Name: 细菌内膜显示筛查抗体片段的图书馆 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 28 s
Description: 了解利用大肠杆菌双精氨酸转运途径筛选抗体片段结合亲和力与溶解度的方法。该技术通过蛋白质折叠质量控制，实现有效的细胞内抗体工程，为治疗神经退行性疾病和癌症提供新策略。

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感谢 Tomer Zohar 在单链可变区片段（scFv）筛选和表征实验方面的工作。本研究的部分工作由美国国家癌症研究所资助，资助编号为 F32CA150622（授予 AJK）。本内容的全部责任由作者承担，不代表美国国家癌症研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

由于细胞质环境具有还原性，会阻碍稳定二硫键的形成，因此在细胞质中发挥活性的抗体工程是一项困难的任务6,7。这导致大多数抗体在细胞质中无活性，除非在提高结合亲和力的同时，还对其稳定性与溶解度进行改造。现有的噬菌体展示、细菌表面展示和酵母表面展示方法均依赖分泌途径14-16来展示改造后的抗体，但这些方法无法对胞内折叠过程进行优化。通过内膜展示技术改造的抗体在细胞质中具有更高的稳定性和溶解度，因为Tat途径的折叠质量控制机制可阻止在细胞质中折叠不良或不稳定的抗体发生跨膜转运。该方法将胞内抗体亲和力与溶解度的改造过程合二为一，简化了迭代优化流程。尽管该方法最初旨在改造适应还原性胞内环境的可溶性抗体，但也可用于改造在非还原条件下发挥功能的抗体，因为利用该方法获得的蛋白质在周质空间的氧化环境中仍能维持其正确折叠构象。
尽管该技术简化了高亲和力且高胞质溶解度抗体的构建过程，但在使用本方案时仍需考虑若干重要局限性。在分析二次筛选ELISA信号以鉴定有前景的scFv变体时，区分潜在有意义变体与可能缺乏足够抗原结合能力变体的阈值，通常需在多个克隆进一步表征后才能明确。应重点关注相较于亲本抗体结合能力的提升；然而，异常高的信号可能提示存在亲和力效应29或聚集效应30，这一挑战并非内膜展示筛选方法所独有。使用本方案时需牢记的一个关键局限是无法在淘选后回收球状体，因其不具备活力（未发表数据）。因此必须通过DNA扩增和转化步骤来回收编码抗体的质粒。
该方案中有多个关键步骤可实现抗体折叠和结合的同步改造。为了确保筛选成功，被筛选的scFv文库必须表达为与ssTorA信号肽融合的形式。若缺少该序列，抗体将无法被导向Tat途径，因而不能转位至周质空间19。此外，必须在抗体的C末端融合一个表位标签，以便在结合实验中检测展示的抗体。显然，用于表达scFv的E. coli菌株也必须具备完整的Tat途径相关机制，但常用的E. coli菌株通常均满足这一条件。
可根据需要对该方案进行修改，以提高分离出具有理想特性的抗体的可能性。可在针对目标抗原进行筛选之前增加减法淘选步骤，以去除scFv文库中非目标成分。可将文库的原生质球与仅包被BCCP或包被非目标蛋白的磁珠共同孵育，结合到磁珠上的原生质球可被弃去，随后对未结合的剩余原生质球进行筛选，以检测其与目标抗原的结合能力。如代表性结果部分所述，提高分离所得scFv亲和力的一种方法是在淘选反应中加入可溶性竞争物，与原生质球表面展示的scFv竞争结合位点。由于可溶性竞争物为纯化的蛋白质，其本身不含DNA，因此在PCR反应中不会扩增出竞争物的序列，仅能回收原生质球表面展示的scFv序列。此外，该方法还可拓展应用于其他类型抗体的改造，或用于非抗体类结合蛋白的研究与工程化。
E. coli 内膜展示是一种用于改造高亲和力及高细胞内溶解度抗体的强大技术平台。该方法特别适用于高效改造旨在细胞内环境中发挥功能的抗体。这类细胞内抗体已在神经退行性疾病、癌症和病毒感染等多个领域被探索作为潜在的治疗手段。31该技术将促进细胞内抗体在这些领域及任何其他需要研究蛋白质靶点的领域中作为研究和医学工具的更广泛应用 原位 是所需的。

能够在细胞内环境中正确折叠并发挥功能的抗体，是具有前景的研究与治疗工具。它们可通过结合细胞内的靶蛋白，抑制蛋白质-蛋白质相互作用、阻断蛋白质-核酸相互作用，或阻止底物接近酶，从而调控蛋白质活性1-5。
