Name: 吞噬体偏移和速度与HIV-1感染的活小学的人巨噬细胞测量 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学习使用转盘式共聚焦荧光显微镜和手动追踪技术，在HIV-1感染的人单核细胞来源巨噬细胞中定量测量吞噬体向细胞中心移动的速度。该方法为研究病毒感染期间的细胞免疫反应提供了重要工具。

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感谢 Jamil Jubrail 博士审阅本文手稿。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）、法国国家健康与医学研究院（Inserm）、巴黎笛卡尔大学、法国国家科研署（Agence Nationale de la Recherche，项目编号：2011 BSV3 025 02）、法国医学研究基金会（Fondation pour la Recherche Médicale，FRM DEQ20130326518，包括对 GLB 的博士奖学金资助）以及法国艾滋病与病毒性肝炎研究署（Agence Nationale de Recherche sur le SIDA et les hépatites virales，ANRS，包括对 CD 的博士后奖学金资助）向 FN 提供的资助。A. Dumas 获得了巴黎笛卡尔大学和 Sidaction 提供的博士奖学金支持。

该方案必须严格依照国家和国际法律法规以及当地规定执行。用于实验的健康献血者血液来自与各机构签署协议的血液中心，且献血者已知情同意将其血液用于科研目的。使用人血时必须采取特殊防护措施。根据当地法规，HIV-1相关实验必须在生物安全三级或二级（BSL-3 或 2）实验室中进行。
1. 通过密度梯度离心及贴壁筛选法准备人单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMs）
<ol>
	<li>从健康供体采集新鲜血液（9 ml），将全部体积的新鲜血液用无钙的无菌1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释2+ 和 Mg2+ 以获得终体积70 ml，将稀释后的血液轻柔加入两个50 ml锥形管中（每管35 ml），每管内已预先加入15 ml中性、高度支化、高分子量、亲水性多糖溶液。</li>
	<li>将两管血液在537 × g下离心20分钟，温度为 20 °C 不刹车。然后收集位于界面处浑浊细胞环中的外周血单个核细胞（PBMCs），并将其转移至含有15 ml不含Ca²⁺的1x PBS的新50 ml离心管中2+ 和 Mg2+.</li>
	<li>以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C 并将沉淀重悬于45 ml不含Ca的1x PBS中2+ 和 Mg2+.</li>
	<li>以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C，将沉淀重悬于10 ml不含Ca的1x PBS中2+ 和 Mg2+，用台盼蓝稀释至最终稀释比例为1/200后计数细胞。</li>
	<li>以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C 将沉淀重悬于添加了2 mM L-谷氨酰胺的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培养基中，并 100 µg/ml 青霉素-链霉素，使浓度达到 7 x 106 每孔加入2 ml培养基，每孔含PBMCs若干。</li>
	<li>将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 孵育2小时。2小时后，单核细胞将已贴附于塑料表面。</li>
	<li>为使 freshly-isolated 单核细胞分化为 hMDMs，吸除培养基，加入 2 ml hMDM 培养基（RPMI 1640，10% 去补体胎牛血清（FCS），2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素），并添加重组人巨噬细胞集落刺激因子（rhM-CSF），使其终浓度为 10 ng/ml。</li>
	<li>将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 11天图1).</li>
	<li>第11天，移除培养基，每孔用2 ml冷hMDM培养基洗涤2次。随后每孔用1 ml冷1×PBS洗涤2次。</li>
	<li>为使完全分化的hMDMs脱落，用1 ml含2 mM乙二胺四乙酸（EDTA）的冷1×PBS洗涤每孔1次，并在每孔中加入2 ml含2 mM EDTA的冷1×PBS，于15–60分钟内孵育 4 °C. 
	注意：存在其他用于解离细胞的方法（例如， 胰蛋白酶或类胰蛋白酶活性，这些活性可能产生良好的结果 11.</li>
	<li>消化完成后（通过在孔中轻轻吹打使细胞脱落），收集细胞并置于冰上含有10 ml冷hMDM培养基的50 ml离心管中。</li>
	<li>以 218 x g 离心 5 分钟，温度设为 20 °C，将沉淀重悬于10 ml冷hMDM培养基中，用台盼蓝按1/20稀释后计数细胞。</li>
	<li>以 1 x 106 每35 mm玻璃底培养皿中加入hMDMs，并将培养板置于培养箱中孵育 37 °C 含5% CO2 1天。</li>
</ol>
2. HIV-1 病毒储备液的制备与定量
注意：使用携带R5嗜性包膜的NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP（绿色荧光蛋白），该质粒由M. Schindler惠赠10，用于感染巨噬细胞并实时观察感染细胞。
<ol>
	<li>使用商品化转染试剂，将相应前病毒DNA（6 µg）转染人胚胎肾293T细胞（100 mm培养皿中接种2 × 106个），制备病毒原液。</li>
	<li>采用指示细胞HeLa TZM-bl（携带由HIV-1 LTR调控的ß-半乳糖苷酶基因）对病毒原液的感染性进行定量：对病毒原液进行系列稀释，作用于指示细胞后进行ß-半乳糖苷酶染色，计数显色的蓝色细胞12。</li>
</ol>
3. 用HIV-1感染hMDM
<ol>
	<li>在1 ml hMDM培养基中，以0.02–0.03的感染复数（MOI）将病毒加入hMDM细胞（细胞接种于1.13步骤中）。对照孔中仅加入1 ml hMDM培养基，并将培养皿置于37 °C、5% CO2条件下培养2天（图1）。</li>
	<li>第2天，用hMDM培养基洗涤细胞3次，每皿加入1 ml新鲜hMDM培养基。将细胞在37 °C、5% CO2条件下继续培养6天（图1）。</li>
</ol>
4. 绵羊红细胞的调理作用
<ol>
	<li>每培养皿准备 7 × 106 个 SRBC，将 SRBC 用含 0.1% 牛血清白蛋白（BSA）的 1× PBS 溶液洗涤两次，每次 100 µl，600 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>将洗涤后的 SRBC 重悬于 500 µl 含 0.1% BSA 的 1× PBS 中，每 5 µl SRBC 加入亚凝集浓度的兔抗 SRBC IgG，并在室温下旋转孵育 30 分钟。 
	注意：为确定抗 SRBC IgG 的亚凝集浓度，将 IgG（储存浓度为 13.1 mg/ml）在 96 孔板中用 20 µl 体积进行系列稀释，稀释倍数从 1/50 至 1/25,600。每孔加入 2 × 106 个 SRBC（20 µl），将板置于暗处数小时。亚凝集浓度即为出现凝集（IgG 与 SRBC 形成网状结构）前一个孔的稀释度。</li>
	<li>旋转孵育后，将 IgG 调理的 SRBC 在 600 × g 离心 4 分钟，用 100 µl 含 0.1% BSA 的 1× PBS 洗涤一次，再次于 600 × g 离心 4 分钟。</li>
	<li>将 IgG 调理的 SRBC 重悬于预热的不含酚红的 RPMI 培养基中，培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺和 1% 青霉素-链霉素（每培养皿 1 ml）。</li>
</ol>
5. 活细胞视频显微镜吞噬作用检测
<ol>
	<li>使用配备加热培养室的共聚焦成像系统，例如转盘式系统 37°C 与 CO2 通过装有水的瓶子进行加湿。</li>
	<li>实验前打开加热腔，使显微镜载物台达到所需温度 37 °C 在吞噬作用检测开始之前，打开显微镜和计算机，并启动成像软件。</li>
	<li>优化成像设置，例如扫描速度、放大倍数、分辨率 等等。 每视野至少包含一个细胞，并在60至120分钟期间每分钟拍摄一帧图像。 
	注意：此处使用63倍物镜，对样品每分钟成像一次，持续60分钟。</li>
	<li>将成像培养皿置于显微镜载物台上。调节焦距和位置，使视野中仅包含一个完整的HIV-1感染巨噬细胞。根据所使用的成像系统和探针，设置适当的激发/发射参数。添加明场（BF）通道以观察吞噬体图1ii). 通过调整透射光百分比和曝光时间，优化各通道图像的显示效果。 
	注意：此处使用491 nm激光激发NLR4.3 HIV-1 Gag-iGFP，激光功率为20%，曝光时间为50毫秒图1i).</li>
	<li>移除成像培养皿，加入1 ml浓度为7 x 10⁸/ml的SRBC悬液6 SRBCs/ml 加入培养皿中（图1).</li>
	<li>在室温下以 500 x g 离心 2 分钟以同步吞噬作用，记录此次离心结束的时间，并将培养皿放回显微镜载物台。</li>
	<li>优化焦距，并以一定步进距离（贯穿细胞厚度）进行Z轴层扫，采集GFP和明场图像 0.3 µm 每分钟采集约20个层面，持续至少1小时。将延时视频以所用成像系统的原生文件格式保存。 
	注意：此处，延时电影以原始格式保存，即 *.stk 文件。</li>
</ol>
6. 时间序列影片的分析
<ol>
	<li>进行视频编辑时，在视频编辑软件中点击下拉菜单“Apps”，然后点击“Review Multi Dimensional Data”标签页。
	<ol>
		<li>要打开文件，请点击“Select Base File”，然后点击“Select Directory”。在“Data sets”框中选择要分析的采集数据（.nd 格式），然后点击“View”。数据将以表格形式显示，时间位于列，Z 平面位于行。</li>
		<li>为了以 Z 投影方式展示感染情况（图 2，左侧面板），在“Wavelengths”框中选择 491 nm 波长，然后点击“Z projection”标签页并选择“all planes”。</li>
		<li>为了分析时间序列，在“Wavelengths”框中选择 BF 波长，并在 Z 轴上选择最佳平面，以区分外部 SRBCs（图 2，红色箭头）、内部 SRBCs（图 2，红色圆圈）和细胞核（图 2，蓝色圆圈）。</li>
		<li>要保存视频拼接图，点击“Selection [X's]”标签页，然后点击“Load Image(s)”。最后，将加载的图像保存为 .tif 格式，并在 ImageJ 软件中打开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 ImageJ 软件中使用“Manual Tracking”插件，测量在 BF 通道中观察到的细胞核和不同吞噬体的位置（图 3）。
	<ol>
		<li>从 ImageJ 网站下载“Manual Tracking”插件。在 ImageJ 中打开该插件和待分析的图像序列（图 3，步骤 1 和 2）。</li>
		<li>输入设置参数，例如“Time Interval”（表示相邻帧之间的时间间隔）和“x/y calibration”（表示每个像素对应的实际距离）（图 3，步骤 3）。 
		注：此处，图像序列的帧间时间间隔为 1 分钟，x/y 标定值为 0.205 µm，因为使用了 63X 放大倍数和像素尺寸为 6.45 × 6.45 µm2 的相机。</li>
		<li>开始追踪时，点击“Add track”（图 3，步骤 4），并在 SRBC 被内吞的第一个时间点点击其中心。下一帧将自动显示。</li>
		<li>在所有帧中持续点击 SRBC 中心，以获得其随时间变化的位置（图 3，红色框内步骤 6）。
		<ol>
			<li>首先追踪细胞核，通过点击其中心获取其在所有帧中的位置。然后依次追踪各个吞噬体（通过点击其中心），追踪起始时间（帧）为其被内吞的时间，不同 SRBC 的内吞时间可能不同。为便于在 BF 通道中观察 SRBC，可在追踪过程中使用“Brightness &amp; contrast”窗口进行调节（图 3，步骤 5）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>每次完成一个 SRBC 的追踪后，点击“Add track”（图 3，步骤 4）以创建新的追踪轨迹。追踪编号将在结果表格的第二列“Track n°”中更新（图 3，步骤 6）。</li>
