Name: 测量体外 HIV-1 Preintegration配合物的整合活动 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: 了解体外测量HIV-1前整合复合物整合活性的方法。该技术使用急性感染的SupT1细胞胞质提取物，通过实时定量PCR检测病毒DNA整合，为抗逆转录病毒治疗靶点研究提供重要工具。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

本工作部分由美国国家药物滥用研究所/国立卫生研究院（NIDA/NIH）授予 CD 的资助 DA024558、DA30896、DA033892 和 DA021471 支持。我们还感谢由国家研究资源中心/国立卫生研究院（NCRR/NIH）资助的 RCMI 项目 G12MD007586、范德堡临床与转化科学奖（CTSA）项目 UL1RR024975、梅哈里转化研究中心（MeTRC）CTSA 项目 U54 RR026140、国家少数族裔健康与健康差距研究所/国立卫生研究院（NIMHD/NIH）资助的 U54 项目 MD007593，以及田纳西临床艾滋病研究中心（CFAR）项目 P30 AI110527 的支持。

1. 病毒制备
注意：为了产生高滴度的感染性 HIV-1，使用激活的树状聚合物转染试剂将感染性 HIV-1 分子克隆转染至人胚胎肾（HEK）细胞系 293T。据观察，磷酸钙转染法可获得相当的结果。
<ol>
	<li>在生物安全二级（BSL2）实验室中，将每10 cm培养皿3 × 106个293T细胞接种于8 mL添加了10%胎牛血清（FBS）、青霉素和链霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中。将细胞置于37 °C、5% CO2的培养箱中过夜培养。</li>
	<li>次日，为转染每个10 cm培养皿中的细胞，将8 µg pNL4-3质粒DNA（见材料表）用不含血清和抗生素的DMEM稀释至终体积300 µL。加入80 µL转染试剂，用移液器充分混匀，在室温&#160;孵育5–10分钟，以形成转染复合物。</li>
	<li>通过抽吸去除培养皿中的培养基，并向每个培养皿中加入7 mL含血清和抗生素的新鲜DMEM。</li>
	<li>向转染复合物中加入1 mL含血清和抗生素的DMEM，用移液器混匀，然后将此混合液加入细胞中。轻轻摇动培养皿，以促进转染复合物均匀分布。</li>
	<li>立即将细胞转移至生物安全三级（BSL3）实验室，置于37 °C、5% CO2的培养箱中继续培养48小时。</li>
	<li>用移液器收集含有病毒的组织培养上清液，转移至离心管中。以300 × g离心5分钟，沉淀细胞和碎片，随后通过0.45 µm孔径的一次性注射器滤器过滤上清液。</li>
	<li>为消除该无细胞病毒制备物中可能残留的质粒DNA，使用DNase 1（20 µg/mL）在37 °C处理1小时。</li>
	<li>为定量HIV-1滴度，可采用p24特异性的酶联免疫吸附测定法（ELISA），因其是一种适用于常规使用的快速且便捷的方法22。 
	注意：需注意p24 ELISA测定的是物理滴度（病毒颗粒数量）。 alternatively，测定病毒相关逆转录酶活性（外源性RT测定）或病毒感染性（基于TZM-bl指示细胞系的感染性测定）可特异性反映具有感染能力的病毒颗粒数量。</li>
</ol>
2. Sup-T1 细胞的病毒感染（BSL3 实验室）
<ol>
	<li>在BSL2实验室中，将Sup-T1细胞维持在1.0 x 106 和 2.0 × 106&#160;以每毫升细胞数计，在添加了10%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基中培养，每2至3天按1:2的传代比例进行传代。收集培养瓶中的Sup-T1细胞，用移液器轻轻吹打混匀，使用血细胞计数板结合台盼蓝排斥染色法测定活细胞数量。
	<ol>
		<li>准备所需数量的80 x 106 细胞（每病毒侵染）于50&#160;mL 圆锥形离心管</li>
		<li>在摆动桶转子中离心细胞&#160;在 500 × g 和 25 ℃ 下 &#176;C 下 5 分钟。不移除细胞培养基，将含有细胞沉淀的管子转移至 BSL3 实验室进行后续处理。小心吸除管中的细胞培养基，避免扰动细胞沉淀。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向管中的细胞加入适量经DNase I处理的病毒接种物，轻轻吹打混匀。对于80 x 106 细胞，请使用 30 mL 经 DNase I 处理的病毒（50 &#181;p24等量病毒的g数 
	注意：分离具有功能的前整合复合物（PIC）需要以非常高的感染复数（MOI）感染靶细胞。</li>
	<li>将混合物均匀分配至两个6孔组织培养板中（即&#160;12 份 2.5 mL 分装；每项感染使用 2 块培养板。</li>
	<li>对于自旋接种，将培养板放入板架中，使用摆动桶转子在480 × g和25℃下离心 &#176;C，2 小时。</li>
	<li>将接种后的细胞在37℃孵育 &#176;C 和 5% CO2 5小时。</li>
</ol>
3. 感染细胞的收获与裂解（BSL3 实验室）
<ol>
	<li>将每个感染样本对应的细胞从培养板中收集至一个50&#160;mL的锥形离心管中（总体积约30 mL）。</li>
	<li>在300 × g、25 °C条件下离心10分钟收集细胞，小心吸除上清液（也可使用移液器）。</li>
	<li>为去除任何残留的病毒颗粒，向每份细胞沉淀中加入2 mL缓冲液K-/-（150 mM KCl、20 mM HEPES，pH 7.6、5 mM MgCl2），在300 × g、25 °C条件下离心10分钟进行洗涤。随后，在不扰动沉淀的前提下，通过抽吸或移液器小心去除上清液。</li>
	<li>重复步骤3.3。</li>
	<li>使用微量移液器彻底去除残留缓冲液。将每份细胞沉淀重悬于2 mL预冷的裂解缓冲液K+/+ 中（即在缓冲液K-/-中添加0.025%的皂苷、1 mM DTT和20 µg/mL抑蛋白酶肽），轻轻吹打混匀内容物，然后转移至2&#160;mL微量离心管中。</li>
</ol>
4. 细胞质前整合复合物的制备（BSL3 实验室）
<ol>
	<li>在室温下于旋转摇床中轻轻摇动样品 10 分钟。</li>
	<li>将样品离心，转子预冷至4 &#176;C，于1,500 × g、4℃离心 &#176;C，4 分钟。</li>
	<li>在不扰动沉淀的前提下，小心地将上清液转移至新的微量离心管中，在 16,000 x g 和 4 °C 条件下离心 &#176;C，1 分钟。</li>
	<li>小心地将上清液转移至新的微量离心管中。加入RNase A（20 mg/mL），使其终浓度为20 &#181;g/mL (2 &#181;L，用于2 mL PIC），室温孵育30分钟（无需摇动）。</li>
	<li>加入蔗糖（60% w/v，溶于缓冲液 K 中）-/-) 至终浓度为7%，并用移液器轻轻吹打混匀。分装成等份（例如， 200 &#181;L）于微量离心管中，液氮速冻后置于-80 &#176;-80°C 超低温冰箱用于长期保存。</li>
</ol>
5. 体外&#160;使用HIV-1前整合复合物（PIC）的体外整合（IVI）实验
<ol>
	<li>通过使用定制引物 phiX174-F 和 phiX174-R 对 phiX174 质粒 DNA 进行 PCR 扩增，制备在体外整合（IVI）实验中使用的目标 DNA，获得一段 2.0 kb 的片段。
	<ol>
		<li>按照 表 1 中所述配制 PCR 反应体系。在热循环仪中进行 PCR，采用 表 2 推荐的热循环条件。使用凝胶纯化试剂盒（遵循制造商推荐的操作步骤）对 PCR 产物进行凝胶纯化，并将纯化后的目标 DNA 分装后于 -80 °C 保存，直至使用。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>向 200 µL 的前整合复合物（PICs）分装液中加入 600 ng 目标 DNA，充分混匀，于 37 °C 孵育 45 分钟。 
	注意：建议设置不添加目标 DNA 或添加整合酶抑制剂（例如，拉替拉韦）的 IVI 反应作为对照反应。</li>
	<li>通过加入 SDS、EDTA 和蛋白酶 K，使其终浓度分别为 0.5%、8 mM 和 0.5 mg/mL，以终止 IVI 反应。充分混匀反应体系，并于 56 °C 过夜孵育。</li>
