用于筛选抗体片段文库的细菌内膜展示技术

本实验的总体目标是利用双精氨酸转运途径的折叠质量控制机制，一步实现抗体片段的结合能力与细胞内折叠的改造，从而推动抗体在细胞内功能化方面的工程化应用。该方法有助于克服抗体工程领域中的关键挑战，例如解决抗体在还原性的细胞质环境中难以正确折叠和发挥功能的问题。只有在细胞质中能够良好折叠的抗体才会被展示并进行结合能力检测。

相较于依赖分泌途径进行展示的酵母展示和噬菌体展示技术，该方法具有优势。此技术的应用意义广泛，涵盖神经退行性疾病、癌症和病毒感染的治疗，因为这些疾病均涉及可被抗体靶向的细胞内致病过程。对该方法进行直观演示至关重要，因为生成和操作原生质球的步骤较难掌握。

将scFv文库与ssTorA信号序列融合后，在37摄氏度、摇床条件下培养三小时，随后在20摄氏度、225 rpm条件下继续诱导表达15至22小时。孵育结束后，使用分光光度计测定600纳米处的光密度。然后，将计算好的诱导培养液体积转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下以12,000 × g离心五分钟。

弃去上清液，加入100微升预冷的裂解缓冲液（fractionation buffer）或fB重悬沉淀。然后在室温下以12,000 × g离心1分钟。弃去上清液后，加入350微升预冷的fB缓冲液，其中添加3.5微升浓度为10毫克/毫升的溶菌酶，用于重悬沉淀。

接下来，一边缓慢涡旋振荡试管，一边逐滴加入700微升1毫摩尔EDTA，然后将试管置于室温下的旋转摇床上孵育20分钟，以充分混匀样品。从摇床上取出试管，向每管中加入50微升预冷的0.5摩尔MgCl₂，置于冰上孵育10分钟。

然后在 4 °C 条件下以 11,000 × g 离心 10 分钟。现在，使用移液器和 1 毫升吸头，缓慢吸取部分沉淀物。接着，将离心管倾斜，使管口正对一个新的 1.5 毫升离心管上方，缓慢将移液器吸头从上清液中提起，并将沉淀物滑入新管中。

除去多余的上清液后，用一毫升预冷的 PBS 重悬原生质球。在进行淘选前，必须将原生质球完全重悬，因为聚集物中存在的非结合性 scFv 会导致淘选出现假阳性结果。根据文本方案对目标抗原进行生物素标记后，将链霉亲和素包被的磁珠在其原始小瓶中重悬。

然后将7至10乘以10的9次方个磁珠转移至一个1.5毫升离心管中。将装有磁珠的离心管置于磁力架上2分钟，使磁珠吸附在管壁一侧，随后小心用移液器吸除上清液。从磁力架上取下离心管，用PBS重悬磁珠，注意避免产生气泡。

然后将离心管放回磁力架，去除缓冲液后，再用 PBS 洗涤磁珠两次。向磁珠中加入含有生物素化抗原的 1 毫升裂解液，在室温下轻轻旋转孵育 30 分钟。孵育结束后，用含 1% BSA 的 PBS 洗涤磁珠五次。

然后使用含1% BSA的PBS重悬珠子。为了筛选scFv文库，首先将4 × 10⁹个原生质体和8 × 10⁸个珠子加入一个无菌的15毫升离心管中。加入1× PBS（含1% BSA）使总体积达到4毫升。

然后将溶液分装到四个1.5毫升离心管中，每管1毫升，并在4°C下轻轻旋转孵育5小时。为准备用于PCR的磁珠结合原生质体，将铺板反应管置于磁力架上静置3分钟。吸除上清液，并用含1% BSA的1×PBS缓冲液重复洗涤磁珠4次，操作同前。