		<li>将数据保存至电子表格中，以便进行下一步分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用电子表格软件计算含有 SRBC 的吞噬体向细胞核移动的距离，以及 SRBC 被内吞后前 5 分钟内的吞噬体运动速度（图 4）。
	<ol>
		<li>打开电子表格数据和一个新的电子表格文件。仅将以下参数转移至新文件：时间、细胞核及所有 SRBC 的 x 和 y 坐标（图 4A）。</li>
		<li>仅根据坐标计算 SRBC 与细胞核之间的距离时，可将细胞核和一个 SRBC 视为 XY 坐标平面上的两个点（图 4B）。 
		注：两点之间的距离即连接它们的路径长度。在平面上，SRBC 与细胞核之间的距离由勾股定理给出。
		<ol>
			<li>若 c（细胞核与 SRBC 之间的距离）表示斜边长度，a 和 b 表示另外两边的长度，则勾股定理可表示为以下勾股方程： 
			<img alt="勾股定理，公式 \(c^2 = a^2 + b^2\)，数学概念，几何学。" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 
			注：同时，在直角坐标系中，水平距离 a 为 (xnucleus-xSRBC)，垂直距离 b 为 (ynucleus-ySRBC)。</li>
			<li>因此，通过以下公式计算细胞核与 SRBC 之间的距离（图 4A，紫色框）： 
			<img alt="距离公式的方程；涉及 (x, y) 坐标；对几何分析至关重要。" src="/files/ftp_upload/54568/54568eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 2"> 
			注：将计算得到的距离值（单位为像素）乘以 x/y 标定值，即可转换为 µm。此处 x/y 标定值为 0.205 µm。</li>
			<li>在每个时间点，用初始距离减去当前细胞核与 SRBC 之间的距离（图 4C）。</li>
			<li>将前 5 分钟内的测量值对时间作图。为图表添加线性趋势线（图 5A），并确定该线性趋势线的斜率，该斜率代表 SRBC 内吞后前 5 分钟内吞噬体向细胞核移动的速度。</li>
			<li>汇总数据，计算速度值的平均值和统计误差，并使用适当的软件以合适的形式绘图（图 5B）。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Pathol%22%5BJournal%5D)">The cell biology of phagocytosis.</a> Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).</li>
<li>Niedergang, F. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNiedergang%2C+F+%22Encyclopedia+of+Cell+Biology%22">Encyclopedia of Cell Biology</a>. 2, Academic Press. Waltham, MA. 751-757 (2016).</li>
<li>Blocker, A., Griffiths, G., Olivo, J. C., Hyman, A. A., Severin, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+microtubule+dynamics+in+phagosome+movement%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">A role for microtubule dynamics in phagosome movement.</a> J Cell Sci. 111 (Pt 3), 303-312 (1998).</li>
<li>Blocker, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+requirements+for+bi-directional+movement+of+phagosomes+along+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular requirements for bi-directional movement of phagosomes along microtubules.</a> J Cell Biol. 137, 113-129 (1997).</li>
<li>Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimicrobial+mechanisms+of+phagocytes+and+bacterial+evasion+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies.</a> Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).</li>
<li>Feasey, N. A., Dougan, G., Kingsley, R. A., Heyderman, R. S., Gordon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Invasive+non-typhoidal+salmonella+disease%3A+an+emerging+and+neglected+tropical+disease+in+Africa%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Invasive non-typhoidal salmonella disease: an emerging and neglected tropical disease in Africa.</a> Lancet. 379, 2489-2499 (2012).</li>
<li>Mazzolini, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+phagocytosis+in+HIV-1-infected+macrophages+relies+on+Nef-dependent+alteration+of+focal+delivery+of+recycling+compartments%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Inhibition of phagocytosis in HIV-1-infected macrophages relies on Nef-dependent alteration of focal delivery of recycling compartments.</a> Blood. 115, 4226-4236 (2010).</li>
<li>Dumas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+protein+Vpr+impairs+phagosome+maturation+by+controlling+microtubule-dependent+trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 protein Vpr impairs phagosome maturation by controlling microtubule-dependent trafficking.</a> J Cell Biol. 211, 359-372 (2015).</li>
<li>Greenberg, S., el Khoury, J., Kaplan, E., Silverstein, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence+technique+to+distinguish+attached+from+ingested+erythrocytes+and+zymosan+particles+in+phagocytosing+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">A fluorescence technique to distinguish attached from ingested erythrocytes and zymosan particles in phagocytosing macrophages.</a> J. Immunol. Methods. 139, 115-122 (1991).</li>
<li>Koppensteiner, H., Banning, C., Schneider, C., Hohenberg, H., Schindler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+internal+HIV-1+is+protected+from+neutralizing+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Macrophage internal HIV-1 is protected from neutralizing antibodies.</a> J Virol. 86, 2826-2836 (2012).</li>
<li>Gartner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+macrophage+and+HIV%3A+basic+concepts+and+methodologies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The macrophage and HIV: basic concepts and methodologies.</a> Methods Mol Biol. 1087, 207-220 (2014).</li>
<li>Wei, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+of+resistant+human+immunodeficiency+virus+type+1+in+patients+receiving+fusion+inhibitor+%28T-20%29+monotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Emergence of resistant human immunodeficiency virus type 1 in patients receiving fusion inhibitor (T-20) monotherapy.</a> Antimicrob Agents Chemother. 46, 1896-1905 (2002).</li>
<li>Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phagosomes+fuse+with+late+endosomes+and%2For+lysosomes+by+extension+of+membrane+protrusions+along+microtubules%3A+role+of+Rab7+and+RILP%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Phagosomes fuse with late endosomes and/or lysosomes by extension of membrane protrusions along microtubules: role of Rab7 and RILP.</a> Mol Cell Biol. 23, 6494-6506 (2003).</li>
<li>Toyohara, A., Inaba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport+of+phagosomes+in+mouse+peritoneal+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Transport of phagosomes in mouse peritoneal macrophages.</a> J Cell Sci. 94 (Pt 1), 143-153 (1989).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