	<li>次日，采用酚/氯仿抽提和乙醇沉淀法从 IVI 反应体系中纯化总 DNA。所有离心步骤均在 16,000 × g 和室温（RT）下进行。</li>
	<li>向去蛋白化样品中加入等体积的酚，剧烈涡旋混匀，离心 2 分钟。小心移除上层水相，并转移至新管中。</li>
	<li>重复步骤 5.5。将上层水相转移至新管中。</li>
	<li>加入等体积的 1:1 酚:氯仿混合液，剧烈涡旋混匀，离心 2 分钟。将上层水相转移至新管中。</li>
	<li>加入等体积氯仿，剧烈涡旋混匀，离心 2 分钟。将上层水相转移至新管中。</li>
	<li>为沉淀 DNA，加入终浓度为 0.1 µg/µL 的糖原、终浓度为 0.3 M 的 3 M 醋酸钠，以及 2.5 倍体积的预冷 100% 乙醇。涡旋混匀，短暂离心收集液体，将管置于 -80 °C 过夜（O/N）。</li>
	<li>次日，在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟。小心移除上清液，避免扰动沉淀。</li>
	<li>向沉淀中加入 500 µL 预冷的 80% 乙醇，在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 10 分钟。在室温下将 DNA 沉淀空气干燥，并完全重悬于 50 µL 无核酸酶水中。将 DNA 样品于 -20 °C 保存。</li>
</ol>
6. 用于定量PIC活性的PCR检测
注意：通过采用两组引物和两轮连续PCR的巢式PCR策略，对整合到靶DNA中的HIV-1 DNA拷贝数进行定量。
<ol>
	<li>使用靶向病毒LTR和phiX174 DNA的引物（分别为LTR引物和phiX174引物）进行第一轮常规PCR，以扩增整合的HIV-1 DNA连接区域。
	<ol>
		<li>按照所述方法配制第一轮PCR反应体系 表3. 将除模板DNA外的所有组分配制成主混合液，分装45-&#181;将等量样品分装至不同的PCR管中，并加入5 &#181;L 模板 DNA 或无核酸酶水（对照）。</li>
		<li>使用推荐的热循环条件，在热循环仪中进行PCR 表 4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用跨越病毒LTR短区域的引物（LTR-R和LTR-U引物）进行第二轮qPCR，选择性扩增第一轮PCR产物中的整合vDNA序列。为确定整合vDNA拷贝数，采用已知拷贝数的10倍系列稀释液生成标准曲线例如， 100&#160;- 108HIV-1 分子克隆的）
	<ol>
		<li>按照所述方法配制第二轮qPCR反应体系 表5. 除模板DNA外，将所有组分配制成主混合液，小心分装25&#160;&#181;将 L 分装至 96 孔 PCR 反应板中适当数量的孔内，然后加入 5 &#181;未纯化的第一轮PCR产物或无核酸酶水（对照）各取L。所有qPCR反应均设三个重复。</li>
		<li>将PCR板放入实时PCR仪中，并按照推荐的循环条件进行qPCR扩增 表6.</li>
		<li>使用合适的软件分析数据。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Sattentau, Q. J., Weiss, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD4+antigen%3A+physiological+ligand+and+HIV+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CD4 antigen: physiological ligand and HIV receptor.</a> Cell. 52 (5), 631-633 (1988).</li>
<li>Wilen, C. B., Tilton, J. C., Doms, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+HIV+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of HIV entry.</a> Adv Exp Med Biol. 726, 223-242 (2012).</li>
<li>Bowerman, B., Brown, P. O., Bishop, J. M., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nucleoprotein+complex+mediates+the+integration+of+retroviral+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A nucleoprotein complex mediates the integration of retroviral DNA.</a> Genes Dev. 3 (4), 469-478 (1989).</li>
<li>Bukrinsky, M. I., Sharova, N., Dempsey, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nuclear+import+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes.</a> Proc Natl Acad Sci. 9 (14), 6580-6584 (1992).</li>
<li>Hansen, M. S., Smith, G. J. 3rd, Kafri, T., Molteni, V., Siegel, J. S., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+complexes+derived+from+HIV+vectors+for+rapid+assays+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration complexes derived from HIV vectors for rapid assays in vitro.</a> Nature biotechnol. 17 (6), 578-582 (1999).</li>
<li>Farnet, C. M., Haseltine, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Integration of human immunodeficiency virus type 1 DNA in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (11), 4164-4168 (1990).</li>
<li>Fujiwara, T., Mizuuchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+structure+of+an+integration+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: structure of an integration intermediate.</a> Cell. 54 (4), 497-504 (1988).</li>
<li>Brown, P. O., Bowerman, B., Varmus, H. E., Bishop, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correct+integration+of+retroviral+DNA+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correct integration of retroviral DNA in vitro.</a> Cell. 49 (3), 347-356 (1987).</li>
<li>Lewinski, M. K., Bushman, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration--mechanism+and+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration--mechanism and consequences.</a> Adv Genet. 55, 147-181 (2005).</li>
