Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

该程序的总体目标是测量从 HIV-1 感染的 SupT1 细胞中分离的预整合复合物或 PIC 的体外整合活性。这种方法将回答 HIV 生物学中的一些关键问题，特别是某些宿主因子和病毒因子（例如病毒衣壳）如何在 HIV-1 DNA 整合中发挥作用，这样做将有助于我们设计或确定抗逆转录病毒治疗的新靶点。这种方法的主要优点是它需要相对少量的预整合复合物或 PIC 准备，用于测量体外整合活性。

该技术的含义可以扩展到 HIV-1 艾滋病的诊断和治疗，这是因为该技术的早期版本在 HIV-1 整合酶抑制剂的发现中至关重要，HIV-1 整合酶抑制剂是当今临床使用的主要抗 HIV 药物之一，因此该方法不仅可以用于了解 HIV-1 整合， 但它也可以用于研究其他逆转录病毒，例如 RSV 和 MLV。演示该协议的是实验室的博士后研究员 Muthukumar Balasubramaniam 博士。要用 HIV-1 感染 SupT1，在 BSL-2 实验室中，在 Roswell Park Memorial Institute 或补充有 10% FBS 和 Pen-Strep 的 RPMI 培养基中，将 SupT1 细胞维持在每毫升 10 至 6 个细胞的 1 到 2 倍之间。

根据文本方案产生高滴度的传染性 HIV-1 后，从培养瓶中汇集 SupT1 细胞，通过移液充分混合，并在血细胞计数器中使用台盼蓝排除染色来确定活细胞计数。在 50 毫升锥形离心管中，将每次病毒感染 106 个细胞分装 8 乘以 106 个细胞，然后在 500 倍 g 和 25 摄氏度的摆动桶式转子中离心细胞 5 分钟。在不去除细胞培养基的情况下，将含有沉淀细胞的试管转移到 BSL-3 实验室进行进一步处理，然后小心地从试管中吸出培养基，不要干扰沉淀。

接下来，向细胞中加入 30 毫升 DNase I 处理的病毒接种物，轻轻移液混合，然后将混合物均匀分布在两个六孔组织培养板之间。对于离心接种，将培养板放在板托架中，并在 480 倍 g 和 25 摄氏度的水平桶转子中离心 2 小时，然后在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞 5 小时。为了收获和裂解感染的细胞，将与每种感染相对应的细胞汇集到 50 毫升锥形离心管中。

细胞在 300 x g 和 25 摄氏度下离心 10 分钟，然后小心吸出或移液上清液。要去除任何残留的病毒颗粒，通过加入 2 毫升缓冲液 K minus minus 洗涤每个沉淀，然后再次旋转样品，然后在不干扰沉淀的情况下，通过抽吸或用移液管小心去除上清液，然后再重复洗涤一次。用微量移液管小心去除任何残留缓冲液后，使用冰冷的裂解缓冲液 K plus plus 轻轻地重悬每个沉淀并转移到 2 毫升微量离心管中。

要制备细胞质预整合复合物 （PIC），请在室温下振荡样品 10 分钟，然后将试管放入预冷至 4 摄氏度的转子中，并以 1， 500 倍 g 和 4 摄氏度离心 4 分钟。在不干扰沉淀的情况下，小心地将上清液转移到新鲜的微量离心管中，并以 16， 000 倍 g 和 4 摄氏度旋转 1 分钟。小心地将上清液转移到新鲜的微量离心管中，然后加入 RNase A 至终浓度为 20 μg/mL，并在室温下孵育内容物，不要摇晃 30 分钟。

加入终浓度为 7% 的蔗糖，轻轻移液充分混合，然后在微量离心管中制备 PIC 的等分试样。在液氮中速冻，并置于负 80 摄氏度的冰箱中长期储存。为了制备体外整合或 IVI 测定中使用的靶 DNA，使用定制的引物 phiX174-Forward 和 phiX174-Reverse 组装 PCR 混合物以从 phiX174 质粒 DNA 中扩增 2.0 kb 区域，并根据文本方案使用该程序进行 PCR。

凝胶纯化和分装样品后，将 600 ng 靶标 DNA 添加到 200 μL PIC 中。充分混合并在 37 摄氏度下孵育 45 分钟。通过添加 SDS、EDTA 和蛋白酶 K 终止 IVI 反应，然后彻底混合反应内容物并在 56 摄氏度下孵育过夜。

第二天，为了从 IVI 反应中纯化总 DNA，向脱蛋白样品中加入等体积的苯酚。涡旋剧烈混匀，离心 2 分钟。在重复苯酚提取之前，小心地去除上层水相并将其转移到新试管中，然后加入等体积的 1 比 1 苯酚氯仿。

涡旋混合样品，将试管离心 2 分钟，然后将上层水相转移到新试管中。根据文本方案用氯仿提取后，通过添加每微升糖原 0.1 μg、0.3 摩尔乙酸钠和 2.5 体积冰冷的 100% 乙醇，从水相中沉淀 DNA。将试管置于零下 80 摄氏度过夜。

第二天，将样品以 16， 000 倍 g 和 4 摄氏度离心 30 分钟，然后小心去除上清液，不要干扰沉淀。为了进行 PCR 以定量 PIC 活性，从第一轮常规 PCR 开始，使用靶向病毒 LTR 和 phiX174 DNA 的引物来扩增整合的 HIV-1 DNA 的连接。如图所示，将预混液减去模板 DNA 组装，然后将 45 μL 等分试样分配到单独的 PCR 管中，并加入 5 μL 模板 DNA 或不含核酸酶的水作为对照。

使用文本方案中概述的程序在热循环仪中运行反应，然后进行第二轮定量 PCR 并根据文本方案分析数据。在该 IVI 测定中，用 DNAse I 处理的 HIV-1 以及 HIV-1 整合酶抑制剂 Raltegravir 的存在或存在对 SupT1 进行离心。孵育后，分离 PIC 并分析纯化的 DNA 以整合病毒 DNA。

如此处所示，HIV-1 PIC 将相关的病毒 DNA 稳健地整合到靶 DNA 中，并且在补充 Raltegravir 的反应中，PIC 的 IVI 效率大大降低，这强烈暗示了该测定中测量的与 HIV-1 整合酶的整合活性。对照反应未显示任何整合活性。此外，在第一轮 PCR 中排除 Taq 聚合酶的对照没有扩增整合产物。

值得注意的是，来自单独 PIC 对照的数据表明，巢式 qPCR 策略专门测量整合的病毒 DNA，而不是 PIC 相关的病毒 DNA。总的来说，这些数据展示了与 PIC 相关的集成活动。一旦掌握，用于定量 PIC 活性的病毒制备和 PCR 检测即可在一周内完成。

SupT1 细胞的感染和从受感染细胞中分离 PIC 可以在一天内完成。观看此视频后，您应该对如何分离 HIV-1 PIC 并测量体外整合活性有很好的了解。不要忘记，与高滴度的传染性 HIV-1 一起工作可能非常危险，在执行此程序时应始终采取适当的预防措施，包括围裙和长袍等防护服、双层手套和防护眼镜。