体外记录小鼠空肠和结肠节段肠系膜传入神经活动

该技术的总体目标是记录离体状态下单个空肠或结肠神经束在梯度扩张刺激及化合物作用下的内脏传入神经活动。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如支配胃肠道的传入神经在不同疾病状态下是否出现敏感性增高或降低。该技术的主要优势在于，可在离体条件下记录神经放电活动，并能够在不受中枢神经系统调节或输入影响的情况下对神经活动进行定量分析。

该技术的应用可延伸至多种疼痛综合征（如肠易激综合征）的治疗或诊断，因为神经敏化在其发病机制中起着重要作用。通常，初学者会面临困难，因为神经束的分离以及记录信号的单单位分析需要大量训练才能掌握。开始此操作时，将处死的小鼠置于仰卧位。

使用手术刀从剑突延伸至耻骨联合，切开皮肤和腹肌层，进行腹部正中切口。随后，用冷克雷布斯液冲洗腹腔，以防止腹腔内组织干燥。然后，用锐利的剪刀迅速切除整个空肠，从十二指肠空肠曲开始，切除约20厘米的小肠段。

注意避免损伤周围结构，并保持含有空肠血管和传入神经的肠系膜完整。随后，将切除的空肠置于冰上预冷的克雷布斯（Krebs）溶液中，并持续用碳酰氧混合气（Carbigen）供氧。然后，将空肠切成约三厘米长的肠段。

在相应肠段的中央附近找到包含血管和内脏神经的肠系膜束，以便于将肠段安装到记录室中。随后使用钝头导管以克氏液冲洗每个肠段，以清除管腔内容物和食糜，因为这些物质含有消化酶，会加速组织样本在体外的降解。之后，选取一段用于测量传入神经活性的肠段，并将其置于带有硅胶弹性层编码的记录室中。

将记录 chamber 中的 Krebs 液温度保持在 34 摄氏度。然后将空肠段安装到器官浴槽中，使口腔端连接提供管腔灌流的注射泵，而肛门端连接流出管路。轻轻拉伸肠段，但注意不要施加过大的张力。

用丝线将两端牢固地结扎在进出液端口上。随后，将注射泵连接至口腔端，以每小时10毫升的速度向空肠节段腔内灌注Krebs溶液。将固定肠段的肠系膜平铺并用针固定在硅胶弹性体底层上。

然后，将肠系膜展开，以优化肠系膜束的可视化效果。接下来，通过关闭出口端口，使肠段内的管腔压力达到60毫米汞柱，进行梯度扩张测试，以确认安装的肠段无管腔内克雷布斯液泄漏。观察管腔内压力是否平稳上升，无中断现象。

在初始扩张阶段，预计该肠段会出现轻微收缩。如有需要，可在克雷布斯液中加入1微摩尔的L型钙通道阻滞剂硝苯地平，以抑制蠕动活性。在体视显微镜下，用两把小镊子轻轻牵拉肠系膜上的脂肪组织，逐步将其剥离，注意避免损伤埋藏在脂肪组织中的血管和传入神经。

从距空肠较远的位置开始剥离脂肪组织，以暴露肠系膜束内的两条血管。在两条血管之间辨认出位于脂肪组织内的一条细白色丝状结构，即为空肠传入神经。随后用镊子轻柔地剥离脂肪组织，向空肠方向近端进一步游离该神经。

接下来，通过去除附着在神经上的脂肪组织，分离该肠段的空肠系膜神经。使用锋利的组织剪将神经横断。如有需要，可轻轻牵拉，以剥离残留的脂肪和结缔组织以及神经外膜。

在此操作中，使用显微操作器将吸电极的尖端缓慢放入器官浴槽内。然后，轻柔地从器官浴槽中吸取少量克雷布斯溶液，使电极尖端浸没在克雷布斯溶液中。确保克雷布斯溶液覆盖吸电极内部的导线电极。

接下来，将吸电极的尖端紧靠横断的感觉神经束，并将横断的神经束全长吸入毛细管内。移动电极尖端靠近脂肪组织，用活塞将其吸入玻璃毛细管中，从而在机械上将神经与器官浴液内容物隔离开。通过吸入部分周围脂肪组织来实现玻璃毛细管与记录腔之间的充分密封，这对于最大限度减少冗余背景噪声至关重要，此类噪声最终会影响后续分析。

为验证传入神经活动的记录，可通过关闭输出端口使肠段内压力逐渐升高，从而引起传入神经放电的梯度性增加。只有当连续三次梯度扩张均产生可重复的多单位放电时，方可进行预定的实验方案。在神经分离后，需将标本稳定15分钟，以获得稳定的自发性传入神经活动，然后再开始正式实验。

此处展示的是基于不同传入神经纤维单位机械敏感特性的示意图。低阈值纤维主要在较低扩张压力下表现出神经活动增加，其低阈值（LT）比例超过55%；相反，高阈值单位仅在有害压力下才表现出放电频率的增加。宽动态范围纤维在整个扩张过程中神经活动呈渐进性增加，而机械不敏感纤维则对逐渐增加的扩张压力无反应。

该图显示了野生型小鼠在梯度扩张过程中肠系膜传入神经的放电情况。请注意，在双相扩张曲线中，神经放电的初始上升是由低阈值和宽动态范围纤维引起的，而高阈值和宽动态游戏副本纤维则介导了第二次放电的增加。一旦掌握操作技巧，若操作得当，空肠神经的分离及初始基线记录可在一小时之内完成。

当研究向器官浴中给予化合物的效果时，需要更多的时间。在进行该操作时，重要的是始终采用标准化的方法，例如在所有实验中 consistently 确定相同的组织段。完成该操作后，可进一步开展其他方法，如分离背根神经节并进行后续的钙成像，以评估胃肠道神经系统中哪些中继站参与了多种疾病的发病机制。

该技术发展之后，为神经科学领域的研究人员探索胃肠道研究中多种疼痛综合征的发病机制铺平了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何从小鼠胃肠道中分离空肠传入神经，并在梯度扩张过程中记录其电活动。