<li>Engelman, A., Mizuuchi, K., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+DNA+integration%3A+mechanism+of+viral+DNA+cleavage+and+DNA+strand+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer.</a> Cell. 67 (6), 1211-1221 (1991).</li>
<li>Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+retroviral+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+rev+gen%22%5BJournal%5D)">Genetics of retroviral integration.</a> Ann rev gen. 26, 527-544 (1992).</li>
<li>Panganiban, A. T., Temin, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+terminal+nucleotides+of+retrovirus+DNA+are+required+for+integration+but+not+virus+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The terminal nucleotides of retrovirus DNA are required for integration but not virus production.</a> Nature. 306 (5939), 155-160 (1983).</li>
<li>Bieniasz, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+biology+of+HIV-1+virion+genesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+host+microbe%22%5BJournal%5D)">The cell biology of HIV-1 virion genesis.</a> Cell host microbe. 5 (6), 550-558 (2009).</li>
<li>Sherman, P. A., Fyfe, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+integration+protein+expressed+in+Escherichia+coli+possesses+selective+DNA+cleaving+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity.</a> Proc Natl Acad Sci. 87 (13), 5119-5123 (1990).</li>
<li>Katzman, M., Katz, R. A., Skalka, A. M., Leis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+avian+retroviral+integration+protein+cleaves+the+terminal+sequences+of+linear+viral+DNA+at+the+in+vivo+sites+of+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration.</a> J Virol. 63 (12), 5319-5327 (1989).</li>
<li>Craigie, R., Mizuuchi, K., Bushman, F. D., Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+in+vitro+assay+for+HIV+DNA+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+acid+res%22%5BJournal%5D)">A rapid in vitro assay for HIV DNA integration.</a> Nucl acid res. 19 (10), 2729-2734 (1991).</li>
<li>Bushman, F. D., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+human+immunodeficiency+virus+%28HIV%29+integration+protein+in+vitro%3A+specific+cleavage+and+integration+of+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 88 (4), 1339-1343 (1991).</li>
<li>Pauza, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+bases+are+deleted+from+the+termini+of+HIV-1+linear+DNA+during+integrative+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Two bases are deleted from the termini of HIV-1 linear DNA during integrative recombination.</a> Virology. 179 (2), 886-889 (1990).</li>
<li>Engelman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Meth Mol Biol. 485, 135-149 (2009).</li>
<li>Engelman, A., Oztop, I., Vandegraaff, N., Raghavendra, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+HIV-1+preintegration+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of HIV-1 preintegration complexes.</a> Methods. 47 (4), 283-290 (2009).</li>
<li>Addai, A. B., Pandhare, J., Paromov, V., Mantri, C. K., Pratap, S., Dash, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+modulates+HIV-1+integration+in+primary+CD4%2B+T+cells%3A+implications+in+HIV-1+pathogenesis+in+drug-abusing+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leuk+Biol%22%5BJournal%5D)">Cocaine modulates HIV-1 integration in primary CD4+ T cells: implications in HIV-1 pathogenesis in drug-abusing patients.</a> J Leuk Biol. 97 (4), 779-790 (2015).</li>
<li>Wehrly, K., Chesebro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p24+antigen+capture+assay+for+quantification+of+human+immunodeficiency+virus+using+readily+available+inexpensive+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents.</a> Methods. 12 (4), 288-293 (1997).</li>
</ol>