尽管抗体在细胞内应用方面具有巨大潜力，但在保持与靶抗原结合能力的同时，使其在细胞内环境中正确折叠并具备良好溶解性仍具挑战性。还原性的细胞质环境会阻碍二硫键的形成，而二硫键通常是全长抗体及抗体片段（包括单链可变片段（scFv）抗体）稳定折叠所必需的6,7。已有多种定向进化方法被用于构建对靶抗原具有高亲和力的抗体8-10。这些方法通常利用噬菌体展示、酵母表面展示或细菌表面展示技术，以筛选大规模的抗体文库11-13。这些技术在识别可结合靶标的抗体方面功能强大且高效，但其依赖分泌途径将待展示的蛋白质转运至胞外14-16。分泌途径将未折叠的蛋白质从还原性的细胞质转运至酵母的内质网腔或细菌的周质空间，随后蛋白质在氧化性环境中折叠，并展示于细胞表面或包装进噬菌体颗粒中，以筛选结合亲和力17,18。因此，通过这些技术获得的抗体在细胞质中未必能良好折叠，若用于细胞内应用，通常还需另行对其细胞内溶解性进行工程化改造。
为了提高在细胞质中正确折叠的抗体的构建效率，我们此前报道了MAD-TRAP（基于膜锚定展示的Tat系统识别相互作用蛋白）方法的成功应用，该方法可用于筛选scFv抗体文库 大肠杆菌 内膜展示19细菌内膜展示依赖于双精氨酸转运（Tat）途径来运输展示的抗体，这与其他使用分泌途径的常见展示方法不同。Tat途径包含一种质量控制机制，仅允许可溶性且正确折叠的蛋白质从细胞质转运至周质空间。 E. coli 细胞质，穿过内膜，进入周质空间20,21过表达的Tat底物（即.，通过N端融合Tat信号肽（ssTorA）而靶向Tat途径的蛋白质，若在细胞质中已正确折叠，则会形成一种长寿命的转运中间体，其N端位于细胞质中，C端位于周质空间19。这使得正确折叠的 Tat 底物（包括抗体片段）能够在周质面展示 E. coli 内膜。通过酶消化去除外膜以生成球状体后，将抗体暴露于胞外空间（图1）。这使得展示在内膜上的Tat底物能够被筛选其与特定靶标的结合能力。重要的是，利用Tat途径进行细胞表面展示可确保只有在细胞质中正确折叠的抗体才会被检测其结合能力，从而实现结合亲和力与细胞内折叠能力的同步优化。在本方案中，我们描述了如何将一个scFv文库展示于 E. coli 内膜，用目标抗原筛选文库，并进行次级筛选以鉴定文库中最具潜力的组分。尽管本方案重点针对单链抗体（scFv），但该方法也可应用于任何需要结合能力且依赖胞内折叠的蛋白质的改造。
<img alt="Tat 途径示意图；蛋白质转运至周质；周质展示；底物检测。" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1. Tat 内膜展示。 在 E. coli 中，以与 ssTorA 信号序列融合的形式表达并在细胞质中正确折叠的 scFv 抗体可被转运至内膜外侧。在此过程中形成一种易位中间体，其中 scFv 抗体锚定于内膜上，其 N 末端位于细胞质内，C 末端则位于周质空间。通过酶法消化 E. coli 的外膜形成原生质球，从而使锚定的抗体暴露于胞外环境，便于利用可结合展示抗体 C 末端融合表位标签的抗体进行检测。<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>

<table><tbody><tr><td>scFv 文库</td><td>因情况而异</td><td></td><td>应从商业或学术来源获取合适的 scFv 文库。</td></tr><tr><td>MC4100 &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; 细胞</td><td>Coli 遗传资源中心</td><td>6152</td><td>细胞需具备化学感受态或电穿孔感受态，具体取决于所选的转化方法。</td></tr><tr><td>甘油</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP229-4</td><td></td></tr><tr><td>Difco 脱水培养基 LB 肉汤，Miller 型（Luria-Bertani）</td><td>BD</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>氯霉素（Cm）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP904-100</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠（NaCl）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>氯化钾（KCl）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸氢二钠（Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP332-500</td><td></td></tr><tr><td>磷酸二氢钾（KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP362-500</td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白（BSA）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP220-1</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1521</td><td></td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸（EDTA），0.5 M</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr><td>氯化镁（MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP214-500</td><td></td></tr><tr><td>溶菌酶</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3790-10X1ML</td><td></td></tr><tr><td>涡旋混合器</td><td>VWR</td><td>97043-564</td><td></td></tr><tr><td>Bicine</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP2646100</td><td></td></tr><tr><td>D-生物素</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP232-1</td><td></td></tr><tr><td>异丙基 &amp;beta;-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP1755-1</td><td></td></tr><tr><td>BugBuster Master Mix（细胞裂解去垢剂）</td><td>EMD Millipore</td><td>71456</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 分子量截留值，3,000&amp;nbsp;道尔顿</td><td>GE Healthcare Sciences</td><td>28932240</td><td></td></tr><tr><td>靶抗原</td><td>因情况而异</td><td>不适用</td><td>可购买或自行制备并纯化靶抗原。</td></tr><tr><td>Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1</td><td>Invitrogen</td><td>65601</td><td></td></tr><tr><td>Dynamag-2 磁力架</td><td>Invitrogen</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>试管旋转仪</td><td>VWR</td><td>13916-822</td><td></td></tr><tr><td>PCR 引物</td><td>IDT</td><td>不适用</td><td>引物序列如实验方案中所述。</td></tr><tr><td>10x T4 DNA 连接酶反应缓冲液</td><td>New England BioLabs</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>T4 多核苷酸激酶（PNK）</td><td>New England BioLabs</td><td>M0201S</td><td>确保用于引物磷酸化反应的 T4 连接酶缓冲液含有 1 mM ATP。&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>5x Phusion HF 缓冲液套装</td><td>New England BioLabs</td><td>B0518S</td><td></td></tr><tr><td>脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液混合物，每种 dNTP 10 mM</td><td>New England BioLabs</td><td>N0447L</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA 聚合酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0530S</td><td>可使用其他高保真聚合酶作为替代，但需调整 &lt;strong&gt;表3&lt;/strong&gt; 中的退火温度。