Name: CD4的制备 + T细胞通过显微镜分析GD3和GD2神经节苷脂膜表达的 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min
Description: 学习利用抗体染色和显微镜技术可视化人源CD4+ T细胞表面的GD3和GD2神经节苷脂定位。该方法适用于少量细胞样本，有助于T细胞白血病研究和诊断。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

我们感谢 José Luis Daniotti 博士的评论。感谢 J. Arturo Pimentel 博士和墨西哥国立自治大学国家先进显微镜实验室在共聚焦图像采集方面提供的协助。I.M.-D. 和 T.M.V.C. 的研究得到了墨西哥国家科学与技术委员会（CONACYT）基金项目 157634 和 253596、拉丁美洲糖生物学学会（A.C.）的资助。T.M.V.-C. 获得了 CONACYT 提供的奖学金（245192）。我们还感谢 CONACYT（253596）糖科学与健康专题网络提供的支持。

在获得知情同意并经莫雷洛斯州立自治大学细胞动力学研究中心生物伦理委员会批准后，采集了健康男性供体的外周血。
1. 人初始CD4+ T细胞的分离与活化
<ol>
	<li>在知情同意下采集健康人类供体的外周血2 ml，加入2 ml无菌PBS-EDTA（1×磷酸盐缓冲液（PBS），2 mM EDTA，pH 7.4）稀释。将稀释后的血液缓慢加至3 ml密度为1.077的蔗糖溶液上层，操作方法同前文所述。8. 
	注意：由于密度差异，离心过程中不同成分的沉降速度不同，可导致红细胞完全沉淀，而密度较低的单个核细胞则在上层形成一层。2 ml 外周血可获得约 0.5 x 106 初始CD4+ 纯化步骤后的T细胞</li>
	<li>在21 °C下以250 × g离心30分钟（使用适用于圆底管、固定角度为30 mm的转子），无制动，以形成外周血单个核细胞（PBMCs）的密度梯度。离心后，PBMCs可清晰呈现为白色环状层。用移液器收集PBMCs，转移至无菌管中进行洗涤。</li>
	<li>在 PBS-EDTA 溶液中以 250 × g 离心洗涤 3 次，每次 10 分钟后，进行初始 CD4+ T细胞。可使用分选方法或多种类型的纯化试剂盒来实现此目的。建议使用 &#62;1 × 107 用于纯化的外周血单个核细胞（PBMCs）
	<ol>
		<li>纯化初始CD4+ 通过磁珠负向筛选法分离T细胞。使用抗CD45RO、CD8、CD14、CD15、CD16、CD19、CD25、CD34、CD36、CD56、CD123、抗TCRγ/δ、抗HLA-DR和CD235a（glycophorin A）抗体进行负向筛选。通过流式细胞术检测CD4+CD45RA+细胞比例，评估纯度。 
		注意：可选择将PBMC在37 °C和5% CO₂条件下孵育过夜2 密度为 1 x 106 细胞/ml，加入10 ml补充培养基以促进单核细胞贴壁，随后继续进行初始CD4+ T细胞纯化。高效回收初始CD4+ 外周血T细胞的纯化在很大程度上依赖于所采用的纯化系统。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在24孔细胞培养板中，每孔加入250 µl含5 µg/ml抗CD3单克隆抗体的PBS，37 °C孵育至少2小时。 
	注意：当从初始CD4细胞获取较少数量时，可使用96孔板。+ T细胞被用于（例如， 2 × 104-1 × 105).</li>
	<li>从24孔板或96孔板中移除抗CD3抗体稀释液，并用无菌1×PBS洗涤板孔两次。</li>