作者声明不存在任何竞争性财务和非财务利益。

对逆转录病毒前整合复合物（PIC）的生化分析为理解逆转录病毒DNA整合机制提供了关键见解。逆转录病毒PIC整合活性的检测可通过噬斑形成实验、Southern印迹分析以及巢式qPCR实现。噬斑实验的操作流程较为繁琐，且采用间接方法检测整合事件6,7,18。基于Southern印迹的检测方法虽可直接测量整合，但需要相对大量的PIC样品6,7,18。
本报告详细阐述了一种用于检测HIV-1前整合复合物（PIC）相关整合活性的巢式qPCR策略 体外该方法的主要优势和意义在于每反应所需PIC制备物的量相对较少4,<sup class="...

HIV-1 在靶细胞内的复制过程包含多个步骤，总体上可分为两个阶段：早期事件和晚期事件。早期事件始于 HIV-1 依次结合靶细胞表面受体 CD4 以及两种共受体之一（CCR5 或 CXCR4）1。随后，病毒与细胞膜发生融合，病毒衣壳（CA）核心被释放到细胞质中2。CA 核心包含病毒基因组单链 RNA（ssRNA）以及多种病毒来源和宿主来源的蛋白质。与 CA 相关的病毒蛋白包括逆转录酶（RT）和整合酶（IN），这两种酶在病毒复制早期事件中介导关键步骤。RT 和 IN 分别在核蛋白复合物——逆转录复合物（RTC）和前整合复合物（PIC）——的环境中发挥作用3,4,5,6。病毒 ssRNA 基因组末端含有位于独特序列 U5（5'端）和 U3（3'端）旁侧的末端重复（R）元件。RTC 将病毒 ssRNA 基因组转化为双链 DNA（dsDNA）拷贝（vDNA）。该逆转录过程还会复制 U5 和 U3 序列，从而在 vDNA 两端形成长末端重复序列（LTR）7,8。随后，与 PIC 相关的 IN 催化两个连续的生化反应，使 vDNA 整合到宿主染色体 DNA 中9,10,11。第一步，在细胞质中，IN 多聚体结合 vDNA 两端的 LTR12，并从每个 3'末端切除一个二核苷酸，此 3'末端加工过程在 vDNA 每个 3'末端（CAOH）生成一个羟基。接下来，PIC 转运至细胞核，IN 利用 vDNA 的 CAOH 作为亲核基团，以交错方式切割染色体 DNA 的两条链，同时将 vDNA 的两个末端共价连接至染色体 DNA 两条链上形成的磷酸二酯键。在这一链转移步骤之后，宿主细胞机制切除 vDNA 5'末端的两个未配对核苷酸，并修复整合位点连接处出现的单链缺口。因此，早期事件最终完成 HIV-1 基因组整合 DNA 拷贝（前病毒）的建立。前病毒为高效的病毒基因表达提供了适宜环境，从而启动晚期事件，包括病毒编码蛋白的表达、未成熟病毒的组装，以及出芽、释放并成熟为具有感染性的病毒颗粒13。
纯化的重组逆转录病毒整合酶具有执行 体外，对体外提供的类似长末端重复序列（LTR）的底物DNA同时具有3'端加工和链转移活性。利用此类纯化的重组IN进行的生化研究表明了vDNA整合的关键机制特征14,15,16,17。然而，与自然感染不同的是，这一 体外 生化反应不支持底物DNA两端同时整合到靶DNA中。相反，从急性感染细胞中分离出的逆转录病毒前整合复合物（PIC）能够将内源性vDNA的两端同时整合到异源靶DNA中。这促使该方法被广泛采用，并随之不断改进 I体外&#160;使用分离的天然前整合复合物进行的体外整合（IVI）实验。
在首次报道的逆转录病毒体外整合（IVI）检测中，感染携带E. coli supF基因（位于其长末端重复序列LTR中）的重组小鼠白血病病毒（MLV）的细胞所提取的胞质成分被用作整合酶（IN）活性来源，而一种在裂解生长方面存在缺陷的突变型λ噬菌体DNA则作为外源提供的靶DNA。重组MLV的DNA拷贝成功整合至噬菌体DNA后，伴随的supF基因表达恢复了重组噬菌体形成噬菌斑的能力。然而，该实验策略操作繁琐，且以间接方式测量整合事件。为克服这些局限，研究人员开发了一种基于Southern印迹的间接末端标记检测法，通过定量内源性病毒DNA整合到外源线性化的噬菌体phiX174 DNA中的水平，来评估前整合复合物（PIC）相关的IVI活性6,7,18。尽管该方法可直接测量整合事件，但仍需相对大量的PIC制备物，这在技术上仍具挑战性。为规避此问题，后续开发了仅需少量PIC的巢式PCR检测法4,5,19。
在本报告中，我们描述了一种更新的基于巢式PCR的体外方法，旨在重现自然感染过程中由HIV-1前整合复合物（PIC）介导的整合活性。该方法采用HIV-1感染靶细胞的胞质提取物作为内源性PIC活性的来源，并通过实时定量&#160;聚合酶链式反应（qPCR）进行检测。分离PIC及其整合活性检测的操作流程借鉴了Engelman实验室先前发表的方案20，并进行了修改。在该方法中，通过提供外源性线性靶DNA21启动与PIC相关的整合活性，整合反应产生的DNA产物经纯化后作为后续基于PCR定量分析的起始材料。在第一轮常规PCR中，使用特异性引物扩增病毒-靶DNA连接区域；在第二轮qPCR中，使用LTR特异性引物从第一轮PCR产物中特异性富集病毒DNA（vDNA）群体。有关该方法的详细描述，请参见实验方案部分。
体外 对逆转录病毒前整合复合物（PIC）的研究显著推动了我们对逆转录病毒DNA整合机制的理解，并促进了整合酶（IN）抑制剂的开发。鉴于近期对绘制HIV-1整合位点、确定病毒与宿主因子在HIV-1整合中的作用以及研发应对耐药性的新型抗病毒药物的关注日益增加，我们预计类似本报告所述的体外整合（IVI）检测方法将受到更广泛的关注和应用。这将进一步推动该方法的持续优化，从而拓展其应用范围。

