Name: 该果蝇成虫盘瘤模型:基因的表达与肿瘤侵袭性的可视化和定量遗传马赛克 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: 学习利用果蝇眼触角成虫盘和脑组织解剖技术，结合荧光标记克隆与MARCM方法，实现基因表达变化的可视化与肿瘤侵袭性的定量分析。该方案为研究上皮发育、稳态维持及疾病机制提供了重要的实验工具。

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感谢布卢明顿果蝇品系中心（Bloomington，美国）、Dirk Bohmann、Katja Brückner 和 Istvan Ando 提供果蝇品系和抗体。感谢 Marek Jindra 和 Colin Donohoe 对本文手稿提出的修改意见。本研究工作得到了亚历山大·冯·洪堡基金会授予 M.U. 的索菲娅·科瓦列夫斯卡娅奖以及德国研究基金会 DFG 项目 UH243/1-1 的资助。

注意：本研究采用 eyFLP1; act&#62;y+&#62;Gal4，UAS-GFP；FRT82B，tub-Gal80 MARCM 82B 绿色测试品系 11将MARCM 82B绿色测试品系的处女蝇与如下品系的雄蝇杂交： w；UAS-a；UAS-bRNA干扰，FRT82B c突变 基因型将产生子代，其3号染色体右臂之间会发生有丝分裂重组rd 同源染色体。通过这种方式，获得针对该基因的纯合突变克隆 c 位于FRT82B位点远端的克隆将在EAD和脑神经上皮中产生。这些克隆将表达GFP和转基因 a 和用于基因的 dsRNA b (图1A已在果蝇研究领域建立了多种用于X、2L、2R、3L和3R染色体重组的eyFLP-MARCM测试品系，这些品系可在果蝇研究群体中获得。
1. 果蝇操作、杂交与发育阶段确定
<ol>
	<li>在室温下通过同时接种多个培养瓶来扩增合适的MARCM测试品系。每2-3天将成虫转移至新鲜培养瓶中，以便收集足够数量的处女蝇用于后续杂交实验。 
	注意：收集 virgin 时，应避免长时间暴露于 CO2 因为这会降低雌性的繁殖力。</li>
	<li>根据实验规模，使用至少10只MARCM测试用处女蝇和4只雄蝇在试管中设置果蝇杂交例如，用于荧光报告基因成像和免疫染色）或置于含有至少30只处女蝇和10只雄蝇的瓶中（例如，用于RNA提取及侵袭能力的定量分析）。</li>
	<li>在25 °C、长日照16小时光照/8小时黑暗的条件下培养子代。每隔24小时将亲本转移至新的培养管/瓶中，以确保幼虫发育阶段的可重复性，并防止过度拥挤。 
	注意：在产卵后第6天（AEL）开始，晚期三龄对照组幼虫停止进食，开始游走并进入化蛹阶段。相比之下，携带EAD的增生性或恶性克隆肿瘤幼虫，其幼虫-蛹转变的启动可能延迟或完全不发生。</li>
</ol>
2. 收集三龄幼虫
<ol>
	<li>用于免疫染色，收集约20只三龄晚期幼虫（在瓶壁上爬行且体型相近的个体）。用镊子轻轻从试管或瓶子中夹取幼虫，转移至盛有磷酸盐缓冲液（PBS）的胚胎玻璃培养皿中。
	<ol>
		<li>为进行RNA分离和侵袭性定量，收集至少80只晚期三龄幼虫（在瓶壁上爬行且体型相近的幼虫）。使用喷瓶将PBS喷入盛有幼虫的果蝇培养瓶中，直至液体覆盖幼虫表面。</li>
		<li>用刮铲软化食物表层，将含有幼虫的食物糊倒入培养皿中。用镊子轻轻夹取幼虫，转移至盛有PBS的胚胎玻璃皿中。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>用 PBS 清洗幼虫，直至去除所有残留食物。在荧光体视显微镜下以 8 至 16 倍放大倍数检查幼虫，剔除所有 &#34;豹纹幼虫&#34; 在幼虫体内随机分布有GFP阳性斑点图2A, 2B 并观察 讨论部分). 