</td></tr><tr><td>配备双 48/48 快速反应模块的 C1000 Touch 梯度 PCR 仪</td><td>Bio-Rad</td><td>185-1148</td><td></td></tr><tr><td>琼脂糖</td><td>Promega</td><td>V3121</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA 凝胶染料</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard SV 凝胶和 PCR 产物纯化系统</td><td>Promega</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA 连接酶</td><td>New England BioLabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>微透析膜滤器</td><td>EMD Millipore</td><td>VSWP04700</td><td></td></tr><tr><td>琼脂</td><td>BD</td><td>214030</td><td></td></tr><tr><td>96 孔聚苯乙烯圆底细胞培养板</td><td>VWR</td><td>10062-902</td><td></td></tr><tr><td>Corning 通用聚苯乙烯检测板盖</td><td>Corning</td><td>3931</td><td></td></tr><tr><td>微量滴定板摇床</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96 孔 EIA/RIA 易洗透明平底聚苯乙烯高结合微孔板</td><td>Corning</td><td>3369</td><td></td></tr><tr><td>Bel-blotter 聚碳酸酯 96 孔复制工具</td><td>Bel-Art Products</td><td>378760002</td><td></td></tr><tr><td>速溶脱脂奶粉</td><td>Quality Biological</td><td>A614-1000</td><td></td></tr><tr><td>吐温 20（聚山梨酯 20）</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>PopCulture 试剂（浓缩型细胞裂解去垢剂）</td><td>EMD Millipore</td><td>71092-3</td><td></td></tr><tr><td>小鼠源单克隆 ANTI-FLAG M2-过氧化物酶（HRP）抗体</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8592</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast OPD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9187-50SET</td><td></td></tr><tr><td>硫酸（H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;SO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;），10&amp;nbsp;N 溶液</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>SA200-1</td><td></td></tr><tr><td>Reynolds Wrap 铝箔</td><td>VWR</td><td>89079-075</td><td></td></tr><tr><td>BioTek Epoch 微孔板分光光度计</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11120570</td><td></td></tr></tbody></table>