<table><tbody><tr><td>&lt;p&gt;胎牛血清（FBS）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10437-028&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;热灭活胎牛血清（Hi-FBS）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10438-026&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基（DMEM）&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;11995-065&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 培养基&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;11875-093&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;磷酸盐缓冲液（PBS）（1×）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;20012-027&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;胰蛋白酶-EDTA（0.25%）&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;25200-056&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Cellgro/Mediatech&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;30-002-CI&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;HEK293T 细胞（293T）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;美国典型培养物保藏中心 (ATCC)&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CRL-3216&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;HIV-1 前病毒分子克隆 pNL4-3&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;美国国立卫生研究院艾滋病研究与参考试剂项目&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;114&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;PolyFect 转染试剂&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Qiagen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;301107&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;DNase 1&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Calbiochem/Merckmillipore&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;260913&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Sup-T1 细胞&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;美国典型培养物保藏中心 (ATCC)&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;CRL-1942&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;HEPES pH 7.2 - 7.5&lt;/p&gt; &lt;p&gt;（即用型溶液）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;GIBCO/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;15630-080&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氯化钾（KCl）溶液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;60142&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氯化镁（MgCl₂）&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）溶液&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;M1028&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;二硫苏糖醇（DTT）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;43815&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;抑肽酶&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;A6106&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;皂苷元&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;D141&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;RNase A&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;12091-021&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;蔗糖&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;S0389&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;phiX174 复制型 1 DNA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;普洛麦格&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;D1531&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;&lt;u&gt;PhiX174-F 引物：&lt;/u&gt;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5&amp;rsquo;-CGCTTCCATGACGCAGAAGTT-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;u&gt;PhiX174-R 引物：&lt;/u&gt;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5&amp;rsquo;-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen 和/或 IDT-DNA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;dNTP混合物&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;普洛麦格&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;U1515&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Go Taq DNA聚合酶&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Promega&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;M3005&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;Qiaquick 凝胶回收试剂盒&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Qiagen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;28706&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;超纯蒸馏水&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;10977-015&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;Tris-EDTA（TE）缓冲液（100倍浓缩）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;T9285&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;十二烷基硫酸钠（SDS）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;L3771&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）溶液，0.5 M，pH 8.0&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;E7889&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;蛋白酶K（20 mg/mL即用型溶液）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Qiagen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;19131&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;苯酚（用10平衡）&amp;nbsp;毫摩尔 Tris HCl，pH&amp;nbsp;8.0 和 1&amp;nbsp;mM EDTA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;P4557&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;氯仿&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;288306&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;糖原（5 mg/mL 溶液）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Ambion/Invitrogen&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;AM9510&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;乙酸钠（3 M，pH 5.2）&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td>&lt;p&gt;S7899&lt;/p&gt;</td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;乙醇&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;Sigma-Aldrich&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;E7023&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;&lt;u&gt;第一轮LTR引物&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5&amp;rsquo;-GTGCGCGCTTCAGCAAG-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;u&gt;第一轮 phiX174 引物&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5&amp;rsquo;-CACTGACCCTCAGCAATCTTA-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Invitrogen 和/或 IDT-DNA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;---&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td>&lt;p&gt;&lt;u&gt;第二轮 LTR-R 引物&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5&amp;rsquo;-TCTGGCTAACTAGGGAACCCA-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;u&gt;第二轮LTR-U引物&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p&gt;5&amp;rsquo;-CTGACTAAAAGGGTCTGAGG-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&lt;u&gt;第二轮Taqman探针&lt;/u&gt;:&lt;/p&gt; &lt;p&gt;&amp;nbsp;5&amp;rsquo;-6- FAM/TTAAGCCTCAATAAAGCTTGC&lt;/p&gt; &lt;p&gt;CTTGAGTGC/6-TAMRA/-3&amp;rsquo;&lt;/p&gt;</td><td> &lt;p&gt;Invitrogen 和/或 IDT-DNA&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;---&lt;/p&gt; </td><td></td></tr><tr><td> &lt;p&gt;iQ Supermix&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;伯乐（Bio-Rad）&lt;/p&gt; </td><td> &lt;p&gt;170-8862&lt;/p&gt; </td><td></td></tr></tbody></table>