	注意：进行RNA提取时，需在倒数第二步用70% EtOH洗涤1分钟。</li>
	<li>将含有选定幼虫的培养皿置于冰上的 PBS 中，直至解剖。应在 30 分钟内处理幼虫，以避免低温和饥饿带来的不利影响。</li>
</ol>
3. 幼虫解剖
<ol>
	<li>在体视显微镜下解剖外眼-触角盘（EAD）时，用一对镊子轻轻将幼虫中部压在玻璃培养皿底部。用第二对镊子夹住幼虫口钩并将其从身体上拉开（图2C）。 
	注意：通常拉力足以断裂连接EAD对与脑叶的视茎。如果脑组织或其部分仍附着于EAD，且后续实验不需要这些组织，可借助两对镊子剪断视茎。对于侵袭性肿瘤（例如，rasV12scrib1），随着时间推移，克隆细胞不断增殖和迁移，EAD与脑叶之间的连接会逐渐变得模糊。
	<ol>
		<li>若需制备保留完整腹神经索（VNC）的EAD/脑复合体（图2D），可用镊子在幼虫体中部剪断，并弃去后半部分。</li>
		<li>用一对镊子夹住幼虫前半部分的末端，用第二把镊子的尖端推入口钩，同时用第一对镊子将表皮向外翻卷，使幼虫内翻。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用镊子小心去除所有多余组织（例如，唾液腺、脂肪体和肠道），仅保留与口钩相连的EAD对或EAD/脑复合体。将口钩从覆盖其上的表皮中分离出来。&#160;通过切断延伸至体壁肌肉和表皮的轴突投射，释放腹神经索（图1B、2C、2D）。 
	注意：口钩有助于使用镊子安全操作组织，并在洗涤过程中促进组织更有效地沉降及便于识别。解剖后的EAD若未固定而长时间置于PBS中，形态会较快发生变化。建议将解剖时间控制在20–30分钟以内。</li>
	<li>转移组织时，通过反复吹吸残留的幼虫尸体数次，对P20移液器吸头进行预润处理。若需转移较大的EAD/脑复合体，可用剪刀剪去P20移液器吸头的尖端。 
	注意：润吸处理至关重要，可防止组织在转移过程中粘附丢失。使用P20移液器可最大限度减少PBS带入固定液中，避免不必要的稀释。
	<ol>
		<li>进行免疫染色时，将解剖得到的EAD转移至含有400 µl 4%多聚甲醛（PFA）固定液的0.5 ml离心管中。对于需评估侵袭性的较大EAD/脑复合体，则使用含1 ml PFA的1.5 ml离心管。 
		警告：PFA具有高度毒性。操作时应穿戴防护手套和衣物，避免接触皮肤、眼睛或黏膜。</li>
		<li>用于RNA提取时，将解剖得到的EAD转移至盛有冷PBS的新玻璃培养皿中。用镊子清除EAD周围的环状结构和淋巴腺，以尽量减少样本污染。</li>
		<li>用镊子切断触角盘与口钩之间的连接，使EAD从口钩上分离（图2E）。为避免RNA降解及基因表达产生假象，解剖时间应控制在30分钟以内。随后进入第7步。 
		注意：一名经验丰富的研究人员可在30分钟内完成约60只幼虫的解剖（不包括幼虫收集与清洗时间）。总RNA产量取决于EAD的大小，而EAD大小因基因型和发育阶段不同而异。从晚期三龄幼虫中解剖80–100对对照组EAD，通常可获得5–8 µg总RNA。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 固定、免疫染色与封片
<ol>
	<li>在室温下，将样品置于PFA固定液中固定25分钟，同时进行振荡。固定时间可延长至60分钟，而不会改变组织形态或蛋白质的抗原性。</li>
	<li>去除固定液，使用PBST（含0.1% Triton X-100的PBS）在振荡器上清洗样品三次，每次10分钟。每次清洗需使用足够体积的PBST（每0.5 ml离心管使用400 µl）。 
	注意：用于侵袭性评分的固定EAD/脑复合体无需进行免疫染色。GFP信号在固定后仍清晰可见。请继续执行步骤4.4进行最终解剖。
	<ol>
		<li>对于免疫染色，将组织在200 µl封闭液（含0.3% BSA的PBST）中室温轻柔振荡封闭20分钟。
		<ol>
			<li>将一抗用100 µl封闭液稀释后，于4 °C轻柔振荡孵育过夜。一抗的推荐稀释比例请参考产品说明书或已发表文献。 
			注意：一抗的稀释比例可能需要优化。</li>
			<li>在PBST中清洗五次，每次10分钟，随后将组织在封闭液中稀释的荧光二抗溶液中避光孵育，室温轻柔振荡2小时或4 °C过夜。</li>
			<li>用PBST清洗样品三次，每次10分钟。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将PBST替换为500 µl DAPI染色液。如需标记F-actin，可在DAPI染色液中加入与荧光染料偶联的鬼笔环肽。避光振荡15分钟后，用PBST清洗一次，持续10分钟。 
	注意：F-actin标记可独立于DAPI染色单独进行。</li>
	<li>在最终解剖步骤中，使用1 ml移液器将组织转移回盛有PBS的玻璃培养皿中。使用两对镊子剪除口钩结构。
	<ol>
		<li>通过切断视神经茎，将用于侵袭性定量分析的脑组织与EAD分离，因为过度生长的EAD可能干扰分析。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在载玻片上滴加一滴封片介质（22 mm × 22 mm盖玻片使用15 µl）。借助镊子尖端将介质均匀铺展成薄层。使用P20微量移液器将EAD、脑组织或EAD/脑复合体转移至封片介质中。</li>
	<li>使用镊子尖端或钨丝针在载玻片上分散组织，并拉直腹神经索（VNC）。</li>
	<li>为避免封片过程中产生气泡，先将盖玻片的一边接触封片介质，再借助镊子缓慢将其放下。使用小块滤纸或擦拭纸吸除盖玻片边缘多余的封片介质。 
	注意：DABCO/聚乙烯醇4-88封片介质在4 °C下约1小时内硬化。载玻片可在4 °C下保存数月。</li>
</ol>
5. 共聚焦成像
<ol>
	<li>使用配备20X、40X和60X油镜物镜的共聚焦显微镜获取单个共聚焦光学切片和图像序列。</li>
	<li>避免像素饱和。所有基因型样本的图像采集参数应保持一致，包括图像分辨率、激光输入功率、增益、偏移、帧平均次数以及z轴序列的步进间隔，以确保不同基因型间像素强度的可比性21,22。 
	注意：为可视化EAD/脑复合体，需生成最大投影图像，并拼接相应相邻图像。最终图像制备时，可使用图像后期处理软件进行图版组合，并调整亮度和对比度。</li>
</ol>
6. 肿瘤侵袭性的定量分析
<ol>
	<li>建立一个评分系统，用于表征不同水平的肿瘤侵袭性，该系统需考虑侵袭的空间模式以及扩散至脑和腹神经索（VNC）中的GFP阳性细胞数量。准备用于记录的评估表格（图3A）。</li>