用于筛选抗体片段文库的细菌内膜展示技术

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

用于细胞内功能的工程抗体不仅需要对靶抗原具有亲和力，还必须在细胞质中具有可溶性并正确折叠。目前常用的重组抗体文库展示与筛选方法并未引入细胞内蛋白质折叠质量控制机制，因此通过这些方法获得的抗体，其抗原结合能力、细胞质折叠及可溶性往往需要分别进行优化。本文介绍一种可同时筛选单链可变区片段（scFv）重组抗体文库中具有抗原结合能力且正确折叠的scFv的实验方案。该方法利用大肠杆菌（Escherichia coli）双精氨酸转运（Tat）途径内在的细胞内折叠质量控制机制，将scFv文库展示于大肠杆菌（E. coli）内膜上。Tat途径确保只有可溶且正确折叠的蛋白质才能从细胞质转运至内膜表面，从而在进行抗原结合检测前即排除错误折叠的scFv。在去除外膜后，展示于内膜上的scFv与固定在磁珠上的靶抗原进行淘选，以分离能够结合靶抗原的scFv。随后采用基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的二级筛选，鉴定出最具潜力的scFv用于进一步表征。通过后续多轮的诱变与筛选，可进一步提高抗体的抗原结合亲和力和细胞质可溶性，从而获得适用于细胞内应用的高亲和力、高可溶性工程抗体。

Tat 途径中细胞内蛋白质折叠质量控制机制 E. coli 限制了在还原性细胞质环境中正确折叠的蛋白质向内膜的转运。通过过表达将scFv与ssTorA信号序列（来自TorA蛋白的信号序列，该序列可被Tat途径天然转运）融合的蛋白20），转运过程受阻，导致scFv展示在内膜上19在外膜经酶法破坏后，展示的抗体即可用于抗原结合活性的筛选。Karlsson 证明了利用 Tat 途径实现 scFv 展示的可行性。 等19 (图6）。scFv 抗体 scFv13 和 scFv13.R4 分别与天然的 ssTorA 序列或经过修饰的 ssTorA 序列融合，后者缺失了被 Tat 途径识别的精氨酸-精氨酸残基对。scFv13.R4 由 Martineau 设计改造 等 通过四轮定向进化，从scFv13获得，已知其在细胞质中具有良好的折叠能力9该scFv展示于内膜上，但仅在作为与天然ssTorA信号序列的融合蛋白表达时才可实现。图6相反，scFv13 在细胞质中折叠不良9，因此无论与何种信号序列融合，它在内膜上的展示效果均不理想。此外，若在缺乏 TatC 蛋白（Tat 分泌系统的关键组分）的细胞中表达这些 scFv，20,28未观察到展示现象，表明内膜展示与Tat途径之间存在重要关联。这些结果表明，只有含有Tat信号肽且在细胞质中正确折叠的蛋白质才能在内膜上展示，从而使通过Tat途径的转运可作为细胞内折叠的筛选手段。
<img alt="流式细胞术数据分析图；荧光强度与事件数关系，用于检测蛋白表达。" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig6.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图6"> 
图6. 内膜上展示的scFv的检测。 采用流式细胞术分析检测错误折叠的scFv13和正确折叠的scFv13.R4在内膜上的展示情况。scFv与天然的ssTorA或突变的ssTorA(KK)融合表达，其中ssTorA序列中的Arg-Arg双碱性残基被替换为Lys-Lys。通过异硫氰酸荧光素（FITC）标记的抗FLAG抗体检测scFv C末端的FLAG表位标签。以缺乏TatC蛋白的细胞（ΔtatC）以及无FLAG标签的ssTorA-scFv13作为对照。M表示中位荧光值。经许可转载自参考文献19。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig6large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
内膜展示技术可成功筛选出对靶蛋白具有高亲和力且胞质溶解度高的scFv抗体。此外，利用内膜展示技术进行后续多轮定向进化可进一步改善抗体特性19。为验证该方法，基于对β-半乳糖苷酶亲和力较低的scFv13构建了一个易错PCR文库，并采用本实验方案中所述的展示与筛选方法，针对靶抗原β-半乳糖苷酶进行筛选。经过一轮诱变与筛选后获得了scFv 1-4，其对β-半乳糖苷酶的结合亲和力高于scFv13（图7A），且胞质溶解度也更高（图7B）。
