高效实现Saccharomyces cerevisiae在96孔板中的孢子形成
2016年9月17日
此处以96孔板形式进行酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的孢子形成实验。
本实验方案的总体目标是以96孔板格式高效地诱导芽殖酵母产孢。尽管已对芽殖酵母开展了大量大规模筛选研究，但针对减数分裂和产孢过程的高通量研究仍较为有限。本视频所介绍的技术具有高效、经济的优点，可在适用于高通量筛选的96孔板体系中实现酵母的高效产孢。
我最初想到这个方法，是因为我想使用一个平铺的两微米质粒文库，以筛选出能够抑制无法形成折光性孢子突变体的高拷贝抑制因子。最初，在96孔板体系中，我的孢子形成效率很低。我发现这是由于通气不足所致。
开始此操作时，将SK1酵母菌株解冻并接种至酵母提取物蛋白胨甘油（YPG）平板上。使用无菌接种棒从含有甘油保存菌种的冻存管中刮取少量细胞，并将其涂布于YPG平板上。在30摄氏度下培养酵母12至16小时。
接下来，将YPG平板上的酵母划线接种至酵母提取物蛋白胨葡萄糖（YPD）平板上，以获得单菌落。在30摄氏度下，将酵母在YPD平板上培养24至48小时。在YPD固体培养基上培养24至48小时后，挑取YPD平板上的单菌落，接种于25毫升YPD液体培养基中进行培养。
将该培养物在30°C、220 RPM的摇床培养箱中过夜培养，直至菌液OD600达到4.0至7.0。次日，取适量YPD培养物中的菌体，接种于125毫升酵母提取物蛋白胨醋酸盐（YPA）培养基中，使初始OD600为0.1。将培养物置于30°C、220 RPM的摇床培养箱中培养，直至OD600达到1.3至1.5之间。
将培养物转移至离心管中，在台式离心机中以1800×g离心5分钟，使细胞沉淀。用0.5倍体积的无菌去离子水洗涤细胞一次。再次离心并弃去上清液。
用1倍体积的孢子形成培养基重悬细胞。为制备不同基因型的细胞，首先将96孔板中解冻的冻存菌株转移至YPG固体培养基上。将96针接种耙在火焰上灭菌，然后短暂接触固体培养基使其冷却，再接触酵母菌落。
在30摄氏度下过夜培养酵母。次日，根据菌株的基因型，将细胞从YPG固体培养基转移至YPD或选择性固体培养基。本实验演示中使用YPD培养基。
将酵母在30摄氏度下培养至各菌株形成菌落。将1.2毫升YPD液体培养基分装至96深孔板的每个孔中。将细胞从固体培养基转移至液体培养基中。
用矩形培养皿的塑料盖盖住平板，并用一小段胶带将盖子固定，以最小程度限制空气流通。在30摄氏度、220转/分钟的摇床中培养细胞过夜。次日，以1800×g离心5分钟。
倒掉培养基，向每孔加入 500 µL YPA，重悬沉淀的细胞。用胶带固定塑料盖，盖住培养板。
将细胞在30摄氏度、220转/分钟的摇床培养箱中培养15小时。为提供充分通气以实现高效孢子形成，在96孔板的每个孔中加入一颗直径三毫米的无菌固体玻璃珠，或一根长五毫米、直径两毫米的无菌磁力搅拌子。若所有细胞具有相同基因型，则将500微升含细胞的培养基分装至96孔板的每孔中。
用塑料盖盖住培养板，并用胶带固定。如果细胞具有不同的基因型，将处于YPA中的细胞在1800×g下离心5分钟，倒掉培养基。向每个孔中加入500微升孢子形成培养基。
将沉淀的细胞重悬于孢子形成培养基中。用胶带固定塑料盖以盖住培养皿。如果使用玻璃珠，将样品置于30°C的摇床培养箱中，在220 RPM条件下振荡培养以诱导孢子形成。
若使用磁力搅拌子，请将样品置于30摄氏度培养箱内的搅拌器上进行孢子形成。磁力搅拌子的搅拌速度无需精确控制，只要确保所有搅拌子均在快速转动且培养物得到充分通气即可。36小时后取出样品，监测孢子形成进程。
从每种孢子形成培养物中吸取六微升细胞，加入含有24微升孢子形成培养基的96孔盖玻片板中。让细胞静置五分钟，然后使用倒置显微镜进行观察。以下图像展示了在倒置显微镜下使用63倍物镜观察到的两种不同菌株的代表性孢子形成情况。
在野生型培养物中可见由箭头指示的折光性四分体，而在含有孢子形成缺陷型 smk1 缺失细胞的培养物中则不可见。比较了在多孔板中进行孢子形成的细胞与在烧瓶中使用较大体积进行孢子形成的细胞之间的孢子形成效率。
使用多孔板未能达到在烧瓶中进行孢子形成时通常观察到的高效率。在多孔板中进行孢子形成时，若提供适当的通气条件，可实现超过50%的足够孢子形成效率，其中使用5毫米搅拌子时效果最佳。然而，鉴于小型搅拌子成本较高，使用玻璃珠所获得的效率与之相当。
尽管5毫米和7毫米的搅拌子均可放入96孔板的孔中，但使用7毫米搅拌子会导致孢子形成效率降低。7毫米搅拌子在孔中容易与相邻孔中的搅拌子相互作用，从而阻碍搅拌子正常旋转，无法为培养物提供充分的通气。
观看本视频后，您应能充分掌握如何在96孔板中通过液体培养高效地进行酵母细胞孢子形成。若操作得当，掌握该技术后可在六天内完成整个过程。该方法可用于筛选不同突变菌株、质粒或小分子抑制剂对减数分裂和孢子形成的影响。
