷，然后将培养板放回培养箱。每次操作最多处理四块细胞培养板，因为温度变化会影响细胞周期的长度。第二天，即 siRNA 转染和病毒感染 48 小时后，用 2 毫升预热的 PBS 洗涤细胞两次，然后加入 2 毫升不含酚红的 α-MEM 培养基用于活细胞成像。继续培养 7 小时。 使用配备有加湿、5%二氧化碳、温控培养室的倒置显微镜，对有丝分裂细胞进行短期活细胞成像实验。在开始采集图像前，需确认培养室温度已达到适宜的37摄氏度。在采集图像前一小时，将培养皿放入显微镜载物台腔室，以使培养基充分平衡，并避免因温度变化导致的焦距漂移。检查细胞的有丝分裂状态。此时，应有10%至15%的细胞处于有丝分裂的早期阶段。在平衡时间内，根据先前实验确定的条件设置采集参数。需在避免光漂白的前提下获得适当的分辨率，因为光漂白会导致细胞损伤并干扰有丝分裂进程。每种条件下选择多个含有处于有丝分裂起始阶段细胞的视野，以获得足够数量的待分析细胞，同时不超出采集时间间隔。选定所有视野后，重新调整焦距，并尽快开始图像采集。使用转盘共聚焦系统时，典型的实验设置应包括四种不同条件，每孔七个工作区域，两个荧光通道，在75分钟内以1.5至2分钟的时间间隔进行成像。应确定明确的分析标准，用于评估细胞有丝分裂表型，具体标准取决于所使用的荧光标记物。 与转染BAG3-GFP质粒DNA（如左图所示）相比，使用此处所示的重组腺病毒进行腺转染（adenofection），可在较低感染复数下使细胞群体中大多数细胞实现更均一且高效的BAG3-GFP表达。该代表性Western印迹结果显示，通过使用靶向BAG3的特异性siRNA和重组腺病毒BAG3-GFP进行腺转染，可有效耗尽内源性BAG3蛋白，并将近似内源性水平的BAG3-GFP蛋白重新引入细胞。如图所示，腺转染能够维持蛋白质稳态，因为在接受腺转染的HeLa细胞中，应激诱导的热休克蛋白水平未见明显升高；而相比之下，经蛋白毒性应激诱导剂MG132处理的HeLa细胞则表现出明显升高。此处可见，腺转染对细胞有丝分裂进程无显著干扰，这一点由经对照siRNA以及BacMam-GFP标记的α-微管蛋白和BacMam-RFP标记的肌动蛋白腺转染的HeLa细胞的共聚焦延时成像结果所证实。该图显示了发生异常有丝分裂的细胞比例。仅转染BAG3特异性siRNA的细胞，其有丝分裂缺陷水平显著升高，约为对照组的两倍，如红色柱所示；而重新引入BAG3-GFP后，缺陷水平恢复至接近对照细胞水平，如黑色柱所示。观看本视频后，您应能充分理解如何利用腺病毒转染技术进行耗竭-挽救实验。该方法提供了一种快速且简便的系统，可在多种细胞背景下构建功能部分缺失的基因敲低模型，用于结构与功能分析。通过该方法，可确定目标蛋白在特定功能中所需的关键结构域。随后可结合其他基因组编辑技术，进一步深入探究其作用机制。

adenofection-method-for-studying-role-molecular-chaperones-cellular

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科研

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生物学

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腺病毒转染：通过耗竭-拯救实验研究分子伴侣在细胞形态动力学中作用的方法

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