然后每管加入 25 µL ddH₂O 重悬磁珠。按照文字版实验方案，进行全质粒 PCR 以扩增磁珠结合的 scFv 基因，随后将 PCR 产物重新环化形成质粒。根据文字版实验方案，将整个反应体系转化至 MC4100 等量感受态细胞中。

为了通过 ELISA 鉴定克隆，解冻一管经过筛选的亚文库，并将其接种到 LB 琼脂平板上。向圆底 96 孔培养板的每孔中加入 200 微升含有 20 微克/毫升氯霉素的 LB 培养基。用移液器吸头从琼脂平板上挑取单个菌落。

然后将枪头放入96孔板的第一个孔中，轻轻搅动以接种。继续将单个菌落分别接种到每个孔中。在37°C条件下，于微量板摇床上孵育20至24小时。

根据文本方案配制目标抗原包被液后，向每块96孔高吸附透明聚苯乙烯ELISA板的每个孔中加入50 µL该溶液。将板在4°C下孵育过夜。接下来，根据文本方案将96孔培养板中的菌落复制到琼脂平板上。

然后，将 ELISA 板中的包被液弃去，并向每个孔中加入 100 微升根据文本方案配制的封闭液。在室温下孵育至少两小时，或在 4 摄氏度下过夜。向圆底培养板的每个孔中加入 20 微升浓缩的细胞裂解去垢剂，并将培养板置于微量板摇床上，室温孵育 15 至 20 分钟。

将 ELISA 板中的封闭液弃去，用根据文本方案配制的洗涤缓冲液每孔 200 微升洗涤 4 次。最后一次洗涤液移除后，将细胞裂解板各孔中的 50 微升转移至 ELISA 板的对应孔中。将板在室温下孵育 1 至 2 小时。

继续将ELISA板中的样品排空，并用洗涤液洗涤4次。随后，根据文本方案制备用于检测scFv的抗体溶液。向每个孔中加入50 µL抗体溶液，在室温下孵育1至2小时。

加入根据制造商说明书配制的 HRP 底物溶液（每孔 200 微升）前，用洗涤缓冲液洗涤 ELISA 板四次。将板在室温下避光孵育 30 至 60 分钟。为终止反应，向每孔加入 50 微升 3 摩尔 H2SO4，并轻轻吹打混匀溶液。

最后，使用酶标仪在 492 纳米波长下测定吸光度。在本实验中，scFv 抗体 scFv13 和 scFv13.R4 分别与天然的 ssTorA 序列或一种经过修饰的 ssTorA 序列融合，后者无法被双精氨酸转运途径（也称为 Tat 途径）识别。ScFv。

R4 折叠良好，并能在与天然 ssTorA 融合时表达于内膜上。ScFv13 折叠效果不佳，无论与哪种 Tat 信号肽融合，均无法在内膜上显示。这些结果表明，只有含有 Tat 信号肽且在细胞质中正确折叠的蛋白质才能在内膜上呈现，从而使得 Tat 途径可作为细胞内折叠的筛选系统。

在本实验中，以对β-半乳糖苷酶结合亲和力较低的scFv13为基础构建了易错PCR文库，并用β-半乳糖苷酶进行筛选。分离得到了scFv 1-4，其对β-半乳糖苷酶的结合亲和力高于scFv13，且胞质可溶性水平也更高。以scFv 1-4作为竞争子，对第二代scFv 1-4文库进行筛选，分离得到了scFv 2-1和scFv 2-3，它们对β-半乳糖苷酶的结合亲和力较scFv13和scFv 1-4进一步提高，凸显了可溶性和抗原结合能力的同步优化。

完成此操作后，可进一步采用其他方法，例如使用纯化的裂解液进行 ELISA，以验证抗原特异性并确定分离克隆的结合亲和力。观看本视频后，您应了解如何利用 Tat 分泌途径展示抗体文库，并通过磁珠淘选技术富集和分离抗原结合子，从而筛选出能够与目标抗原结合的抗体。请务必注意，操作硫酸具有极高的危险性，必须佩戴适当的个人防护装备。