Adenofection:用于研究分子伴侣在细胞地貌被耗尽，救援实验中的角色方法
2016年9月16日
我们描述了一种保持细胞完整性和蛋白质稳态的耗竭-拯救实验方法。腺染性能够在单细胞水平上对生物过程中的蛋白质进行功能分析，这些生物过程依赖于微调的基于肌动蛋白的动力学，例如有丝分裂细胞分裂和肌发生。
该方法的总体目标是使耗竭拯救实验能够在保持细胞完整性和蛋白质稳态的条件下进行。用于单细胞水平生物过程的功能分析。该方法可以帮助回答有关细胞动力学中蛋白质功能和结构要求的关键问题，例如有丝分裂和细胞分化。
该技术的主要优点是耗尽感兴趣的蛋白质，并同时在细胞群的测量中以新生理水平重新引入该蛋白质的变体。首先用 fribronectin 涂布玻璃底培养皿。为此，用无菌 PBS 稀释 1 毫克/毫升的支连蛋白原液 1 至 100。
向每个 35 毫升培养皿中加入 1 毫升以覆盖整个表面。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育 1 小时。在孵育过程中，预热补充 10% FBS 和 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 的等分试样的 α MEM 至 37 摄氏度。
孵育 45 分钟后，开始制备细胞溶液。从 10 cm 的 HeLa RFP H2B 细胞板中吸出培养基。并用 1.5 毫升 0.05% 胰蛋白酶 EDTA 轻轻冲洗两次。
最后一次抽吸后，将 0.5 毫升胰蛋白酶 EDTA 留在板上。并将细胞在 37 摄氏度下孵育 2 到 3 分钟。和 5% 的二氧化碳。
轻轻敲击板。并在显微镜下观察细胞层，以验证所有细胞是否已分离。然后加入 10 毫升培养基并轻轻移液数次以分离细胞并将细胞悬液转移到 15 毫升试管中。
使用血细胞计数器对 10 μL 细胞悬液样品进行计数。接下来，从玻璃底培养皿中吸出纤连蛋白溶液。细胞铺板前不要让纤连蛋白干燥。
制备细胞悬液，将每 35 毫米培养皿中的 1.5 倍 10 至第五个细胞接种在 2 毫升培养基中。除了条件数量外，还接种一个 35 毫米的板，以便在病毒转导之前对细胞数进行计数。孵育 30 至 45 分钟。
孵育时间过后，在显微镜下检查细胞以确保细胞分离良好。如图所示。将板放回培养箱中，让细胞生长至第二天。
铺板后第二天，确保细胞密度至少达到 50%A 细胞密度低于 50%会导致病毒转导效率降低。每个细胞的蛋白质表达变化增加，细胞毒性增加。然后像以前一样从额外的电镀皿中收获细胞。
并计算单元格的数量。计算细胞有效转导所需的病毒体积。为每种情况标记 1.5 mL 微量离心管。
并添加 400 微升温热的 alpha MEM 减号。在冰上缓慢解冻病毒等分试样后，将所需体积的每种病毒加入试管中，并通过移液轻轻混合。接下来，从细胞中吸出培养基后，轻轻滴加病毒混合物。
将细胞在 37 摄氏度下与 5% 二氧化碳一起孵育。每 15 分钟一次，持续 1 小时，在无菌罩下小心搅拌板，使细胞充满病毒。使用少量培养基有助于病毒与细胞接触。
孵育后，轻轻吸取 1.6 毫升 alpha MEM minus 到每个板中，以获得 2 毫升的总体积。然后通过添加 2 毫摩尔胸苷开始细胞同步，然后再孵育细胞 2 小时。同时，通过在微管中加入 139 μL 无菌水、50 μL 1 摩尔氯化钙和 11 μL 20 μml siRNA 来制备 siRNA 转染混合物。
如果不需要 siRNA，则用无菌水替换 siRNA 量以进行空转染。将 HBSS2X 溶液缓慢滴加到氯化钙 siRNA 混合物中。使用 200 微升移液管通过空气注射轻轻混合两次。
因为沉淀物越小，转染效率越高。然后将混合物在室温下孵育 30 分钟。孵育后，向每个板中缓慢滴加 200 μL 并搅拌混合。
将板在 37 摄氏度、5% 二氧化碳下孵育 16 小时。第二天，从培养箱中取出培养皿并将它们运输到组织培养罩中。用 2 毫升温热的 hipis 冲洗细胞两次后，加入 2 ml α MEM minus，然后放回培养箱中。
7 小时后，在板中加入 2 毫摩尔胸苷，然后将其放回培养箱中。一次使用不超过四个细胞板，因为温度变化会影响细胞周期的长度。第二天，即 siRNA 转染和病毒感染后 48 小时，用 2 mL 温热的 PBS 冲洗细胞两次，然后加入 2 mL 不含酚红的 alpha MEM，用于活细胞成像。
孵育 7 小时。使用配备有湿化 5% 二氧化碳温度调节室的倒置显微镜对有丝分裂细胞进行短期活细胞成像实验。在采集之前，请验证暗室是否已达到 37 摄氏度的适当温度。
采集前一小时将培养皿放入显微镜室中，以实现培养基的适当平衡并避免由于温度变化而导致焦点漂移。检查细胞的有丝分裂状态。在这一点上。
10% 到 15% 的细胞应该处于有丝分裂的早期阶段。在平衡时间内，按照先前实验中确定的采集参数进行设置。在不漂白照片的情况下获得适当的分辨率很重要。
因为这会导致细胞损伤并扰乱有丝分裂进程。根据每个条件选择几个包含处于有丝分裂入口的细胞的字段，以获得大量要分析的细胞，而不会超过采集间隔。选择所有字段后，重置焦点并尽快开始采集。
使用旋转的圆盘可以聚焦系统。典型的设置将包括 4 种不同的条件。每个板有 7 个区域。
以及两个颜色通道，在 75 分钟内间隔为 1.5 到 2 分钟。确定定义明确的标准来分析细胞中的有丝分裂表型，这将取决于所使用的荧光标记物。与转染 BAG3 GFP、质 DNA（如左图所示）相比，用右图所示的有能力的腺病毒进行腺染能够实现 BAG3 GFP 的更均匀和高效表达。
在大多数细胞群中，感染复数较低。该代表性蛋白质印迹表明，用 BAG3 特异性 siRNA 和再强性腺病毒 BAG3 GFP 进行腺染可以有效去除内源性 BAG3 并在接近内源水平重新引入 BAG3 GFP 蛋白。如此处所示，腺fection 可以保持蛋白质稳态，因为在腺感染的 HeLa 细胞中，应激诱导的热休克蛋白水平没有可检测到的增加。