	<li>稀释初始CD4+ T细胞 &#62;纯度95%（CD4+CD45RA+），密度为1 x 106 细胞数/ml，置于添加有3%胎牛血清（或含10%血清的RPMI）的改良RPMI 1640培养基中，同时补充2 mM谷氨酰胺及抗生素（1 U/ml青霉素，1 µg/ml链霉素）。 
	注意：如果需要在PBMCs中进行神经节苷脂定位，请按照下述相同的稀释和刺激方案进行操作。</li>
	<li>向24孔板中的抗CD3包被孔及未包被孔（对照细胞）各加入500 µl细胞稀释液。或者，向96孔板的孔中各加入100 µl细胞稀释液。</li>
	<li>完成初始 CD4 的刺激条件+ 通过添加1 µg/ml抗CD28抗体至抗CD3包被孔中，处理T细胞。</li>
	<li>保持静息的 CD4+ 未包被孔中的T细胞作为对照，不添加抗CD28抗体。将静息和活化的CD4+ T细胞在37 °C和5% CO₂的标准条件下培养0至72小时2.</li>
	<li>通过流式细胞术检测静息和活化的初始CD4+ T细胞在激活后16小时的早期活化标志物CD69表达，或在激活后48小时的晚期活化标志物CD25表达，以确认活化是否充分。+ 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育的 T 细胞2 在无或有抗 CD3/CD28 抗体的情况下9,10.</li>
</ol>
2. 静息与活化初始CD4+ T细胞的黏附
<ol>
	<li>将12 mm圆形盖玻片经高压灭菌并用紫外光照射至少15分钟以进行灭菌。</li>
	<li>将盖玻片放入无菌的24孔细胞培养板中。 
	注意：对于细胞数量少于1 × 105的培养物，建议使用带有适配小孔的载玻片培养腔，以防止细胞在盖玻片上扩散。</li>
	<li>用200 µl浓度为0.1%（w/v）的聚-L-赖氨酸溶液（分子量150–300 KDa）覆盖盖玻片（或载玻片培养腔），室温孵育5分钟，去除溶液后于室温干燥至少1小时。</li>
	<li>轻柔混匀，从24孔板中收集静息和活化的初始CD4+ T细胞。计数细胞，并在必要时用新鲜的完全培养基调整浓度，将1 × 105个细胞转移至涂有聚-L-赖氨酸的盖玻片上。于37 oC、5% CO2条件下孵育至少6小时。</li>
</ol>
3. 静息与活化初始CD4+ T细胞的收集与固定
<ol>
	<li>小心移除培养的静息态和活化初始 CD4+ T 细胞中的培养基。</li>
	<li>缓慢加入 500 µl 室温的无菌 PBS。 
	注意：向孔中添加或移除溶液时应小心操作，以防止细胞从盖玻片上脱落。</li>
	<li>弃去 PBS，并加入另 500 µl PBS 以彻底清除残留的培养基。</li>
	<li>通过加入 500 µl 过滤后的 4% 多聚甲醛固定细胞（过滤可去除可能干扰显微镜分析的微粒），在室温下孵育 30 分钟（推荐）或在 4 °C 下过夜。 
	警告：多聚甲醛是一种有毒且易挥发的化合物，已被确认为人类致癌物。操作时须遵循适当的安全规程，谨慎使用。</li>
	<li>移除固定液，并在室温下用 PBS 至少洗涤两次。</li>
	<li>继续进行下一步操作，或在 4 °C 下用 500 µl PBS 保存板孔数天，直至染色。 
	注意：此过程中的无菌操作有助于避免微生物生长。</li>
</ol>
4. 染色、封片及共聚焦显微镜观察
<ol>
	<li>吸去孔中的 PBS，每孔加入 500 µl 冷封闭缓冲液（1× PBS，0.5% 标准级牛血清白蛋白，1% 胎牛血清，pH 7.4），冰上孵育 20 分钟。</li>
	<li>小心吸去封闭缓冲液，缓慢加入用封闭缓冲液稀释至 2.5 µg/ml 的一抗（抗神经节苷脂 GD3 单克隆抗体 R24，抗 GD2 单克隆抗体 14G2a）、PE 标记的抗 CD25 抗体、APC 标记的抗 TCR 抗体以及同型对照抗体。</li>