该技术建立后，被用于研究减数分裂细胞周期的调控机制，以及在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）孢子形成过程中胞质分裂与减数分裂的偶联关系。
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概述
本方案描述了在96孔板中高效诱导酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）产孢的方法，便于进行高通量筛选。该方法解决了以往在实现充分通气以获得最佳产孢效率方面存在的挑战。
关键研究组成部分
科学领域
- 微生物学
- 细胞生物学
- 遗传学
背景
- 孢子形成是芽殖酵母生命周期中的关键过程。
- 关于减数分裂和孢子形成的高通量研究一直较为有限。
- 高效的孢子形成对于遗传文库的筛选至关重要。
- 以往的方法在通气性和效率方面面临挑战。
研究目的
- 建立一种在96孔板中进行酵母孢子形成的低成本方法。
- 实现对酵母突变体的高通量筛选。
- 提高孢子形成效率，优于传统方法。
使用的方法
- 采用96孔板格式进行酵母孢子形成。
- 使用分段覆盖的2微米质粒文库。
- 优化通气条件以提高孢子形成效率。
- 筛选特定酵母突变体的高拷贝抑制因子。
主要结果
- 以高通量形式成功实现酵母孢子形成。
- 通过优化通气技术提高效率。
- 利用质粒文库进行遗传筛选的可行性。
- 展示该方法的成本效益。
结论
- 96孔孢子形成法可增强筛选能力。
- 优化通气对实现高孢子形成率至关重要。
- 该方案可促进未来对酵母遗传学的研究。
常见问题
行业重要性概述
高通量筛选酵母孢子形成表型可快速鉴定影响减数分裂和孢子形成的遗传修饰因子，有助于验证真菌生物学及相关通路中的靶点。96孔板格式为表型筛选提供了可扩展且成本效益高的平台，通过将基因型与孢子形成效率关联，提高早期发现阶段的预测可信度。该方法解决了酵母遗传学研究中的一个关键瓶颈，有助于阐明参与细胞周期调控和配子发生的靶点的作用机制，降低研究风险。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：能够对遗传文库进行筛选，以鉴定高拷贝抑制物，从而抑制孢子形成缺陷型突变体的表型，支持靶向假设的验证。
- 操作价值：适用于基于质粒的筛选，可结合营养缺陷筛选，或在丰富的产孢前期培养条件下进行基因组变异筛选。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：使用玻璃珠或磁力搅拌子优化通气条件，可确保孢子形成结果的可重复性，这对实验标准化至关重要。
- 操作价值：96孔板格式支持高通量筛选流程，所需液体操作步骤和孵育条件极少。
转化与临床前研究
- 科学价值：提供一种与疾病相关的系统，用于研究减数分裂和胞质分裂的保守机制，适用于转化生物标志物的发现。
- 操作价值：通过量化孢子形成效率作为遗传或化学修饰因子的表型读数，实现基于风险评估的推进决策。
流程与工作流整合
该方法适用于早期发现阶段的工作流程，可通过表型筛选影响孢子形成效率的酵母突变体、质粒或小分子，支持先导化合物的鉴定。
- 发现生物学：通过在适用于遗传筛选的体系中实现高效的孢子形成，支持假设验证和通路阐明。
- 筛选：提供定量的孢子形成效率测量结果（50–60%），可实现不同菌株和条件间的比较。
- 分析：通过显微镜对折光性强的四分体进行定量，为评估减数分裂进程和孢子形成提供可测量的指标。
- 转化研究：通过模拟与细胞周期调控相关的保守性减数分裂调控机制，连接临床前研究的连续性。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于筛选影响孢子形成的多种遗传扰动，减少重复的检测开发工作。
运营与企业影响
- 科学价值：通过在可扩展的体系中将基因扰动与产孢表型关联，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过控制通气的96孔板体系标准化产孢条件，增强不同团队间的实验可重复性。
- 战略价值：相较于基于摇瓶的方法，该体系以更低的成本实现大规模筛选，提高资金使用效率。
- 项目组合影响：基于产孢效率阈值支持经风险校正的靶点优先排序，减少下游验证中的假阳性结果。
实施注意事项
- 需要具备酵母操作、诱导孢子形成以及基于显微镜的表型评估方面的专业知识。
- 依赖于振荡培养箱、摇床和96孔板操作设备，以实现通气控制。
- 需对通气方法（玻璃珠与搅拌子）进行标准化，以确保各孔间氧气传递的一致性。
- 需考虑不同酵母基因型的适应性问题，包括需要选择性培养基的含质粒菌株。
- 实际局限性：孢子形成效率（50–60%）低于烧瓶法（约80%），因此在筛选实验中对阳性结果率需有相应调整的预期。
