通过可调纳米孔中纳米颗粒跨膜迁移速度测定Zeta电位：以DNA修饰颗粒为例

本实验的总体目标是利用可调电阻脉冲传感技术（TRPS）表征纳米颗粒的表面化学性质，并测定材料的泽塔电位。本研究通过表征经DNA修饰的纳米颗粒来展示该方法的应用。该方法有助于解答纳米材料表征及生物分析方法开发中的关键问题。

该技术的主要优势在于可实现逐个颗粒的分析。每个DNA颗粒信号均可转化为相应的Zeta电位测量值，从而提供被分析样品的完整信息。最早的方法可为材料的表征提供一定见解。

该方法还可应用于其他领域，例如用于检测细胞、病毒、DNA和蛋白质的生物测定方法的开发。通常，初次接触该方法的研究人员会遇到困难，因为该方法并非简单地将样品注入后等待结果即可，而是需要科学家进行一定的干预和操作。

开始此实验步骤时，先将链霉亲和素包被的微粒涡旋振荡30秒，随后在80瓦功率下超声处理2分钟，以确保微粒的单分散性。用PBST缓冲液将链霉亲和素包被的微粒按1:100比例稀释，使最终浓度达到每毫升1×10⁹个微粒。然后将微粒再次涡旋振荡30秒。

根据结合能力，在适当的DNA浓度下，每毫克颗粒可结合4,352皮摩尔，对应的DNA终浓度分别为10、20、30、40、47、95、140和210纳摩尔。将样品涡旋振荡10秒后，置于室温下的旋转摇床上30分钟，使DNA通过链霉亲和素-生物素相互作用结合到颗粒表面。在捕获DNA加入并与颗粒孵育后，将样品置于磁力架上30分钟，通过磁分离去除未结合的DNA及溶液。

随后，移除上清液，注意不要扰动靠近磁铁新形成的颗粒聚集体。然后用相同体积的新鲜 PBST 缓冲液替换上清液。现在向每个样品中加入所需量的目标 DNA，以确保达到尽可能最大的目标结合量。

将样品涡旋振荡10秒，然后在室温下置于旋转轮上30分钟。杂交完成后，通过将样品放置在磁力架上30分钟进行磁分离，以去除过量的目标DNA。

接下来，移除上清液，注意不要扰动靠近磁铁新形成的颗粒聚集体。然后用相同体积的新鲜PBST缓冲液替换上清液。在对重复样品重复上述步骤后，将样品置于室温下的旋转轮上孵育16小时，以考察DNA杂交时间。

此时，将 TRPS 仪器连接至已安装软件的计算机系统。使用卡尺测量两个平行钳口外侧之间的距离。在仪器设置选项卡的拉伸字段中输入该距离，然后点击该选项卡下方的校准拉伸按钮。

随后，将适当尺寸的聚氨酯纳米孔膜横向安装至夹具上，确保纳米孔的ID编号朝上。然后通过仪器侧面的拉伸调节手柄，将夹具拉伸至分析所需的程度。在纳米孔下方的下部液池中加入80微升PBST缓冲液，确保无气泡存在，以免影响测量结果。

现在将上部流体池安装到位，并加入40 µL缓冲液，确保无气泡存在。然后将法拉第笼罩在系统上，并按照文本方案施加外部压力。将40 µL的校准颗粒加入上部流体池后，在三个不同的施加电压下完成一次TRPS测量。

通过点击软件中仪器设置选项卡内电压标度上的加号和减号按钮来调节电压。检查三种电压下是否产生相应的背景电流，并确保在中等电压下，校准颗粒产生的平均阻断幅度至少为 0.3 纳安。

当达到文本方案中所述条件后，在数据采集选项卡的软件中点击“开始”以启动运行。完成测量时，在数据采集选项卡中点击“停止”，并保存数据文件。通过将上部流体池中的校准颗粒多次更换为40 µL PBST缓冲液，清洗系统。

施加不同压力，直至不再出现阻断事件，以确保无残留颗粒和交叉污染。达到适当的基线电流后，将上部流体池中的电解液更换为40微升样品。在数据采集选项卡中点击“开始”，启动样品运行。

至少记录 500 个颗粒，并确保运行时间不少于 30 秒。要完成测量，请在数据采集选项卡中点击“停止”，并保存数据文件。此处展示了未进行修饰的链霉亲和素包被颗粒，以及表面饱和结合单链 DNA 的链霉亲和素包被颗粒的粒径和泽塔电位分析示例。

尽管两种样品的粒径相似，但当DNA被功能化至颗粒表面时，其ζ电位显著不同且明显更大。此处展示了与链霉亲和素包被颗粒杂交的最低和最高浓度DNA样品的粒径和ζ电位数据。与较高浓度DNA杂交的颗粒记录到更大的ζ电位值。

此处展示了仅含捕获探针DNA、完全互补DNA靶标、中间结合DNA靶标、末端结合DNA靶标以及突出端DNA靶标的zeta电位变化。一旦掌握，若操作得当，该技术可在20分钟内完成。在进行该实验时，重要的是每次校准和样品检测之间必须彻底清洗纳米电极，以确保样品间无交叉污染，并防止纳米电极发生堵塞。

该技术问世后，为生物传感领域的研究人员探索多重检测中的蛋白质-蛋白质及蛋白质-DNA相互作用开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用TRPS测定泽塔电位，以及如何制备用于生物检测的DNA修饰颗粒。