	<li>冰上孵育 2 小时，或 4 °C 过夜。 
	注意：建议采用缓慢的轨道振荡。</li>
	<li>小心吸去抗体溶液，缓慢加入 500 µl PBS，重复洗涤两次。</li>
	<li>加入用封闭缓冲液稀释至 0.1 µg/ml 的二抗（针对 R24 抗 GD3 的 FITC 标记抗 IgG3 抗体，针对 14G2a 抗 GD2 的 Alexa Fluor 488 标记或 Alexa Fluor 647 标记抗 IgG2a 抗体）。</li>
	<li>避光、冰上孵育 1 小时，不振荡。</li>
	<li>按步骤 4.4) 所述方法用 PBS 洗涤三次。保持孔内有足够 PBS，防止样本脱水。</li>
	<li>加入用 PBS 稀释至 0.1 µg/ml 的 Hoechst 333258 染色液。</li>
	<li>室温孵育 15 分钟后吸去染液，用 PBS 洗涤三次。</li>
	<li>将载玻片置于纸巾上，每片加入 20 µl 封片液（含 50% 甘油的 PBS）或商用封片液，以防止样本荧光淬灭和褪色。</li>
	<li>用精细镊子小心夹取盖玻片，将其覆盖在封片液上，确保盖玻片上贴有细胞的一面与封片液接触。用指甲油封固盖玻片边缘，随后使用荧光显微镜或共聚焦显微镜进行观察。</li>
</ol>
5. RNA 的提取
<ol>
	<li>准备包被抗 CD3 抗体（5 µg/ml）的 96 孔板。每孔加入 4 × 104 个初始 CD4+ T 细胞，置于 100 µl 补充培养基中，并加入抗 CD28 抗体（1 µg/ml）以完成刺激。在 37 °C、5% CO2 条件下孵育 0 至 72 小时。</li>
	<li>在不同激活后时间点，将细胞转移至微量离心管中。</li>
	<li>加入 500 µl PBS，于室温下以 250 × g 离心 5 分钟。</li>
	<li>移除上清液，加入 1 ml Trizol 试剂。</li>
	<li>室温孵育 5 分钟，将样品于 -80 °C 保存至少 24 小时。根据需要进行 RNA 提取。 
	注意：样品在 -80 °C 保存至少 24 小时可提高 RNA 产量。同时，必须佩戴手套以防止 RNase 导致 RNA 降解。</li>
	<li>将样品置于 37 °C 水浴中孵育 2 分钟以解冻。</li>
	<li>加入 200 µl 氯仿，手动剧烈振荡 30 秒（避免使用涡旋振荡器以防止 RNA 过度剪切）。室温孵育 5 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将水相转移至新的微量离心管中。</li>
	<li>加入 500 µl 异丙醇，轻轻颠倒混匀 3 次。</li>
	<li>室温孵育 10 分钟，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>通过倒置弃去上清液。</li>
	<li>加入 1 ml 冰冷的 75% 乙醇，在 4 °C 条件下以 12,000 × g 离心 10 分钟。</li>
	<li>彻底弃去上清液，打开管盖使 RNA 沉淀自然干燥。 
	注意：此时沉淀通常不可见，但仍需继续操作。</li>
	<li>将沉淀溶于 20 µl 分子生物学级水中。使用 Nanodrop 测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光度，计算核酸浓度和纯度。</li>
	<li>按照任意常规逆转录酶试剂盒的说明书，小心进行 cDNA 合成。 
	注意：从 4 × 104 个初始 CD4+ T 细胞中通常可获得约 0.5–2 µg RNA。cDNA 可由 100 ng RNA 合成，并可直接用于实时 PCR 反应，无需使用低 RNA 输入专用试剂盒。</li>
</ol>