测量 体外 hiv-1前整合复合物的整合活性

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1包膜蛋白与靶细胞表面的特异性受体结合，引发病毒与细胞膜的融合，随后将病毒衣壳（CA）核心释放到细胞质中。随后，病毒逆转录酶（RT）作为同名核蛋白复合物——逆转录复合物（RTC）的一部分，将病毒的单链RNA基因组转化为双链DNA拷贝（vDNA）。这导致形成另一种核蛋白复合物，称为前整合复合物（PIC），由vDNA及其相关的病毒蛋白和宿主因子组成。与PIC相关的病毒整合酶（IN）以时空调控的方式，通过两步过程介导vDNA整合入宿主染色体DNA。第一步，IN在细胞质中加工vDNA的3'端；第二步，在PIC转运至细胞核后，介导加工后的vDNA整合入染色体DNA。从急性感染HIV-1的靶细胞中分离得到的PIC具有功能活性 体外，因为它们能够将相关的病毒DNA整合到外源添加的异源靶DNA中。此类基于前整合复合物的 体外 整合实验已显著推动了对逆转录病毒整合机制的深入解析，并促进了整合酶抑制剂的发现。本文中，我们详细阐述了一种更新的HIV-1前整合复合物（PIC）检测方法，该方法采用基于巢式实时定量聚合酶链式反应（qPCR）的策略，用于测定分离所得天然PIC的体外整合活性。 体外 分离的天然前整合复合物的整合活性

分离HIV-1前整合复合物（PICs）
从急性感染的 Sup-T1 细胞中分离 HIV-1 PIC 的实验方案示意图如图所示 图1. 本方案源自 Engelman 所述方法 等.19,20HIV-1 PIC是由感染细胞中组装的核蛋白复合物，包含逆转录的病毒DNA（vDNA）、病毒蛋白和细胞因子19,20本报告所述方法采用 HIV-1 感染细胞的胞质提取物作为与前整合复合物（PIC）相关的整合活性来源。
<st...

本报告描述了一种 体外 用于测定急性感染细胞胞质提取物中人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）前整合复合物（PIC）相关整合活性的检测方法。通过巢式实时定量聚合酶链式反应策略，定量分析PIC相关HIV-1 DNA整合至异源靶DNA的过程。

测量 体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

HIV-1包膜蛋白与靶细胞表面的相应受体结合，导致病毒与细胞膜融合，随后释放病毒衣壳（CA）核心进入细胞质。随后，作为名为逆转录复合物（RTC）的核蛋白复合体的一部分，病毒逆转录酶（RT）将病毒单链RNA基因组转化为双链DNA拷贝（vDNA）。这进一步形成另一种核蛋白复合体，称为前整合复合体（PIC），由vDNA及其相关的病毒蛋白和宿主因子组成。与PIC相关的病毒整合酶（IN）以时空调控的方式介导vDNA整合入宿主染色体DNA，该过程分为两个步骤：首先，IN在细胞质中加工vDNA的3'端；其次，在PIC转运至细胞核后，介导加工后的vDNA整合入染色体DNA。从急性感染HIV-1的靶细胞中分离得到的PIC在体外具有功能活性，能够将所携带的vDNA整合到外源添加的异源靶DNA中。基于PIC的体外整合检测方法已显著推动了逆转录病毒整合机制的解析以及整合酶抑制剂的发现。本报告中，我们详细阐述了一种更新的HIV-1 PIC检测方法，该方法采用巢式实时定量聚合酶链式反应（qPCR）策略，用于测定分离得到的天然PIC的体外整合活性。