	<li>每种基因型至少固定80个完整脑组织，并将它们置于同一张载玻片上，每个24 mm × 50 mm的盖玻片使用40 µl封片介质。
	<ol>
		<li>为确保评分无偏倚，请第三方中立人员对载玻片进行匿名化处理，以保证评分过程的盲法性。由两名实验室成员独立评估匿名化的载玻片。仅在计数完成后揭示基因型信息。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在配备GFP滤光片的荧光体视显微镜下，对封片的脑组织进行盲法评分，以评估恶性程度。使用标记物标注已观察过的脑组织，避免重复计数（图3B）。</li>
	<li>计算每种基因型中落入各定义侵袭类别的脑组织所占百分比。采用卡方检验确定统计学显著性（图3C）。</li>
</ol>
7. RNA 提取、DNase 处理及质量检测
注意：以下步骤中使用的所有试剂（溶液、塑料器皿）均应无 RNase 活性。操作有机溶剂时务必佩戴手套，并在通风橱中进行。 
<ol>
	<li>用包被的 P20 微量移液器吸头将清洁的 EAD 转移至 1.5 ml 离心管中。</li>
	<li>让组织沉降至管底，小心吸除 PBS，并加入 100 µl RNA 裂解试剂（足以处理多达 140 个 EAD）。</li>
	<li>通过涡旋震荡裂解组织。此时，样品可在液氮中速冻后于 -80 °C 保存，或直接按照标准 RNA 提取方案进行处理。 
	注意：来自多次解剖的相同基因型样品可在 RNA 裂解试剂中合并。</li>
	<li>用 RNA 裂解试剂将样品体积补至 0.9 ml。加入 0.2 ml 氯仿，剧烈混匀 15–20 秒。</li>
	<li>室温孵育 2 至 3 分钟后，在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>将含有 RNA 的无色上层水相小心转移至新的离心管中，避免扰动中间相。远离中间相，因其含有蛋白质和基因组 DNA。 
	注意：回收的体积应约为用于匀浆的 RNA 裂解试剂体积的 60%。</li>
	<li>加入 0.5 ml 异丙醇沉淀 RNA。涡旋混匀，并在室温下孵育 10 分钟。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>弃去上清液，用 600 µl 75% 乙醇洗涤 RNA 沉淀一次。短暂涡旋并离心（4 °C，10,000 × g，7 分钟）后，彻底弃去乙醇，并将离心管开口置于干净的纸巾上，使 RNA 沉淀空气干燥 5–10 分钟。 
	注意：RNA 沉淀可能呈现为管底微小的不透明/白色条带，也可能不可见。残留的乙醇液滴可用 P10 微量移液器吸头小心吸除。</li>
	<li>通过涡旋震荡或用移液器吸头反复吹打，将 RNA 溶解于 50 µl 经 DEPC 处理的水中。</li>
	<li>为最大限度减少基因组 DNA 污染，向总 RNA 中加入 50 µl 混合液（含 1 µl DNase（2 U/µl）和 10 µl 10× DNase 缓冲液，溶于 DEPC 处理的水中）进行 DNase 处理。涡旋混匀后短暂离心。</li>
	<li>在 37 °C 水浴或加热块中孵育 30 至 40 分钟。孵育结束后，向每个样品中加入 100 µl 经 DEPC 处理的水。</li>
	<li>为灭活酶活性并去除 DNase，加入 200 µl 酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）溶液，涡旋 1 分钟，然后在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 7 分钟。</li>
	<li>小心将含有 RNA 的上层水相转移至新的离心管中。加入等体积（200 µl）氯仿，混匀后重复上述离心步骤。</li>
	<li>小心收集上层水相，通过加入 1/10 体积的 3 M 醋酸钠（pH 5.2，用 DEPC H2O 配制）和 2.5 倍体积的 100% 乙醇沉淀 RNA。充分涡旋混匀。 
	注意：在沉淀混合液中加入 0.5 µl 甘油（20 µg/µl）有助于观察 RNA 沉淀。为减少 RNA 损失，建议使用硅化处理的低吸附 1.5 ml 微量离心管。</li>
	<li>在 -20 °C 下沉淀 RNA 至少 1 小时。 
	注意：孵育可过夜进行。样品也可置于 -80 °C。</li>
	<li>在 4 °C 下以 10,000 × g 离心 30 分钟使 RNA 沉淀。按步骤 7.9 的描述进行洗涤并干燥沉淀。</li>
	<li>将 RNA 溶解于 10–15 µl 经 DEPC 处理的水中。将 RNA 储存于 -80 °C。</li>
	<li>使用分光光度计在 230 nm、260 nm 和 280 nm 处测定吸光度，以确定 RNA 的浓度和纯度。根据 260 nm 处 1 OD 相当于 40 µg/ml RNA 的换算关系计算 RNA 浓度。 
	注意：&#34;纯&#34; RNA 的 A260/280 比值为 2.0，而 A260/230 比值应在 2.0–2.2 范围内。A260/280 比值在 1.7 至 2.0 之间的 RNA 样品适用于 cDNA 合成等后续实验。对于 mRNA-seq 文库制备，应使用自动化电泳系统检测 RNA 的质量和数量，28S/18S 比值应高于 1.8。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在利益冲突。

产生遗传嵌合体的技术 黑腹果蝇 是分析和操控基因功能的最先进工具之一 33. eyFLP-MARCM 系统已被证明具有强大且稳健的性能，因其能够以空间受限的方式诱导出视觉可标记且遗传学定义明确的克隆， 即，在那些组织中 无眼 增强子具有活性 9,18这一点在同一个细胞中组合多个遗传损伤时尤为重要。尽管这些高度异常的细胞克隆在仅局限于胚胎前肠（EAD）和脑神经上皮时仍允许幼虫发育，但当它们在幼虫体内广泛分布时（例如由热激调控的FLP（hsFLP）克隆），则可能导致致死效应。值得注意的是，在果蝇EAD上皮中诱导克隆，使激活的癌基因与抑癌基因的丢失相结合，可重现某些人类实体上皮性肿瘤的发生与进展过程。然而，该系统也存在一定的局限性，下文将简要讨论。由于昆虫具有开放的循环系统，因此不会出现人类癌症中所见的真正意义上的转移。因此，转移性播散这一复杂过程无法被真实地建模于 果蝇然而，诸如EAD肿瘤之类的 rasV12scrib1 克隆确实表现出恶性特征，因为它们会破坏围绕E...