该技术包含若干关键步骤。首先，人源单核细胞来源的巨噬细胞（hMDMs）的制备及其感染HIV-1的过程至关重要，因为感染率依赖于供体差异。值得注意的是，我们选择使用未极化的巨噬细胞 体外 感染前，因为病毒可能遇到的巨噬细胞状态 体内 迄今为止尚未得到充分表征。我们检测了多种表面标志物的表达，结果表明这些巨噬细胞既不属于M1型也不属于M2型，并验证了CD4和CCR5的表达。感染率存在差异，范围在10%至40%之间，有时更低。这种可变的感染率导致在显微镜下难以找到HIV-1感染的荧光标记hMDM细胞。此外，在离心步骤后立即寻找HIV-1感染细胞所需的时间也可能导致成像采集的启动延迟。吞噬作用可在不依赖离心所引起的结合与内吞同步化的情况下启动。然而，该方案不适用于在到达细胞前会漂浮的SRBCs，但对于微珠则可能是一个可行的选择。为了最大限度缩短寻找感染细胞所需时间，可在进行吞噬实验前使用带网格的玻璃底培养皿来定位HIV-1感染的hMDM细胞。所选定的HIV感染细胞具有 &#34;合理的&#34; 其周围的SRBC数量将被迅速选定以开始采集。 &#34;适量SRBC&#34; 意味着每个细胞至少含有10个SRB...