与用蛋白毒性应激诱导剂 MG132 处理的 HeLa 细胞相反。在这里，我们看到细胞通过有丝分裂的进程不会受到腺fection的显著干扰，如这些来自用对照 siRNA 和 BacMam GFP α 微管蛋白腺染的 HeLa 细胞的同聚焦延时图像所示。和 BacMam FRP 肌动蛋白。
该图显示了有丝分裂异常的细胞比例。单独用 BAG3 特异性 siRNA 腺染的细胞的有丝分裂缺陷水平大约增加了两倍。如红色条所示。
通过重新引入黑条所示的 BAG3 GFP 将其恢复到接近对照细胞水平。观看此视频后，您应该对如何使用腺苷转染进行耗尽挽救实验有很好的了解。该方法提供了一种快速简单的系统来创建亚型敲低，用于在多个细胞背景中的结构功能分析。
按照这种方法，可以确定给定功能的目标蛋白质的关键结构要求。然后可以使用其他基因组编辑方法来深化所涉及的机制。
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概览
本文介绍了一种能够在保持细胞完整性和蛋白质稳态的情况下进行耗尽-恢复实验的方法。该技术允许在单细胞水平上对参与关键生物过程（如有丝分裂和肌肉生成）的蛋白质进行功能分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 细胞生物学
- 蛋白质动力学
- 细胞完整性
背景
- 耗尽-恢复实验对于研究蛋白质功能至关重要。
- 保持细胞完整性对于获得准确的结果至关重要。
- 基于肌动蛋白的动力学在细胞分裂和分化中起着重要作用。
- 该方法允许在生理水平下重新引入蛋白质变体。
研究目的
- 在保持细胞完整性的条件下进行耗尽-恢复实验。
- 分析蛋白质功能和细胞动力学中的结构要求。
- 在单细胞水平上研究生物过程。
使用的方法
- 用纤连蛋白涂覆玻璃底皿。
- 用无菌PBS稀释纤连蛋白原液。
- 耗尽感兴趣的蛋白质，同时重新引入变体。
- 测量对细胞群体的影响。
主要结果
- 该方法在实验过程中成功地保持了细胞完整性。
- 功能分析揭示了对蛋白质动力学的洞见。
- 针对蛋白质功能的关键问题得到了解决。
- 单细胞水平的分析为细胞过程提供了详细的理解。
结论
- 这种方法在研究活细胞中的蛋白质功能方面具有优势。
- 它允许对蛋白质水平进行精确操作。
- 该技术可以增强我们对关键生物过程的理解。
常见问题
Executive Industry Relevance
Adenofection enables depletion-rescue experiments that preserve cellular integrity and protein homeostasis, addressing a key challenge in studying proteins involved in cytoskeletal dynamics. By achieving near-physiological protein reintroduction without triggering stress responses, the method supports reliable functional analysis in discovery settings. This approach enhances predictive confidence in target validation for processes like mitosis and differentiation, where morphological readouts are critical.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of protein function and structural requirements in mitosis and cell differentiation through controlled depletion and rescue.
- Operational Value: Achieves homogeneous protein expression in >75% of cells at near-endogenous levels, reducing variability in phenotypic readouts.
- Strategic Value: Supports target de-risking by linking molecular chaperones like BAG3 to cytoskeletal remodeling without confounding stress responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Facilitates live-cell imaging of mitotic dynamics with fluorescent markers, enabling quantitative assessment of division phenotypes.
- Operational Value: Compatible with hard-to-infect mouse cells and myoblast differentiation models, broadening assay applicability across systems.
- Strategic Value: Provides a reusable platform for structure-function analysis of cytoskeletal regulators in phenotypic screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Maintains near-normal mitotic progression, ensuring that observed phenotypes reflect target-specific effects rather than experimental artifacts.