癌症是遗传异质性最高的一类疾病，其发病率和死亡率在全球范围内，尤其是老年人群中急剧上升。癌症起源于一个逃逸了固有肿瘤抑制机制并失控分裂的肿瘤起始细胞，呈克隆性发生。随着促进生长、增殖和迁移的遗传损伤逐步累积，同时抑制细胞死亡和分化，最初的良性增生被逐步转化为高度恶性、可转移且致命的肿瘤。现已明确，除了遗传改变之外，肿瘤进展还需要其周围间质发生改变，并依赖肿瘤与其微环境中多种细胞类型（例如，成纤维细胞、免疫细胞和内皮细胞）之间的相互作用。深入理解包括肿瘤-间质相互作用在内的恶性转化的分子机制，对于制定癌症预防和早期筛查策略，以及开发应对癌症转移和耐药性的新型有效治疗方法具有重要意义。
果蝇 黑腹果蝇 已成为癌症研究中一个颇具吸引力的体系 1-4 由于果蝇具有快速的世代周期、在信号通路关键节点上与人类高度保守、遗传冗余度低，以及拥有丰富的先进遗传工具，可实现对几乎任何基因进行时空特异性操控。因此，能够在遗传学上明确定义、并可重复地构建出不同恶性程度的肿瘤模型 黑腹果蝇 通过在野生型组织中的部分前体细胞中利用MARCM技术引入功能获得性和功能缺失性突变 5MARCM 技术结合了由 FLP/FRT（FLP 重组酶/FLP 识别靶位点）介导的有丝分裂重组 6 使用FLP-out 7 以及 Gal4/UAS（上游激活序列） 8 靶基因表达系统 9通过该方法，任何基于UAS的转基因（包括癌基因或荧光蛋白cDNA，或用于dsRNA诱导基因沉默的反向重复DNA序列）的表达将仅限于因重组而丢失特定遗传位点及Gal4抑制子的一群细胞克隆中图1A）。用绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白标记的克隆斑块（例如， RFP、DsRed、mCherry）可在整个发育过程中被轻松追踪、分离和分析。重要的是，可将其行为与相邻的野生型组织直接进行比较。因此，与基因突变相关的细胞自主性及非自主性效应问题可得以便捷研究。类似于哺乳动物，仅当多个致癌性突变组合存在时，克隆才会在果蝇中发生恶性转化 果蝇 并重现哺乳动物癌症的关键特征。它们过度增殖，逃避凋亡，诱发炎症，获得永生性和侵袭性，最终导致宿主死亡 10-17.
在此，我们描述了一种在眼/触角和脑组织中生成遗传定义的克隆肿瘤的实验方案。 果蝇 使用MARCM技术标记幼虫。该方法依赖于一种MARCM测试品系，该品系在特定启动子控制下表达酵母FLP重组酶。 无眼 增强子（eyFLP) 18,19通过这种方法，在胚胎期和幼虫期，GFP标记的克隆可在EAD的褶边和柱状上皮以及脑的神经上皮中生成（图1A、B 和参考文献 20克隆细胞可被持续追踪至成虫阶段，因为眼成虫盘（EAD）会发育为成虫的眼、触角和头部囊，而神经上皮则产生神经母细胞，进而生成分化的视叶神经元。
为了便于对嵌合组织进行广泛的分子、功能和表型表征，我们描述了一种从三龄幼虫中分离胚胎后脑（EAD）和大脑的实验方案，并概述了如何将其用于三种不同的应用：（i）检测转基因荧光报告基因和免疫染色，（ii）量化肿瘤侵袭性，以及（iii）利用实时定量PCR（qRT-PCR）或高通量mRNA测序（mRNA-seq）分析基因表达变化（图1C）。
免疫染色方案可用于通过特异性抗体可视化任意目的蛋白。转基因荧光转录报告系统可提供特定信号通路活性的便捷且精确的时空信息。而细胞谱系特异性报告系统则反映了嵌合组织内以及不同基因型肿瘤之间细胞群体的定性和定量变化。对侵袭行为进行定量分析有助于比较不同基因型肿瘤的恶性程度。最后，描述嵌合EAD样本收集与处理以进行RNA提取的方案，适用于小规模和大规模的下游应用，分别如逆转录后接qRT-PCR以及全基因组mRNA测序。这些检测所获得的定性与定量数据为克隆性肿瘤的社会行为提供了新的见解，同时也为研究单个基因、遗传网络以及肿瘤微环境在肿瘤发生不同阶段和不同方面中的功能作用奠定了坚实的基础。

<table><tbody><tr><td>琼脂</td><td>Gew&amp;uuml;rzm&amp;uuml;hle Brecht，埃根施泰因，德国</td><td>00262-0500</td><td>果蝇培养基配方：制备20 L果蝇培养基，包含160 g琼脂、360 g酵母、200 g大豆粉、1.6 kg黄玉米粉、1.2 L麦芽提取物、300 ml淡色玉米糖浆、130 ml丙酸和200 ml 15%尼泊金。果蝇培养基应在85℃加热煮制1小时。&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>玉米糖浆</td><td>德国迈肯海姆，格拉夫沙夫特·克劳特法布里克约瑟夫·施密茨有限公司</td><td>01939</td><td></td></tr><tr><td>丙酸</td><td>卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>6026.1</td><td></td></tr><tr><td>玉米粉</td><td>ReformKontor GmbH，德国萨伦廷</td><td>4010155063948</td><td></td></tr><tr><td>麦芽提取物</td><td>CSM Deutschland GmbH，德国不来梅</td><td>728985</td><td></td></tr><tr><td>大豆粉</td><td>Stockmeier Food GmbH，德国黑尔福德</td><td>1000246441010</td><td></td></tr><tr><td>酵母</td><td>Werner Ramspeck 公司，德国施瓦巴赫</td><td>210099K</td><td></td></tr><tr><td>对羟基苯甲酸甲酯 / 尼泊金甲酯</td><td>Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬</td><td>H5501</td><td>用70%乙醇配制15%的储备液</td></tr><tr><td>果蝇培养管</td><td>Kisker Biotech，德国施泰因富特</td><td>789008</td><td></td></tr><tr><td>小瓶塞</td><td>K-TK e.K.，德国雷茨塔特</td><td>1002</td><td></td></tr><tr><td>果蝇培养瓶</td><td>Greiner Bio-One，德国弗里肯豪森</td><td>960177</td><td></td></tr><tr><td>瓶塞</td><td>K-TK e.K.