<ol><li>Mazzon, C., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+tango+to+quadrilla%3A+current+views+of+the+immunological+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">From tango to quadrilla: current views of the immunological synapse.</a> Cell Adh Migr. 1 (1), 7-12 (2007).</li>
<li>Hamann, D., Pa Baars,, Hooibrink, B., van Lier, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+the+human+CD4%2B+T-cell+population%3A+two+distinct+CD4%2B+T-cell+subsets+characterized+by+coexpression+of+CD45RA+and+CD45RO+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of the human CD4+ T-cell population: two distinct CD4+ T-cell subsets characterized by coexpression of CD45RA and CD45RO isoforms.</a> Blood. 88 (9), 3513-3521 (1996).</li>
<li>Zhong, L., Zhang, Z., Lu, X., Liu, S., Chen, C. Y., Chen, Z. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NSOM+%2F+QD-Based+Visualization+of+GM1+Serving+as+Platforms+for+TCR+%2F+CD3+Mediated+T-Cell+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">NSOM / QD-Based Visualization of GM1 Serving as Platforms for TCR / CD3 Mediated T-Cell Activation.</a> Biomed Res Int. , 276498(2013).</li>
<li>Nagafuku, M., Okuyama, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PNAS+Plus%3A+CD4+and+CD8+T+cells+require+different+membrane+gangliosides+for+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Procs+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">PNAS Plus: CD4 and CD8 T cells require different membrane gangliosides for activation.</a> Procs Natl Acad Sci USA. 109 (6), E336-E342 (2012).</li>
<li>Schnaar, R. L., Gerardy-Schahn, R., Hildebrandt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sialic+acids+in+the+brain%3A+gangliosides+and+polysialic+acid+in+nervous+system+development%2C+stability%2C+disease%2C+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Sialic acids in the brain: gangliosides and polysialic acid in nervous system development, stability, disease, and regeneration.</a> Physiol Rev. 94, 461-518 (2014).</li>
<li>Villanueva-Cabello, T. M., Mollicone, R., Cruz-Muñoz, M. E., Lòpez-Guerrero, D. V., Martìnez-Duncker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+human+na%C3%AFve+Th+cells+increases+surface+expression+of+GD3+and+induces+neoexpression+of+GD2+that+colocalize+with+TCR+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Activation of human naïve Th cells increases surface expression of GD3 and induces neoexpression of GD2 that colocalize with TCR clusters.</a> Glycobiology. 25 (12), 1454-1464 (2015).</li>
<li>Müthing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLC+in+structure+and+recognition+studies+of+glycosphingolipids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">TLC in structure and recognition studies of glycosphingolipids.</a> Methods Mol Biol. 76 (17), 183-195 (1998).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>O'Neil-Andersen, N. J., Lawrence, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+modulation+of+surface+and+intracellular+protein+expression+by+T+cells+after+stimulation+in+the+presence+of+monensin+or+brefeldin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential modulation of surface and intracellular protein expression by T cells after stimulation in the presence of monensin or brefeldin A.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (2), 243-250 (2002).</li>
<li>Mannering, S. I., Zhong, J., Cheers, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+activation%2C+proliferation+and+apoptosis+in+primary+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">T-cell activation, proliferation and apoptosis in primary Listeria monocytogenes infection.</a> Immunology. 106 (1), 87-95 (2002).</li>
<li>Marconi, S., Acler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-GD2-like+IgM+autoreactivity+in+multiple+sclerosis+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mult+Scler%22%5BJournal%5D)">Anti-GD2-like IgM autoreactivity in multiple sclerosis patients.</a> Mult Scler. 12 (3), 302-308 (2006).</li>
<li>Park, J. E., Wu, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+specificity+of+natural+killer+T+cells+against+GD3+ganglioside+and+identification+of+GM3+as+an+inhibitory+natural+killer+T-cell+ligand%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Fine specificity of natural killer T cells against GD3 ganglioside and identification of GM3 as an inhibitory natural killer T-cell ligand.</a> Immunology. 123 (1), 145-155 (2008).</li>
<li>Simon, B. M., Malisan, F., Testi, R., Nicotera, P., Leist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disialoganglioside+GD3+is+released+by+microglia+and+induces+oligodendrocyte+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Disialoganglioside GD3 is released by microglia and induces oligodendrocyte apoptosis.</a> Cell Death Differ. 9 (7), 758-767 (2002).</li>
<li>Beske, O., Reichelt, M., Taylor, M. P., Kirkegaard, K., Andino, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poliovirus+infection+blocks+ERGIC-to-Golgi+trafficking+and+induces+microtubule-dependent+disruption+of+the+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Poliovirus infection blocks ERGIC-to-Golgi trafficking and induces microtubule-dependent disruption of the Golgi complex.</a> J Cell Sci. 120 (18), 3207-3218 (2007).</li>
<li>Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi+apparatus+immunolocalization+of+endomannosidase+suggests+post-endoplasmic+reticulum+glucose+trimming%3A+implications+for+quality+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: implications for quality control.</a> Mol Biol Cell. 11 (12), 4227-4240 (2000).</li>
<li>Yamashiro, S., Okada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+%28GD3+synthase%29+gene+in+human+cancer+cell+lines%3A+high+level+expression+in+melanomas+and+up-regulation+in+activated+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycoconj+J%22%5BJournal%5D)">Expression of (GD3 synthase) gene in human cancer cell lines: high level expression in melanomas and up-regulation in activated T lymphocytes.</a> Glycoconj J. 12 (6), 894-900 (1995).</li>
<li>Wipfler, D., Srinivasan, G. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentially+regulated+expression+of+9-O-acetyl+GD3+%28CD60b%29+and+7-O-acetyl-GD3+%28CD60c%29+during+differentiation+and+maturation+of+human+T+and+B+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Glycobiology%22%5BJournal%5D)">Differentially regulated expression of 9-O-acetyl GD3 (CD60b) and 7-O-acetyl-GD3 (CD60c) during differentiation and maturation of human T and B lymphocytes.</a> Glycobiology. 21 (9), 1161-1172 (2011).</li>
<li>Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R., Dippold, W. G., Oettgen, H. F., Old, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GD3%2C+a+prominent+ganglioside+of+human+melanoma.+Detection+and+characterisation+by+mouse+monoclonal+antibody%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">GD3, a prominent ganglioside of human melanoma. Detection and characterisation by mouse monoclonal antibody.</a> J Exp Med. 155 (4), 1133-1147 (1982).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