巨噬细胞在先天免疫系统和机体稳态中发挥重要作用。它们是专职的吞噬细胞，通过一种称为吞噬作用的过程内化并清除病原体和细胞碎片1,2。在颗粒物质被吞噬后形成的封闭结构称为吞噬体，其会与胞内体区室发生一系列融合和分裂事件，最终形成具有降解功能的吞噬溶酶体。该区室因获得质子泵v-ATPase而呈现酸性pH环境，含有水解酶，并富含溶酶体相关膜蛋白（LAMPs）。吞噬体的成熟过程伴随着其沿微管向细胞中心迁移3,4，最终到达核周区域，此处聚集了大量溶酶体。
已有多种病原体被报道可劫持吞噬体成熟过程，包括一些具有胞内生活方式的细菌，它们会修饰自身所处的囊泡环境5。人类免疫缺陷病毒（HIV）-1除感染T细胞外，还可靶向巨噬细胞。与T细胞不同，巨噬细胞对病毒的细胞病变效应具有抗性，因此可被视为病毒的储存库。此外，感染HIV-1的巨噬细胞表现出吞噬功能缺陷，并促进机会性疾病的出现。特别是，由伤寒沙门菌鼠伤寒血清型ST313（Salmonella Typhimurium ST313）引起的严重侵袭性非伤寒沙门菌病，在过去三十年中在中国台湾撒哈拉以南非洲的HIV感染儿童和成人中广泛流行6。据估计，与未感染HIV的人群相比，HIV感染者患结核病的风险高出20倍以上。
基于上述所有原因，明确HIV感染巨噬细胞中吞噬功能缺陷的分子机制显得尤为重要。我们已证实，在HIV感染的巨噬细胞中，颗粒物质、调理颗粒、细菌或真菌的摄取均受到抑制7。鉴于这种抑制作用是部分性的，我们进一步着手分析HIV感染人巨噬细胞中已内化吞噬体的命运8。由于吞噬体成熟过程与向细胞中心迁移以及与溶酶体融合密切相关，因此感染细胞内吞噬体成熟缺陷可能源于细胞内运输模式的改变。本文所述方法采用IgG调理的绵羊红细胞（IgG-SRBCs）作为模型，以靶向受体介导的吞噬作用，特别是针对免疫球蛋白Fc段的受体（FcR）。与乳胶微球相比，这些颗粒在明场（BF）下更易于成像，因为细胞外和细胞内的SRBCs具有不同的折射特性9。为了测量HIV感染巨噬细胞中向细胞核方向移动的吞噬体的速度，我们使用了一种荧光病毒10，并建立了一种简单的手动追踪方法，本文对此进行了描述。该方法无需高级编程，仅使用ImageJ软件即可完成。该方法适用于贴壁细胞，以及任何可通过明场显微镜或荧光成像观察的颗粒或病原体。