，德国雷茨塔特</td><td>1002 S</td><td></td></tr><tr><td>聚乙烯醇 4-88/[-CH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CHOH-]&lt;sub&gt;n&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬</td><td>81381</td><td>封片剂配方：将6 g聚乙烯醇4-88溶解于39&amp;nbsp;毫升 Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，6 ml 1 M Tris（pH 8.5）和12.5 ml甘油。50℃下搅拌过夜&amp;nbsp;&amp;deg;C并离心20&amp;nbsp;min，5,000 rpm。向 supernatant 中加入 DABCO，使其终浓度为 2.5%。将分装样品于 -20 ℃ 保存&amp;nbsp;&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷 / DABCO&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬</td><td>D2522</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich，德国德伊森霍芬</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液／PBS</td><td></td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 和 1.8 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;，用 Millipore H 调至 pH 7.4&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>PBST</td><td></td><td></td><td>PBS 中含 0.1% Triton X-100</td></tr><tr><td>多聚甲醛 / PFA</td><td>Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬</td><td>158127</td><td>4% PFA固定液配方：溶解4&amp;nbsp;g PFA 在 80 ml Millipore H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;在55℃加热的磁力搅拌器上&amp;nbsp;&amp;deg;C. 逐滴加入 1 M NaOH，直至所有 PFA 颗粒完全溶解。加入 10 ml 10x PBS，并用 1 M HCl 调节 pH 至 7.4。混匀后加入 100 &amp;micro;l Triton X-100，并用 Millipore H₂O 定容&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O至100 ml。将分装样品储存在-20 &amp;deg;C. 避免反复冻融。（注意：PFA 具有高毒性。应在通风橱中配制 PFA 固定液，佩戴自给式呼吸器、手套和防护服。避免接触皮肤、眼睛或黏膜。）</td></tr><tr><td>牛血清白蛋白/BSA</td><td>Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬</td><td>A3059</td><td>封闭液配方：将 0.3% BSA 溶于 PBST 中</td></tr><tr><td>荧光标记的鬼笔环肽</td><td>Invitrogen，德国卡尔斯鲁厄，Molecular Probes</td><td>A12379, A22283, A22284</td><td>鬼笔环肽储备液：将粉末（300 U）溶于1.5 ml甲醇中。置于-20℃保存。 &amp;deg;C. 染色时，将 A12379 和 A22283 以 1:250 的比例稀释于 PBST 中，A22284 以 1:100 的比例稀释于 PBST 中。</td></tr><tr><td>4&amp;rsquo;6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 / DAPI</td><td>卡尔罗斯特有限公司，德国卡尔斯鲁厄</td><td>6335</td><td>DAPI 染色液：用 Millipore H₂O 配制 5 mg/ml 的储存液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，并在 4℃ 下分装保存 &amp;deg;C. 在 PBST 中以 1:1,000 的比例稀释使用。</td></tr><tr><td>小鼠抗H2抗体</td><td>Kurucz 等，2003</td><td></td><td>在封闭液中以1:500的比例稀释使用</td></tr><tr><td>Cy5标记的驴抗小鼠IgG（H+L）亲和纯化二抗</td><td>杰克逊免疫研究实验室，萨福克，英国</td><td>715-175-151</td><td>在封闭液中按1:500比例稀释使用</td></tr><tr><td>Dumont #5 镊子</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>11295-10</td><td></td></tr><tr><td>玻璃胚胎培养皿（30&amp;nbsp;mm</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>E90</td><td></td></tr><tr><td>钨针</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>10130-20</td><td></td></tr><tr><td>镀镍针头夹持器</td><td>Fine Science Tools，德国海德堡</td><td>26018-17</td><td></td></tr><tr><td>显微镜载玻片</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>631-1553</td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm 盖玻片（#1 Menzel-Gl&amp;auml;ser</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>631-1336</td><td></td></tr><tr><td>盖玻片 24 x 50 mm（0.13–0.16）&amp;nbsp;mm</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>1076371</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science 精密擦拭纸</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>06-677-70</td><td></td></tr><tr><td>体视显微镜</td><td>奥林巴斯，德国汉堡</td><td>SZX7（DF PLAPO 1X-4 日本）</td><td></td></tr><tr><td>荧光体视显微镜</td><td>奥林巴斯，德国汉堡</td><td>SZX16（SDF PLAPO 0.8X 日本）配 DP72 CCD 相机</td><td>配备用于GFP及其他蓝色激发荧光染料的窄带蓝色带通滤光片组（激发滤光片BP460-480 nm，阻断滤光片BA495-540 nm），以及用于RFP及其他绿色激发荧光染料的窄带绿色激发和长通阻断滤光片（激发滤光片BP530-550，阻断滤光片BA575IF）。软件：Olympus cellSens Standard 1.11</td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus，德国汉堡</td><td>FV1000</td><td>配备倒置 IX81 显微镜。物镜：20&amp;times; UPlan S-Apo（NA 0.85），40&amp;times; UPlanFL（NA 1.30）和60&amp;times; UPlanApo（数值孔径 1.35）。激光器：紫外激光二极管 LD405（50&amp;nbsp;毫瓦（mW），氩离子激光器，多谱线 457/(476)/488/515（40&amp;nbsp;毫瓦），黄/绿激光二极管 LD560（15&amp;nbsp;毫瓦）和红色激光二极管 635（20&amp;nbsp;毫瓦（mW）。软件：Fluoview 2.1c 软件</td></tr><tr><td>果蝇冷却培养箱</td><td>Ewald Innovationstechnik GmbH，德国巴特嫩多夫</td><td>&amp;nbsp;Sanyo MIR553</td><td></td></tr><tr><td>冲洗瓶</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>215-8105</td><td></td></tr><tr><td>BD Clay Adams 旋转混匀仪</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>15172-203</td><td></td></tr><tr><td>ELMI 数字摇床</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>DRS-12</td><td></td></tr><tr><td>5 PRIME Isol-RNA 裂解试剂</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>2302700</td><td>该方案适用于其他基于TRIzol的试剂， &lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，Sigma公司的TRIreagent（货号：T9424），Thermofisher公司的TRIzol试剂（货号：15596）。</td></tr><tr><td>焦碳酸二乙酯/DEPC</td><td>Sigma-Aldrich，德国德意志豪芬</td><td>D5758</td><td>将DEPC用Millipore H₂O按1:1,000比例稀释&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，搅拌过夜并高压灭菌。</td></tr><tr><td>超纯苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技，德国卡尔斯鲁厄</td><td>15593-031</td><td></td></tr><tr><td>氯仿</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>102445</td><td></td></tr><tr><td>TURBO DNase（2 U/μL）&amp;micro;l)</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen UltraPure 甘油</td><td>赛默飞世尔科技，英坦科技，德国卡尔斯鲁厄</td><td>10-814-010</td><td></td></tr><tr><td>三水合乙酸钠</td><td>VWR，德国达姆施塔特</td><td>27652.232</td><td>用 DEPC-H₂O 配制 3 M 醋酸钠溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 并调节 pH 至 5.2</td></tr><tr><td>2-丙醇</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>默克，德国达姆施塔特</td><td>100983</td><td>用DEPC-H₂O配制75%乙醇溶液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O.