基于scFv 1-4构建了一个新的文库，采用易错PCR方法生成，并对该第二代文库使用改良后的方案进行针对β-半乳糖苷酶的淘选。第二轮进化中针对β-半乳糖苷酶的淘选是在存在纯化可溶性scFv 14作为竞争抑制剂的条件下进行的，以提高分离出比scFv 1-4具有更高亲和力克隆的可能性。经过第二轮诱变和淘选后，通过基于ELISA的二级筛选分离得到了scFv 2-1和scFv 2-3。这些scFv不仅对β-半乳糖苷酶的结合亲和力高于scFv13，而且其结合能力也优于第一轮进化的克隆scFv 1-4。scFv 2-1对β-半乳糖苷酶的结合能力与scFv13.R4相当（图7A）。与scFv 14相比，scFv 2-3在胞质可溶性方面进一步提高，表明可溶性和抗原结合能力可被同时优化。由于scFv的亲和力和可溶性表达是同时筛选的，因此可能出现所选scFv具有中等可溶性但结合能力强，或反之的情况。例如，scFv 2-1的可溶性表达水平低于scFv 2-3，但其对β-半乳糖苷酶的结合亲和力更高。
<img alt="ELISA 图像与蛋白质凝胶结果；scFv 结合浓度；可溶性与不溶性组分分析" src="/files/ftp_upload/54583/54583fig7.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图7"> 
图7. 利用内膜展示技术分离的scFv变体的靶标结合与胞质表达 (AscFv 在大肠杆菌细胞质中表达 E. coli 细胞（例如，不含ssTorA信号序列）并带有六聚组氨酸（6×-His）标签，使用镍-氮川三乙酸旋转柱进行纯化。通过ELISA检测纯化的scFv与β-半乳糖苷酶的结合情况。将纯化的scFv加入包被有β-半乳糖苷酶的ELISA板中，用抗6×-His抗体检测结合的scFv。数据为六次重复实验的平均值，误差线表示均值的标准误。B) 通过抗6×His抗体进行Western印迹分析，检测在细胞质中表达scFv的细胞裂解液的可溶性和不溶性组分。样品上样量根据总蛋白浓度进行归一化。转载自A）并经过调整（B参考文献中的） 19 经许可。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54583/54583fig7large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>

我们提供一种方法，利用大肠杆菌（Escherichia coli）的双精氨酸转运途径，同时筛选抗体片段文库的结合亲和力和胞质溶解度。该途径具有内在的蛋白质折叠质量控制机制，可将抗体片段展示在内膜上。

用于细胞内功能的抗体工程不仅需要对靶标抗原具有亲和力，还必须在细胞内环境中保持可溶性并正确折叠……

本实验的总体目标是利用双精氨酸转运途径的折叠质量控制机制，一步法实现抗体片段的结合能力与细胞内折叠的改造，从而推动抗体在细胞内功能化方面的工程化应用。该方法有助于克服抗体工程领域中的关键挑战，例如解决抗体在还原性的细胞质环境中难以正确折叠和发挥功能的问题。只有在细胞质中能够良好折叠的抗体才会被展示并进行结合能力检测。相较于依赖分泌途径进行展示的酵母展示和噬菌体展示技术，该技术具有优势。此方法的应用意义广泛，涉及神经退行性疾病、癌症和病毒感染的治疗，因为这些疾病均涉及可被抗体靶向的细胞内致病过程。该方法的可视化演示至关重要，因为理解如何生成和操作原生质球具有挑战性。将scFv文库与ssTorA信号序列融合后，在37摄氏度下振荡培养三小时，随后在20摄氏度、225 rpm条件下过夜表达15至22小时。孵育结束后，使用分光光度计测定600纳米处的光密度。然后将诱导培养物按计算体积加入1.5毫升微量离心管中，在室温下以12,000 × g离心五分钟。移除上清液，加入100 µL预冷的裂解缓冲液（fractionation buffer 或 fB）重悬沉淀。然后在室温下以12,000 × g离心1分钟。移除上清液后，加入350 µL预冷的fB缓冲液，并补充3.5 µL浓度为10 mg/mL的溶菌酶，用于重悬沉淀。接下来，一边缓慢涡旋振荡各离心管，一边逐滴加入700微升1毫摩尔EDTA，然后将离心管置于室温下的旋转混合仪上孵育20分钟，以充分混匀样品。从旋转混合仪上取出离心管，向每管中加入50微升冰浴的0.5摩尔MgCl₂，冰上孵育10分钟。然后在4°C条件下，以11,000 × g离心样品10分钟。现在，使用移液器和1毫升吸头，缓慢吸取部分沉淀。接着，将离心管倾斜，使管口正对一个新的1.5毫升离心管上方，缓慢将吸头从上清液中提起，并将沉淀滑入新管中。除去多余的上清液后，用一毫升预冷的 PBS 重悬原生质球。