所述方案可用于在CD4细胞悬液中定位神经节苷脂或蛋白质+ T细胞或其他免疫细胞（例如，外周血单个核细胞（PBMCs）， 图5) 从少量细胞开始。由于T细胞体积较小且不具有贴壁特性，如果细胞未正确贴附，则荧光显微镜成像所获得的信息会较差或图像质量较低。
该方案若结合高质量的共聚焦显微镜分析，相较于薄层色谱等神经节苷脂检测技术具有显著优势，因其能够揭示治疗过程中神经节苷脂的空间定位与动态变化例如， T细胞活化），从而获得具有生物学意义的数据11,12,13此外，该方案允许从少量CD4开始评估神经节苷脂的表达+ T细胞（2 x 104) 可用于优化重复次数或不同检测的数量6.
黏附后在洗涤和抗体染色过程中的细致操作对于维持细胞数量和完整性至关重要。由于CD4+ T细胞与盖玻片的结合较弱，因此在添加和移除溶液时必须格外小心；否则将导致细...

CD4+ T 细胞通过其效应功能协调免疫应答，该过程由抗原呈递细胞激活后启动1。研究激活过程中被调控的细胞机制，有助于深入了解免疫功能的基本过程。然而，对初始型 CD4+ T 细胞的研究可能较为复杂，因为它们在外周血中仅占极小的细胞群体2。
已有多个研究报告利用荧光显微镜研究了参与CD4+ T细胞活化的不同分子的定位，主要集中在与质膜相关的蛋白质3。神经节苷脂是一类含唾液酸的鞘糖脂，尽管其在神经细胞中含量丰富且已被广泛研究，但其他细胞（如免疫细胞）也表达具有重要生物学功能的神经节苷脂4,5。我们先前报道过，在人初始CD4+ T细胞活化过程中，α2,8-唾液酸转移酶ST8Sia 1（GD3合成酶）和GM2/GD2合成酶表达上调，导致细胞表面显著新生表达GD2神经节苷脂，并上调GD3神经节苷脂的表达6。进一步研究GD3、GD2及其他神经节苷脂在免疫细胞中的作用，有助于补充仅基于蛋白质视角的免疫功能认识。
通常，神经节苷脂表达的研究依赖于薄层色谱法（Thin Layer Chromatography, TLC）7等技术，但该方法无法实现神经节苷脂在质膜或亚细胞区室中的空间定位，从而限制了生物学分析。
本研究中，我们描述了一种通过抗体介导的方法，在抗CD3/抗CD28激活后，对人初始CD4+ T细胞和外周血单个核细胞（PBMCs）中的GD3和GD2神经节苷脂进行鉴定与定位的实验方案。该方案还可用于分析悬浮状态下少量细胞中神经节苷脂的基因及分子表达水平，并能够获得高质量的图像6，尤其考虑到淋巴细胞体积较小（9 µm）的特点。