</td></tr><tr><td>UV/Vis分光光度计 NanoDrop ND-8000</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>ND-8000</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 微型离心机（制冷型）</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>5417R</td><td></td></tr><tr><td>Experion RNA StdSens 分析试剂盒</td><td>伯乐生命科学有限公司，M&amp;uuml;德国南肯</td><td>7007103</td><td></td></tr><tr><td>Experion 自动化电泳工作站</td><td>伯乐生命科学有限公司，M&amp;uuml;德国南肯</td><td>7007010</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III 逆转录酶</td><td>赛默飞世尔科技，施韦尔特，德国</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>寡核苷酸dT引物</td><td>Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶</td><td></td><td>制备100 &amp;micro;DEPC-H2O 中的 M 储存液&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O，并在 -20 保存 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>dNTP混合物</td><td>Takara Bio Europe/Clonetech，法国圣日耳曼昂莱</td><td>4030</td><td>储存25的等分试样 &amp;micro;l，置于 -20&amp;deg;C</td></tr><tr><td>CFX96 Touch 实时荧光定量 PCR 检测系统</td><td>伯乐生命医学产品（上海）有限公司，M&amp;uuml;德国南肯</td><td>1855195</td><td></td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>伯乐生命科学有限公司，M&amp;uuml;德国南肯</td><td>170-8882</td><td></td></tr><tr><td>96孔硬壳PCR板，薄壁</td><td>伯乐生命科学有限公司，M&amp;uuml;德国南肯</td><td>HSP9601</td><td></td></tr><tr><td>Microseal 'B' 薄膜</td><td>伯乐生命科学有限公司，M&amp;uuml;德国南肯</td><td>MSB1001</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; 上游引物</td><td>Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶</td><td></td><td>5' TCC TAC CAG CTT CAA GAT GAC 3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;rp49&lt;/em&gt; 反向引物</td><td>Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶</td><td></td><td>5' CAC GTT GTG CAC CAG GAA CT 3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; 上游引物</td><td>Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶</td><td></td><td>5' AGG GCG ACA AGT ACT ACA AGC TGA 3'</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;mmp1&lt;/em&gt; 反向引物</td><td>Integrated DNA Technologies，比利时鲁汶</td><td></td><td>5' ACG TCT TGC CGT TCT TGT AGG TGA 3'</td></tr></tbody></table>

drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster 已成为在完整生物体背景下研究肿瘤发生与进展功能及机制的有力实验体系。复杂的遗传嵌合体技术可诱导产生具有可视标记、遗传定义明确的克隆，其周围被正常组织包围。这些克隆可通过多种分子、细胞及组学方法进行分析。本研究描述了如何利用带有可抑制细胞标记的嵌合体分析技术（MARCM），在 Drosophila 幼虫的眼/触角成虫盘（EAD）中生成具有不同恶性程度的荧光标记克隆性肿瘤。文中详细说明了从幼虫中分离嵌合体EAD和脑组织的操作流程，以及如何对样本进行处理，以同时实现荧光转基因报告基因成像和抗体染色。为便于对嵌合组织进行分子表征，我们提供了一种从EAD中提取总RNA的实验方案。该解剖程序适用于从任何龄期的幼虫中获取EAD和脑组织。针对成虫盘的固定与染色方案可兼容多种识别 Drosophila 蛋白的转基因报告基因和抗体。RNA提取方案亦可应用于多种幼虫器官、整只幼虫以及成虫果蝇。所获得的总RNA可用于通过候选基因或全基因组范围的方法分析基因表达变化。最后，我们详述了一种量化克隆性肿瘤侵袭性的方法。尽管该方法应用范围有限，但其核心理念广泛适用于其他需要避免认知偏差的定量研究。

为了展示 eyFLP-MARCM 技术在生成具有特定基因型的 GFP 标记细胞克隆中的潜力 果蝇 EAD，诱导出三种类型的克隆：（1）仅表达GFP的对照组，（2）表达小G蛋白Ras的致癌形式（RasV12在肿瘤抑制基因纯合缺失的背景下 涂鸦 (scrib1，以及（3）过度生长但非侵袭性 rasV12scrib1jnkDN 克隆，其中通过表达其显性失活形式使 Jun 氨基末端激酶（JNK）失活（图4, 表1 （用于基因型）已证明其侵袭性 rasV12scrib1 克隆性肿瘤需要JNK信号通路及其下游转录因子的异常激活 10,12,23,24此外， rasV12scrib1 肿瘤在体内引...

本实验方案演示了如何在果蝇（Drosophila）眼/触角成虫盘（EAD）中生成带有荧光标记且遗传背景明确的克隆肿瘤。方案详细描述了如何从三龄幼虫中解剖出EAD和脑组织，并对其进行处理，以观察和定量基因表达变化及肿瘤侵袭性。