<table><tbody><tr><td>Falcon 100 mm 细胞培养皿（经TC处理）</td><td>康宁</td><td>353003</td><td>用于病毒制备</td></tr><tr><td>35 mm 未包被玻璃底培养皿 1.5</td><td>MatTek 公司</td><td>P35G-1.5-14-C 型外壳</td><td>用于采集</td></tr><tr><td>Falcon 细胞培养板 6 孔</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>Corning. Inc. 353934</td><td>人单核细胞来源的巨噬细胞</td></tr><tr><td>Ficoll-Plaque PLUS</td><td>Dominique Dutscher</td><td>17-1440-03</td><td>一种中性的、高度分支的、高分子量的亲水性多糖溶液，用于密度梯度离心</td></tr><tr><td>不含钙、镁的DPBS</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>14190-094</td><td>RT</td></tr><tr><td>Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）1×，液体（高葡萄糖）</td><td>GIBCO，Molecular Probes</td><td>31966-021</td><td>4℃ 保存 &amp;deg;C；用于HEK细胞培养</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基 GLUTAMAX&amp;nbsp; 补充材料</td><td>Life technologies</td><td>61870-010</td><td>4℃下保存 &amp;deg;C；用于hMDMs培养</td></tr><tr><td>F&amp;oelig;胎牛血清（FCS）&amp;nbsp;</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF0001</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C ；去补体</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素（10,000 U/ml）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>15140-122</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C；用于hMDMs培养</td></tr><tr><td>RPMI 1640 培养基，无酚红（10×500 ml）</td><td>Life technologies</td><td>11835-105</td><td>37℃预热 &amp;deg;使用前将水浴预热至37°C；用于吞噬作用检测</td></tr><tr><td>FuGENE6 转染试剂</td><td>Promega</td><td>E2692</td><td>4℃下保存 &amp;deg;C；用于病毒生产</td></tr><tr><td>绵羊红细胞（SRBCs）</td><td>Eurobio</td><td>DSGMTN00-0Q</td><td>在4℃的Alsever缓冲液中保存 &amp;deg;使用前置于 C</td></tr><tr><td>抗绵羊红细胞IgG</td><td>MP Biomedicals</td><td>55806</td><td>4℃下保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白热激组分，pH 7 &amp;ge;98%&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td>-20℃保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>倒置显微镜 DMI600</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>共聚焦旋转盘装置&amp;nbsp; CSU-X1M1</td><td>横河</td><td></td><td></td></tr><tr><td>491 nm 50 mW 激光器</td><td>COBOLT CALYPSO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX PL APO CS 物镜</td><td>Leica</td><td></td><td>物镜；放大倍数 100X；数值孔径 1.40；浸油</td></tr><tr><td>CoolSnap HQ2（FireWire）相机</td><td>光度测量</td><td></td><td>像素大小 6.45 &amp;micro;m × 6.45 &amp;micro;米；定义 1,392 x 1,040；以14位对图像进行编码</td></tr><tr><td>Metamorph 7.7.5 软件</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>显微镜的控制</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 软件</td><td></td><td></td><td>用于统计分析</td></tr></tbody></table>