<table><tbody><tr><td>高级 RPMI 1640&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12633-012</td><td>添加 3% FBS</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD3 抗体</td><td>eBioscience</td><td>16-0037-81</td><td>OKT3 克隆</td></tr><tr><td>小鼠抗人 CD28 抗体</td><td>ebioscience</td><td>16-0288-81</td><td>CD28.6 克隆</td></tr><tr><td>小鼠抗人 GD3&amp;nbsp; 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab11779</td><td>R24 克隆</td></tr><tr><td>小鼠抗人 GD2 抗体</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53831</td><td>14G2a 克隆</td></tr><tr><td>FITC 标记的抗小鼠 IgG3&lt;br/&gt; 抗体</td><td>Abcam</td><td>ab97259</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a 抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 标记的抗小鼠</td><td>Thermo Fisher Scieni&amp;iexcl;tific</td><td>A-21241</td><td></td></tr><tr><td>IgG2a 抗体</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 333258</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>861405</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Ficoll Paque-Plus</td><td>GE</td><td>17-1440-02&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol 试剂</td><td>Invitrogen</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>人初始型 CD4+ T 细胞分离试剂盒 II</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-094-131</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>分选&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Nunc Lab-tek 培养皿载玻片系统</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7182</td><td></td></tr><tr><td>Olympus FV 1000 激光共聚焦显微镜 (Olympus)&amp;nbsp;</td><td>Olympus</td><td></td><td>直立式 BX61WI 和 IX81&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>GD3 合成酶正向序列引物</td><td>5&amp;acute;-GAGCGTTCAGGAAACAAATGG- 3&amp;acute;</td><td></td><td>参考文献 7</td></tr><tr><td>GD3 合成酶反向序列引物</td><td>5&amp;acute;-CCTGTGGGAAGAGAGAGTAAG-3&amp;acute;</td><td></td><td>参考文献 7</td></tr><tr><td>GM2/GD2 合成酶正向序列引物</td><td>5&amp;acute;-CAACACAGCAGACACAGTCC-3&amp;acute;</td><td></td><td>参考文献 7</td></tr><tr><td>GM2/GD2 合成酶反向序列引物</td><td>5&amp;acute;-GTGGCAATCGTGACTAGAGC-3&amp;acute;</td><td></td><td>参考文献 7</td></tr></tbody></table>

cd4+ t细胞的制备及其用于显微镜分析gd3和gd2神经节苷脂膜表达

Preparation of CD4+ T Cells for Analysis of GD3 and GD2 Ganglioside Membrane Expression by Microscopy

本文所述方法用于激活初始CD4+ 悬浮状态下的T细胞及其在盖玻片上的黏附，可用于共聚焦显微镜分析，以实现对参与CD4功能的神经节苷脂进行空间定位与可视化观察+ T细胞活化，以及通过流式细胞术、蛋白质印迹或实时PCR等方法进行的补体表达谱分析实验。利用具有高亲和力和特异性的抗神经节苷脂抗体，可通过流式细胞术定量检测神经节苷脂的表达水平，并通过显微镜观察其细胞内定位。然而，对悬浮细胞进行适当处理时，需对培养板进行相应处理，以促进细胞贴附，满足荧光或共聚焦显微镜成像的需要。在本研究中，我们描述了一种用于检测初始CD4⁺ T细胞中GD3和GD2神经节苷脂的表达及其与TCR共定位的实验方案。+ T细胞活化。此外，使用实时PCR实验 &#60;40,000个细胞即可用于GD3及GM2/GD2合酶基因的分析，表明基因分析实验可在细胞数量较少的情况下进行，且无需额外使用低输入量RNA试剂盒。