本实验的总体目标是测定从 HIV-1 感染的 SupT1 细胞中分离得到的前整合复合物（PIC）在体外的整合活性。该方法将解答 HIV 生物学中的一些关键问题，特别是某些宿主因子和病毒因子（例如病毒衣壳蛋白）在 HIV-1 DNA 整合过程中的作用，从而有助于我们设计或发现抗逆转录病毒治疗的新靶点。该方法的主要优势在于，仅需相对少量的前整合复合物（PIC）制备物，即可在体外测定其整合活性。该技术的意义可延伸至 HIV-1 艾滋病的诊断与治疗，原因在于该技术的早期版本在发现 HIV-1 整合酶抑制剂方面起到了关键作用，而这类药物正是目前临床使用的主要抗 HIV 药物之一。因此，该方法不仅可用于研究 HIV-1 的整合过程，还可应用于其他逆转录病毒（如 RSV 和 MLV）的研究。本次实验方案由 Muthukumar Balasubramaniam 博士演示，他是本实验室的博士后研究员。在 BSL-2 实验室中，使用添加了 10% 胎牛血清（FBS）和青霉素-链霉素（Pen-Strep）的 RPMI（Roswell Park Memorial Institute）培养基，将 SupT1 细胞维持在每毫升 1×10⁶ 至 2×10⁶ 个细胞的密度，以进行 HIV-1 感染。根据文本方案制备出高滴度的传染性 HIV-1 后，收集培养瓶中的 SupT1 细胞，用移液器轻轻吹打混匀，并使用台盼蓝排斥染色法在血细胞计数板中测定活细胞数量。将细胞按每份 10⁶ 个分装至 8 个 50 毫升锥形离心管中，用于病毒感染，在水平转子离心机中以 500 × g、25 °C 离心 5 分钟。无需去除细胞培养基，直接将含有细胞沉淀的离心管转移至 BSL-3 实验室进行后续操作，然后小心吸除管内上清液，避免扰动细胞沉淀。接着，将 30 毫升经 DNase I 处理的病毒接种液加入细胞中，轻轻吹打混匀，然后将混合物均匀分配至两块六孔组织培养板中。进行离心接种（spinoculation）时，将培养板放入板架中，于摆动桶转子中在 480 ×g 和 25 °C 条件下离心 2 小时，随后将细胞在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下孵育 5 小时。收集感染的细胞并进行裂解时，将每次感染对应的细胞汇集至一个 50 毫升的圆锥形离心管中。将细胞在 300 × g、25 °C 条件下离心 10 分钟，然后小心吸除或用移液器移去上清液。为去除任何残留的病毒颗粒，通过向每个沉淀中加入 2 mL K⁻⁻ 缓冲液进行洗涤，并再次离心样品，随后在不扰动沉淀的前提下，小心地通过抽吸或移液器移除上清液，并重复洗涤一次。用微量移液器小心去除残留缓冲液后，使用冰冻的 K⁺⁺ 裂解缓冲液轻轻重悬每个沉淀，并转移至 2 mL 微量离心管中。为制备细胞质内的前整合复合物（PICs），将样品在室温下轻轻摇动10分钟，随后将试管放入预冷至4°C的离心转子中，在4°C条件下以1,500 × g离心4分钟。在不扰动沉淀的前提下，小心将上清液转移至新的微量离心管中，并在4°C条件下以16,000 × g离心1分钟。再次小心将上清液转移至另一新的微量离心管中，加入RNase A至终浓度为20 µg/mL，在室温下静置孵育30分钟，期间不进行摇动。加入蔗糖至终浓度为7%，轻轻吹打混匀，然后将PICs分装至微量离心管中。在液氮中速冻后，置于-80摄氏度冰箱中长期保存。为制备体外整合（IVI）实验中使用的目标DNA，配制PCR反应体系，利用定制引物phiX174-Forward和phiX174-Reverse扩增phiX174质粒DNA中的2.0 kb区域，并按照文本方案中的程序进行PCR扩增。凝胶纯化并分装样品后，向200微升PICs中加入600纳克目标DNA。充分混匀，在37摄氏度孵育45分钟。加入SDS、EDTA和蛋白酶K以终止体外整合反应，充分混匀反应物后于56摄氏度孵育过夜。第二天，为了从体外整合（IVI）反应中纯化总DNA，向去蛋白化样品中加入等体积的酚。充分涡旋混匀后离心两分钟。小心移除上层水相，并将其转移至新管中，然后重复一次酚抽提步骤，再加入等体积的1:1酚-氯仿混合液。通过涡旋振荡混匀样品，离心管中离心两分钟，然后将上层水相转移至新管。根据文本方案用氯仿抽提后，向水相中加入终浓度为每微升0.1微克的糖原、0.3摩尔的醋酸钠以及2.5倍体积的预冷至-80℃的100%乙醇，以沉淀DNA。将离心管置于-80℃过夜。第二天，在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心样品 30 分钟，然后小心移除上清液，避免扰动沉淀。为进行 PCR 以定量 PIC 活性，首先使用靶向病毒 LTR 和 phiX174 DNA 的引物进行常规 PCR 的第一轮扩增，以扩增整合的 HIV-1 DNA 连接区域。按此处所述配制不含模板 DNA 的主混合液，然后将 45 µL 分装至不同的 PCR 管中，每管加入 5 µL 模板 DNA 或无核酸酶水作为对照。使用文本方案中所述的程序在热循环仪中运行反应，然后进行第二轮定量PCR，并根据文本方案分析数据。在此体外整合（IVI）检测中，使用经DNA酶I处理的HIV-1对SupT1细胞进行离心接种，并添加或不添加HIV-1整合酶抑制剂拉替拉韦。孵育后，分离前整合复合物（PIC），并对纯化的DNA进行病毒DNA整合的检测分析。如图所示，HIV-1 前整合复合物（PIC）能够高效地将相关的病毒 DNA 整合到靶 DNA 中，而在反应体系中添加拉替拉韦（Raltegravir）后，PIC 的体外整合（IVI）效率显著降低，这充分表明本实验所检测的整合活性来源于 HIV-1 整合酶。对照反应未显示出任何整合活性。此外，在第一轮 PCR 中未添加 Taq DNA 聚合酶的对照组也未扩增出整合产物。值得注意的是，仅PIC对照组的数据表明，巢式qPCR策略特异性地检测了整合的病毒DNA，而非与PIC相关的病毒DNA。综合这些数据证明了与PIC相关的整合活性。一旦掌握，病毒制备及用于定量PIC活性的PCR检测可在一周内完成。感染 SupT1 细胞并从感染细胞中分离 PIC 可在一天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何分离 HIV-1 PIC 并测定其体外整合活性。请务必注意，操作高滴度的感染性 HIV-1 具有极高危险性，在执行该实验流程时，必须采取适当的防护措施，包括穿戴防护服（如围裙和实验服）、双层手套以及护目用具。