活体原代人巨噬细胞感染hiv-1后吞噬体的迁移与速度测定

Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1

巨噬细胞是一类吞噬性细胞，在先天免疫与特异性免疫的交汇点发挥重要作用。巨噬细胞可被人类免疫缺陷病毒（HIV）-1感染，由于其对病毒的细胞病变效应具有抵抗性，因此可被视为持续存在的病毒储存库。此外，感染HIV的巨噬细胞表现出功能缺陷，这有助于机会性疾病的产生和发展。
HIV-1 损伤巨噬细胞吞噬反应的确切机制此前尚不清楚。我们先前已证明，当巨噬细胞感染 HIV-1 后，其对多种颗粒物质的摄取能力受到抑制。这种抑制仅为部分性，且在 HIV 感染的巨噬细胞中仍可形成吞噬体。因此，我们聚焦于分析这些吞噬体的命运。吞噬体成熟过程伴随着这些区室向细胞中心迁移，并与溶酶体融合，形成负责降解摄入物质的吞噬溶酶体。我们采用 IgG 包被的绵羊红细胞作为吞噬作用的靶标。为了测量单个 HIV 感染巨噬细胞中吞噬体向心运动的速度，我们结合使用了明场和荧光共聚焦显微镜技术。我们建立了一种方法，用于计算吞噬体与细胞核之间的距离，进而计算吞噬体的运动速度。HIV 感染细胞通过表达 GFP 的病毒进行识别，但该方法同样适用于未感染细胞或任何其他类型的感染或处理条件。

本文描述了利用IgG包被的绵羊红细胞（SRBCs）作为模型靶标，检测HIV-1感染与未感染人单核细胞来源巨噬细胞（hMDMs）中Fc受体介导的吞噬作用的方法（图1）。该实验方案的关键步骤包括hMDMs的制备以及HIV-1感染。事实上，不同供体来源的巨噬细胞分化产量和质量存在差异，且HIV-1感染效率通常在10–40%之间。此外，IgG包被SRBCs的制备也至关重要，需避免损伤红细胞，否则可能导致红细胞被识别为细胞碎片而被非特异性摄取，而非通过Fc受体介导的吞噬作用被摄取。充分的包被可确保高效的吞噬作用。
在生物安全三级实验室中，使用旋转盘共聚焦显微镜的明场通道对活体HIV感染巨噬细胞内吞噬体的运动进行实时分析。明场通道的设置对于观察细胞核（图2，蓝色圆圈）以及区分外部红细胞（图2，红色箭头）与已内化的SRBCs（图2，...