本论文所述方案可获得高质量的培养后静息态和活化态人初始CD4+ T细胞（图1）。与静息状态相比（图1A），活化的CD4+ T细胞表现出典型的增殖特征（图1B）。通过共聚焦显微镜观察，CD25晚期活化标志物可用于评估72小时时的高效活化情况（图1C）。CD69标志物目前常用于流式细胞术或显微镜检测中的早期活化评估。静息态和活化态初始CD4+ T细胞在聚-L-赖氨酸包被的盖玻片上的贴附，有助于研究GD3和TCR的表达与定位，可通过抗GD3和抗TCR抗体双重标记实现（图2）。如我们先前报道，活化过程伴随细胞表面GD3和GD2神经节苷脂的重塑6。此外，从4 × 104个细胞中进行GD3及GM2/GD2合成酶的基因表达定量分析（图2和图3）...

我们描述了一种用于显微镜检测的标准化抗体染色方案，用于确定静息和活化的人类初始CD4+ T细胞中神经节苷脂的膜表达及定位。此外，还介绍了使用&#60;40,000个细胞进行的实时PCR实验，该实验无需额外的低输入RNA试剂盒。

CD4+ T细胞的制备及其用于显微镜分析GD3和GD2神经节苷脂膜表达

本文所述方法用于在悬浮状态下激活初始型CD4+ T细胞，并使其黏附于盖玻片，以便进行共聚焦显微镜分析……

本实验方案的总体目标是演示如何制备少量细胞的CD4+T细胞悬液，用于染色以观察细胞表面GD3和GD2神经节苷脂的定位。该方法适用于少量小型悬浮细胞（如单个核细胞）中膜糖脂的可视化。该技术的主要优势在于通过优化样本使用，可在少量CD4+T细胞中评估神经节苷脂的表达及其定位情况。该技术的应用可能拓展至某些类型的T细胞白血病的研究与诊断。我们已发现，某些白血病细胞系会上调GD3和GD2神经节苷脂的表达。首先，将2 mL健康人供体的外周血与2 mL无菌PBS EDTA混合稀释。将稀释后的血液缓慢加至3毫升密度为1.077的蔗糖溶液上方。随后，在21摄氏度下以250 × g离心30分钟，不启用刹车，以形成外周血单个核细胞梯度。离心后，外周血单个核细胞可见为明显的白色环状层。用移液器收集外周血单个核细胞（PBMCs），转移至无菌管中进行洗涤。用含EDTA的磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞后，使用市售试剂盒通过磁珠负向选法纯化初始CD4+T细胞。当获得纯度大于95%的CD4+T细胞群体后，向24孔细胞培养板的每孔中加入250微升含5微克/毫升抗CD3单克隆抗体的PBS溶液，以准备培养板。将培养板在37摄氏度下孵育至少两小时。孵育结束后，从板中移除抗CD3抗体稀释液，并用无菌1×PBS洗涤两次。随后，用添加了补充物的高级RPMI 1640培养基稀释初始CD4+ T细胞，使其密度达到每毫升1×10⁶个细胞。接下来，将500 µL稀释后的细胞加入已包被抗CD3抗体的24孔板孔中。然后通过加入1 µg/mL抗CD28抗体，完成对已包被抗CD3抗体孔中初始CD4+ T细胞的刺激。将静息和活化的CD4+ T细胞在37°C、5% CO₂条件下孵育0至72小时。孵育时间结束后，从24孔板中收集静息和活化的初始CD4+ T细胞。进行细胞计数，必要时用新鲜的完全培养基将细胞稀释至浓度为1 × 10⁶ 个细胞/毫升。取500微升稀释后的细胞悬液接种至含有聚-L-赖氨酸包被盖玻片或载玻片腔室的24孔板孔中，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育至少六小时。孵育结束后，CD4+ T 细胞将贴附在盖玻片上。小心移除孔中的培养基，然后缓慢加入 500 微升无菌 PBS。洗涤过程中加入 PBS 时应格外小心，尤其是当每孔细胞数少于 50,000 时所用的载玻片培养 chamber。吸去 PBS，向孔中加入另外 500 µL PBS，以彻底去除培养基。完全移除 PBS 后，加入 500 µL 过滤的 4% 多聚甲醛，室温孵育 30 分钟以固定细胞。固定完成后，移除固定液，并用 PBS 至少洗涤两次。如有需要，可将培养板每孔加入 500 微升 PBS 后，在 4 摄氏度保存数天。首先，移除固定细胞中的 PBS，每孔加入 500 微升冷封闭缓冲液，在冰上孵育 20 分钟。孵育期间切勿剧烈振荡培养板，以免导致细胞脱