measurement-vitro-integration-activity-hiv-1-preintegration

Research

科研

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学与感染

测量体外 HIV-1 Preintegration配合物的整合活动

脱壳是HIV-1生命周期早期阶段的关键步骤，定义为衣壳壳体的解离以及病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）的释放。本文展示了从HIV-1病毒颗粒中分离完整核心以及定量其脱壳过程的技术 体外.

体外 HIV-1 核心颗粒的脱壳

本文介绍了一种利用全内反射荧光（TIRF）显微镜在玻璃支撑的平面双层膜上可视化HIV-1包膜蛋白诱导的病毒学突触形成的方法。该方法还可与免疫荧光染色相结合，用于检测HIV-1包膜蛋白诱导病毒学突触形成过程中信号分子的活化与重新分布。...

在合成脂双层上成像HIV-1包膜诱导的病毒学突触及信号传导

本视频演示了使用 HEK-Blue 干扰素-α/β 报告细胞进行分泌型胚胎碱性磷酸酶检测，以定量浆细胞样树突状细胞在受到 HIV-1 感染的 CD4+ T 细胞刺激后所释放的 I...

使用分泌型胚胎碱性磷酸酶报告基因检测法定量生物活性I型干扰素

了解病毒表面抗原的构象对于评估抗体中和作用以及指导有效疫苗免疫原的设计至关重要。本文介绍一种基于细胞的ELISA检测方法，可用于研究特异性抗Env抗体对转染细胞表面表达的三聚体HIV-1...

利用基于细胞的ELISA检测法对HIV-1三聚体包膜糖蛋白进行构象评估

本文描述了一种利用梯度方法分离外泌体与人类免疫缺陷病毒（HIV）颗粒的技术。该方法用于从HIV感染者的人体血浆中将外泌体与HIV颗粒分离。随后对分离得到的外泌体进行了细胞因子/趋化因子含量分析。...

从HIV-1阳性个体血浆中分离外泌体

我们描述了一种从感染细胞的基因组DNA中扩增逆转录病毒整合位点、对扩增的病毒-宿主连接区域进行测序，并将这些序列比对至参考基因组的实验方案。此外，我们还介绍了利用BEDTools量化整合位点在不同基因组注释区域相对分布的技术。...

逆转录病毒整合位点的扩增、下一代测序与基因组DNA定位

本文描述了评估靶向HIV-1复制周期整合后步骤的RNA分子有效性和毒性的方法。这些方法可用于筛选新分子以及优化现有分子的结构形式。...

评估靶向HIV-1产生的RNA在基因或药物治疗中的有效性和毒性

本文描述了一种双向整合位点检测方法的实验流程及软件分析步骤，该方法可同时分析上游和下游的载体-宿主连接DNA。所获得的双向PCR产物可用于任何下游测序平台。所得数据可用于对整合的DNA靶标进行高通量、定量的比较分析。...

双向逆转录病毒整合位点PCR方法及定量数据分析流程

人类组织感染人类免疫缺陷病毒（HIV） 离体...

离体人淋巴组织和女性生殖道黏膜中的人免疫缺陷病毒1型感染与组织培养

我们描述了一种基于细胞的检测方法，通过表达绿色荧光蛋白并利用流式细胞术或荧光显微镜进行检测，以报告HIV-1的融合过程。via该方法可用于在无细胞感染系统和细胞间感染系统中测试病毒进入抑制剂（特异性作用于融合步骤）。...

一种高通量Cre-Lox激活的病毒膜融合检测方法用于筛选HIV-1病毒膜融合抑制剂

本文介绍了一些用于检测内质网（ER）应激及未折叠蛋白反应（UPR）激活的成熟方法，特别侧重于在HIV-1感染中的应用。此外，本文还描述了一系列用于研究内质网应激/UPR对HIV-1复制及病毒颗粒感染性影响的实验方案。...

测量HIV-1感染T细胞中的内质网应激与未折叠蛋白反应及其在HIV-1复制中的作用分析

了解体外测量HIV-1前整合复合物整合活性的方法。该技术使用急性感染的SupT1细胞胞质提取物，通过实时定量PCR检测病毒DNA整合，为抗逆转录病毒治疗靶点研究提供重要工具。

测量体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

探索更多视频

测量 体外 HIV-1前整合复合物的整合活性

探索更多视频

测量体外 HIV-1前整合复合物的整合活性