我们描述了一种利用旋转盘共聚焦荧光显微镜识别荧光标记的感染细胞，并结合明场显微镜检测吞噬体，以测量在感染或未感染人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）的活细胞中向细胞中心移动的吞噬体速度的方法。

活体原代人巨噬细胞感染HIV-1后吞噬体的迁移与速度测定

巨噬细胞是一类吞噬性细胞，在先天免疫与特异性免疫的交汇点发挥重要作用。它们可被人类……感染。

本分析的总体目标是利用简单的手动追踪方法，定量测定 HIV-1 感染的巨噬细胞中吞噬体的运动速度。该实验方案的优势在于提供了一种简便的方法，用于计算细胞内一组物体的相对运动，这些物体可能处于运动状态或发生形变。该方法可用于研究表达 GFP 的感染性巨噬细胞中吞噬体的运动情况，也可推广应用于其他荧光标记细胞中的细胞内区室运动分析。根据文本方案，在感染人单核细胞来源的巨噬细胞并包被羊源血液细胞后，使用配备有37摄氏度加热室和二氧化碳环境的共聚焦成像系统（例如转盘显微镜）建立吞噬作用检测。实验前，打开加热室，将显微镜载物台预热至37摄氏度。然后开启显微镜和计算机，并加载成像软件。优化成像参数，例如扫描速度、放大倍数、分辨率等，确保每个视野至少包含一个细胞，并在60至120分钟之间每分钟采集一帧图像。将成像培养皿放置在显微镜载物台上，调节焦距和位置，使视野中仅包含一个完整的HIV-1感染巨噬细胞。根据所使用的成像系统和探针，选择合适的激发和发射参数。包含明场通道，并通过调整曝光时间优化其成像效果。接下来，取出成像培养皿，向其中加入1毫升绵羊红细胞（SRBC）悬液，浓度为每毫升7×10⁶个SRBC。在室温下以500×g离心2分钟，以同步吞噬作用。离心结束后记录时间，然后将培养皿放回显微镜载物台。调整焦距，设置成像Z轴栈的顶部和底部，步进距离为0.3微米。开始采集细胞全厚度范围内的GFP和明场（BF）图像的Z轴层扫数据，并以成像系统的原生文件格式保存延时视频。进行视频编辑时，在视频编辑软件中点击下拉菜单Apps，然后选择Review Multidimensional Data选项卡。打开文件时，先点击Select Base File，再点击Select Directory。在“数据集”框中，选择要分析的采集数据，然后点击“查看”。为了以Z轴投影形式显示感染情况，在“波长”框中选择491纳米波长，然后点击包含所有层面的Z投影标签。接下来，为了分析时间序列，在“波长”框中选择明场（BF）波长，并在Z轴上选择最佳层面，以区分外部SRBC、内部SRBC以及细胞核。单击“Selection Xs”选项卡，然后单击“Load Images”，保存视频拼接图像。最后，将加载的图像以 tif 格式保存。下载 Image J 手动追踪插件后，在 Image J 中打开该插件，然后打开待分析的图像序列。输入参数设置，例如时间间隔（表示相邻帧之间的时间长度）和 XY 校准（表示每个像素对应的距离）。要开始追踪，请点击“添加轨迹”（Add Track），然后在SRBC被内吞后的第一帧中点击其细胞中心。下一帧将自动显示。为方便在明场（BF）通道中观察SRBC，可在追踪过程中调节亮度和对比度窗口。在所有帧中持续点击SRBC的中心，以获取其随时间变化的不同位置。每次完成一个SRBC的追踪后，点击“End Track”，然后点击“Add Track”以开始下一条轨迹的追踪。结果表格的第二列中，追踪编号将会发生变化。通过单击细胞核中心（操作方式与之前相同）开始追踪细胞核，以获取其在所有帧中的位置。将数据保存到电子表格中，然后在电子表格软件中打开，并创建一个新的电子表格文件。将SRBC和细胞核的时间、X坐标和Y坐标信息转入该新文件中。最后，根据文本方案，使用电子表格软件计算含有SRBC的吞噬体向细胞核移动的距离，以及SRBC被内化后最初五分钟内吞噬体的运动速度。本研究展示了利用转盘共聚焦显微镜实时分析活体HIV感染巨噬细胞中吞噬体运动的过程。明场通道的设置对于观察细胞核以及区分外部与已内化的绵羊红细胞（SRBC）至关重要。该图显示了非感染性人源巨噬细胞（HMDM）中吞噬体在内化SRBC后最初五分钟内的运动距离随时间的变化。吞噬体的速度即为图中所示线性回归曲线的斜率。最后，在本研究中观察到，HIV感染的HMDM细胞在病原体内化后的前五分钟内，吞噬体的运动速度低于未感染的HMDM细胞。这些方法表明，在HIV感染的巨噬细胞中，吞噬体向细胞中心的移动过程受到损害，从而导致吞噬体向吞噬溶酶体的成熟过程受阻。在获取细胞后，可进一步对其进行相关电子显微镜分析，或对整个细胞群体进行固定，用于经典的免疫荧光显微镜观察和统计学分析。吞噬作用对温度非常敏感，因此在整个操作过程中，加热腔和培养皿中的培养基温度应始终保持在恒定的37摄氏度。请勿忘记，处理病原体可能存在危险，应根据当地法规采取相应预防措施，例如在生物安全实验室中操作，并穿戴个人防护装备。