在进行淘选前，必须将原生质球完全重悬，因为聚集物中存在的非结合性 scFv 会导致淘选出现假阳性结果。根据文本方案对目标抗原进行生物素标记后，将包被链霉亲和素的磁珠在其原始小瓶中重悬。然后将七到十乘以十的九次方个珠子转移至一个1.5毫升离心管中。将装有珠子的离心管置于磁力架上两分钟，使珠子吸附至管壁一侧，随后用移液器小心吸除上清液。从磁铁上取下离心管，用PBS重悬珠子，注意避免产生气泡。然后将离心管放回磁力架上，吸除缓冲液，再用 PBS 洗涤磁珠两次。向磁珠中加入含有生物素化抗原的裂解液 1 毫升，室温下轻轻旋转孵育 30 分钟。孵育结束后，用含 1% BSA 的 PBS 洗涤磁珠五次。然后用含1% BSA的PBS重悬珠子。为筛选scFv文库，首先将4 × 10⁹个原生质体和8 × 10⁸个珠子加入一个无菌的15毫升离心管中。加入1× PBS（含1% BSA），使总体积达到4毫升。然后将溶液分装到四个1.5毫升离心管中，每管1毫升，并在4°C下轻轻旋转孵育5小时。为准备用于PCR的磁珠结合的原生质体，将铺板反应管置于磁力架上静置3分钟。弃去上清液，并用含1% BSA的1× PBS缓冲液像之前一样洗涤磁珠4次。然后每管加入25微升ddH2O重悬磁珠。按照文本方案进行全质粒PCR，扩增磁珠结合的scFv基因，随后将PCR产物重新环化形成质粒。根据文本方案，将整个反应体系转化至MC4100等量细胞中。为了通过 ELISA 鉴定克隆，解冻一管经过筛选的亚文库，并将其接种到 LB 琼脂平板上。向圆底 96 孔培养板的每个孔中加入 200 微升含有 20 微克/毫升氯霉素的 LB 培养基。用移液器吸头从琼脂平板上挑取单个菌落。然后将枪头放入96孔板的第一个孔中，轻轻搅拌以接种。继续将单个菌落分别接种到每个孔中。在37°C条件下，于微量板摇床上孵育20至24小时。根据文本方案配制目标抗原包被液后，向每孔加入50 µL该溶液至96孔高结合力透明聚苯乙烯ELISA板的各孔中。将板在4°C孵育过夜。随后，根据文本方案将菌落从96孔培养板复制到琼脂平板上。然后，将 ELISA 板中的包被液弃去，并向每孔中加入 100 微升根据文本方案配制的封闭液。在室温下孵育至少两小时，或在 4 摄氏度下过夜。向圆底培养板的每孔中加入 20 微升浓缩细胞裂解去垢剂，并将培养板置于微量板摇床上，室温孵育 15 至 20 分钟。将 ELISA 板中的封闭液弃去，然后根据文本方案中制备的洗涤缓冲液，每孔加入 200 微升，洗涤 4 次。最后一次洗涤液移除后，从细胞裂解板的每个孔中转移 50 微升至 ELISA 板的对应孔中。将板在室温下孵育 1 至 2 小时。将ELISA板中的样本排空，并用洗涤液清洗各孔4次。随后，根据文本方案配制用于检测scFv的抗体溶液。向每孔中加入50微升抗体溶液，在室温下孵育1至2小时。加入根据制造商说明书配制的 HRP 底物前，用洗涤缓冲液洗涤 ELISA 板 4 次，每孔加入 200 微升。将 ELISA 板在室温下避光孵育 30 至 60 分钟。为终止反应，向每孔加入 50 微升 3 摩尔 H2SO4，并轻轻吹打混匀溶液。最后，使用酶标仪在492纳米波长下测定吸光度。本实验中，scFv抗体scFv13和scFv13.R4分别与天然ssTorA序列或经修饰的ssTorA序列融合，后者不被双精氨酸转运途径（亦称Tat途径）识别。scFvR4 折叠良好，并能在与天然 ssTorA 融合时表达于内膜上。ScFv13 折叠效果不佳，无论与哪种 Tat 信号肽融合，均无法在内膜上显示。这些结果表明，只有含有 Tat 信号肽且在细胞质中正确折叠的蛋白质才能在内膜上呈现，从而使 Tat 途径可作为细胞内折叠的筛选系统。在本实验中，以对β-半乳糖苷酶结合亲和力较低的scFv13为基础构建了易错PCR文库，并利用β-半乳糖苷酶进行筛选。分离得到了scFv 1-4，其对β-半乳糖苷酶的结合亲和力高于scFv13，且胞质可溶性水平也更高。以scFv 1-4作为竞争子，对第二代scFv 1-4文库进行筛选，分离获得了scFv 2-1和scFv 2-3，其对β-半乳糖苷酶的结合亲和力进一步提高，优于scFv13和scFv 1-4，凸显了可溶性与抗原结合能力的同步优化。完成此操作后，可进一步采用其他方法，例如使用纯化的裂解液进行 ELISA，以验证抗原特异性并确定分离克隆的结合亲和力。观看本视频后，您应了解如何利用 Tat 分泌途径展示抗体文库，并通过磁珠淘选技术富集和分离抗原结合子，从而筛选出能够与目标抗原结合的抗体。请务必注意，操作硫酸具有极高的危险性，必须佩戴适当的个人防护装备。

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