preparation-cd4-t-cells-for-analysis-gd3-gd2-ganglioside-membrane

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

CD4的制备<sup&gt; +</sup&gt; T细胞通过显微镜分析GD3和GD2神经节苷脂膜表达的

本实验展示了从全外周血中纯化并体外扩增抗原特异性CD4+ T细胞，以及利用MHC II类四聚体对其进行可视化检测的方法。四聚体技术能够直接可视化具有单一抗原特性和明确MHC...

使用MHC II类四聚体可视化抗原特异性CD4+ T细胞

本视频展示了粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）分泌型辅助性T细胞（THGM）的体外分化过程。分离得到的初始T细胞经刺激后分化为THGM细胞，通过检测细胞内高水平的GM-CSF产生以及低水平的其他辅助性T细胞特异性细胞因子表达，确认其分化成功。...

一种体外诱导初始T细胞分化为产生GM-CSF的辅助性T细胞的技术

本视频展示了通过基于荧光的检测方法筛选免疫调节化合物。用这些化合物处理表达绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的转基因小鼠来源的T淋巴细胞。增强或减弱的GFP信号可分别用于识别这些化合物的刺激或抑制作用。...

一种基于荧光的检测方法：利用基因工程淋巴细胞筛选免疫调节化合物

本视频展示了一种用于分析处于不同细胞周期阶段的抗原特异性CD8+...

一种用于抗原特异性CD8+ T细胞细胞周期分析的检测方法

利用表达柯萨奇腺病毒受体的转基因技术，通过腺病毒介导的基因转移将外源基因导入初始CD4 T细胞，可实现对调节性T细胞分化的分子机制分析 体外.

腺病毒转导初始CD4 T细胞以研究调节性T细胞分化

巨噬细胞是造血系统中具有可塑性的细胞，在保护性免疫和内环境稳态中发挥关键作用。在本报告中，我们描述了优化的 体外...

功能鉴定抑制移植物反应性免疫的调节性巨噬细胞

本文介绍一种分离人子宫颈管上皮内淋巴细胞的方法，用于分析上皮内的γδ T细胞。该方案可通过磁珠或细胞分选技术进一步扩展，以纯化子宫颈管γδ...

人子宫颈管γδ T细胞的分离与流式细胞术分析

本方案通过流式细胞术分析成年小鼠中枢神经系统中的巨噬细胞亚群，有助于研究这些细胞表达的多种标志物。...

通过流式细胞术分析中枢神经系统中的小胶质细胞和单核细胞来源的巨噬细胞

神经节苷脂是一类含唾液酸的鞘糖脂，在脑组织中尤为丰富。由于其两亲性，需要采用有机相/水相萃取和纯化技术，以确保获得最佳回收率和准确的分析结果。本文概述了分析级和制备级规模的神经节苷脂提取、纯化及薄层色谱分析方法。...

神经节苷脂的提取、纯化与分析

本研究介绍了一种应用于儿童弥漫性中线胶质瘤细胞系的活细胞三维免疫细胞化学技术方案，可用于实时研究动态过程（如三维细胞侵袭和迁移）中细胞质膜上蛋白质的表达情况。...

儿童弥漫性中线胶质瘤的活体三维细胞免疫细胞化学检测

本文介绍了使用脂质双层支撑微球逐步重建合成抗原呈递细胞的方案，以及利用该系统检测活化T细胞突触输出的方法。...

制备用于研究T细胞免疫突触颗粒输出的珠载脂质双层

学习利用抗体染色和显微镜技术可视化人源CD4+ T细胞表面的GD3和GD2神经节苷脂定位。该方法适用于少量细胞样本，有助于T细胞白血病研究和诊断。

CD4⁺ T细胞的制备及其用于显微镜分析GD3和GD2神经节苷脂膜表达

探索更多视频