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Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

吞噬体偏移和速度与HIV-1感染的活小学的人巨噬细胞测量

本可视化实验旨在指导如何利用荧光标记的HIV分子克隆进行活细胞共聚焦成像实验。...

利用荧光标记的HIV克隆与活细胞共聚焦显微镜观察HIV的细胞间传递

吞噬动力运动轨迹检测是一种用于评估细胞运动的方法。具体而言，该检测以定量方式随时间测量趋化运动（即细胞的随机运动）。该检测利用了细胞在胶体金包被的盖玻片上留下可测量运动轨迹的能力。...

基于吞噬动力轨迹运动测定法对细胞迁移的定量评估

来源：Lê-Bury, G., 等. 在感染HIV-1的活体人原代巨噬细胞中测量吞噬体迁移与速度。J. Vis. Exp. (2016)本视频展示了对感染 HIV-1 的人巨噬细胞进行活细胞共聚焦成像，通过 GFP 荧光和明场追踪技术来观察和量化吞噬体的迁移，从而揭示 HIV 如何在 Fc...

活体成像观察HIV-1感染人巨噬细胞中吞噬体的迁移

本视频展示了一种用于定量检测寄生虫在骨髓来源巨噬细胞（BMMs）内生长的实验方法。巨噬细胞被运动型和非运动型侵袭期寄生虫感染，...

一种体外定量检测寄生虫在巨噬细胞内生长的实验方法

我们描述了利用活细胞视频显微镜观察巨噬细胞吞噬Candida...

活细胞视频显微镜观察真菌病原体的吞噬作用

吞噬细胞通过在其吞噬体中清除和消除入侵的微生物，在先天免疫系统中发挥重要作用。吞噬体……...

活体巨噬细胞中吞噬溶酶体发生的生物学研究

本文介绍了一种利用荧光测定法定量分析贴壁巨噬细胞系吞噬荧光颗粒的实验方案。该方法可实现对颗粒内化及伴随发生的肌动蛋白聚合的高通量定量分析。...

高通量荧光测定法评估巨噬细胞吞噬作用与肌动蛋白聚合

所有致病性利什曼原虫（Leishmania）物种均在其脊椎动物宿主的巨噬细胞内寄居并增殖。本文介绍一种在体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞中感染利什曼原虫（Leishmania）并精确量化其胞内生长动力学的实验方案。该方法适用于研究影响宿主-病原体相互作用及利什曼原虫（Leishmania）毒力的各个独立因素。...

巨噬细胞内生长的定量分析是一种快速可靠的毒力评估方法 利什曼原虫 寄生虫

本文介绍了利用旋转盘共聚焦显微镜对小鼠腹腔常驻巨噬细胞的单个吞噬事件进行成像的方法。该方案可拓展应用于其他吞噬性细胞。...

小鼠巨噬细胞吞噬作用的延时三维成像

与吞噬作用相关的机制 利什曼原虫 感染仍知之甚少。本文中，我们描述了用于评估感染早期事件的方法 利什曼原虫...

使用共聚焦显微镜研究Leishmania的吞噬作用

学习使用转盘式共聚焦荧光显微镜和手动追踪技术，在HIV-1感染的人单核细胞来源巨噬细胞中定量测量吞噬体向细胞中心移动的速度。该方法为研究病毒感染期间的细胞免疫反应提供了重要工具。

活体原代人巨噬细胞感染HIV-1后吞噬体的迁移与速度测定

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