- Operational Value: Preserves endogenous Heat Shock Protein levels, indicating minimal disruption to protein homeostasis networks.
- Strategic Value: Enables mechanistic de-risking of targets involved in actin-dependent processes prior to preclinical investment.
Pipeline & Workflow Integration
Adenofection fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead optimization, particularly for targets where cellular morphology and dynamics are functional readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by enabling precise modulation of chaperone proteins in dividing cells.
- Screening: Generates reproducible, quantitative outputs via time-lapse microscopy of mitotic defects and rescue.
- Analytics: Delivers measurable phenotypic readouts (e.g., proportion of abnormal mitoses) to compare conditions and assess target impact.
- Translational Research: Bridges functional validation in mitotic cells to preclinical models like myoblast differentiation, supporting continuity of evidence.
- Enterprise Reuse: Establishes a adaptable method for studying any protein of interest in sensitive, morphology-dependent processes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by isolating target-specific effects on cytoskeletal dynamics through depletion-rescue design.
- Operational Value: Standardizes protein expression levels across cell populations, improving assay consistency and reducing noise.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision confidence by providing physiologically relevant functional data early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated roles in critical cellular processes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in viral transduction, siRNA transfection, and live-cell imaging.
- Needs access to recombinant adenovirus production and fluorescence microscopy systems.
- Demands standardization of transduction timing and siRNA dosing across experimental conditions.
- Involves optimization for different cell types, particularly primary or hard-to-transfect lines.
- Limited by the need for compatible fluorescent tags and multiplicity of infection tuning to avoid overexpression artifacts.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:49
Plating HeLa-RFP-H2B Cells
3:38
Adenovirus Transduction and Endogenous Protein Knockdown by siRNA Transfection in HeLa-RFP-H2B Cells Using CaPi Precipitates
7:46
Live Cell Imaging of Mitotic Cells and Data Analysis
9:36
Results: Adenofection Effectively Introduces Proteins of Interest without Affecting Mitosis
11:44
Conclusion