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）已成为研究肿瘤发生与进展功能及机制的有力实验体系，用于……

本方案的主要目标是演示如何解剖带有遗传定义的荧光标记克隆的果蝇眼-触角成虫盘和大脑，并对其进行处理以观察和量化基因表达变化及细胞侵袭性。所述操作步骤有助于深入理解基因在上皮发育、稳态或疾病中的作用，并揭示克隆间竞争、补偿性增殖或克隆间协作的潜在机制。本研究的主要优势在于提供了一整套专门针对果蝇遗传嵌合体进行深入定性和定量分析的实验方案。通常，初次使用果蝇模型的研究人员会遇到困难，因为他们无法将眼-触角成虫盘与其他成虫盘区分开来。为了便于识别幼虫体内带有荧光标记克隆的眼-触角成虫盘，建议在荧光显微镜下进行初步解剖。利用可抑制细胞标记物的镶嵌分析（MARCM）技术，可以在整体表型为野生型的背景下，产生遗传上明确界定的克隆区域。由眼less启动子驱动的FLP在两侧带有黄色基因标记的终止盒两侧的两个FRT元件之间催化重组。DNA复制后，FLP催化同源染色体之间的非姐妹染色单体交换，产生姐妹染色单体，其中一个携带野生型等位基因和Gal80阻遏蛋白，另一个携带突变型等位基因。在有丝分裂中，这些细胞分离产生两个子细胞，其中一个为纯合突变体，另一个为野生型。Gal80 抑制因子的缺失使得突变体细胞中 GFP 表达，而野生型细胞则保持 GFP 阴性。实验开始时，通过向果蝇培养瓶中喷入 PBS 液体以覆盖培养基表面，收集嵌合幼虫。然后用刮刀软化顶层，将含有幼虫的食物浆液倒入培养皿中。轻轻挑取幼虫并转移至盛有PBS的胚胎培养皿中。收集至少20条幼虫用于免疫染色，80条幼虫用于肿瘤侵袭性的定量分析。用 PBS 清洗幼虫以去除所有残留食物。在 8:16 倍放大倍数的荧光体视显微镜下，识别并弃去所有豹纹型幼虫，即全身呈现随机绿色荧光蛋白（GFP）阳性斑点的幼虫。将含有剩余幼虫的培养皿置于 PBS 中，并放置在冰上，直至进行解剖。在体视显微镜下解剖眼-触角成虫盘时，使用一对镊子轻轻夹住幼虫头部后约体长2/3处。用第二对镊子夹住幼虫的口钩并将其从身体上拉开。用镊子将口钩从其上方的表皮以及唾液腺、脂肪体等多余组织中仔细分离出来。或者，为制备保留完整腹神经索的眼-触角原基脑复合体，可使用镊子在幼虫身体中部进行剪切，丢弃后半部分。用一对镊子的尖端夹住幼虫前半部分的体壁，然后用第二对镊子的尖端将口钩向内推，同时用第一对镊子将表皮向外翻转，使幼虫体内翻外。小心去除所有多余组织，包括肠道、脂肪体和唾液腺。轻柔地将口钩从表皮上分离。通过切断从腹神经索延伸至肌肉和表皮的轴突投射，释放附着在口钩上的眼-触角盘脑复合体。转移组织时，先用P20微量移液器吸头反复吹打残留的体部 carcasses 数次，以使吸头内壁预吸附组织液，随后使用同一吸头转移已解剖的组织。对于较大的眼-触角盘脑复合体，可预先剪切P20吸头末端以扩大开口。将样品置于400 µL的4% PFA固定液中，在室温下以振荡方式固定25分钟。然后去除固定液，用 PBST 在旋转摇床上避光洗涤样品 3 次，每次 10 分钟。接着将 PBST 替换为 500 µL 的 DAPI 染色液，在暗处旋转染色 15 分钟。最后用 PBST 洗涤组织 1 次，每次 10 分钟。完成解剖时，使用1 mL移液器将组织转移回盛有PBS的玻璃培养皿中。使用两对镊子剪断视神经束，将用于侵袭性定量分析的脑组织与眼-触角原基分离。通过剪除口钩上的组织，游离眼-触角原基。在一张推拉式载玻片上滴加一滴封片介质，并用镊子将液体铺展成一层薄层。为了定量分析侵袭性，将每种基因型的至少80个固定完整的脑组织置于同一张载玻片上。根据需要调整并定位组织。用镊子轻轻将盖玻片的一边接触封片介质，并缓慢放下，以避免产生气泡。用实验室擦拭纸吸去盖玻片边缘多余的封片介质。此时可用共聚焦成像技术观察组织。请一位中立的第三方对切片进行匿名化处理，以确保评分的无偏性。切片应由至少两名研究人员独立评估。仅在完成评分后披露基因型信息。使用配备 GFP 滤光片的荧光体视显微镜评估恶性程度。用记号笔标记已观察过的脑组织，以避免重复计数。荧光共聚焦图像显示从携带恶性 RAS V12 scribble 突变体 GFP 标记的克隆性肿瘤的幼虫中解剖出的脑组织，经 DAPI 染色。图示代表肿瘤侵袭性的四种不同等级。无偏定量分析显示，JNK 信号通路的抑制以及 RAS V12 scribbled 一克隆能够抑制肿瘤的侵袭性。在对照组眼-触角成虫盘中，JNK 敏感的 TRE-DsRED 报告基因仅标记一条从触角部分延伸至眼部区域的狭窄细胞带。相比之下，GFP阳性恶性克隆肿瘤中TRE-DsRED活性显著增强。至第8天，肿瘤细胞过度生长并覆盖眼-触角盘，且扩散至腹神经索。侵袭性肿瘤细胞与周围组织相比，表现出更高的JNK激活水平。尽管阻断JNK明显降低了肿瘤克隆中TRE-DsRED的活性，但提高激光强度可发现克隆周围上皮细胞的信号增强。此外，hemolectin delta DsRED报告基因显示，与对照组眼-触角上皮凹陷处仅存在少量血细胞簇不同，血细胞在由恶性肿瘤组成的眼-触角及脑组织中大量聚集。当抑制JNK后，相关免疫细胞的数量显著减少。增强的肿瘤侵袭性、JNK 活性以及血细胞浸润伴随着 MMP1 mRNA 的显著上调，该结果通过 qRT-PCR 检测自解剖获得的嵌合眼-触角盘中提取的总 RNA 得到证实。熟练掌握后，可在 30 分钟内解剖超过 60 对眼盘和脑组织。在进行此操作时，重要的是要记住需产生足够数量的目标基因型幼虫。解剖时需迅速而精确，以确保用于RNA提取的样品免受RNase污染。解剖完成后，可采用蛋白质印迹法（Western blot）替代免疫染色，以评估不同基因型间蛋白质表达水平的变化。通过构建遗传嵌合体并利用所述方法进行分析，可研究原本致死的突变以及癌基因协同作用的机制。观看本视频后，您应能充分掌握如何从三龄幼虫的眼-触角成虫盘和脑组织中解剖嵌合组织，并对其进行免疫染色、转基因标记与报告基因活性的可视化、RNA提取以及侵袭性定量分析。请注意，PFA、苯酚-氯仿和 DAPI 均具有高度毒性，操作这些试剂时必须采取预防措施，例如佩戴防护手套和防护服。

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Cancer Research

癌症研究

该<em&gt;果蝇</em&gt;成虫盘瘤模型：基因的表达与肿瘤侵袭性的可视化和定量遗传马赛克

介观荧光断层成像技术突破了组织切片荧光显微镜的穿透深度限制。该技术基于多角度投影照明和光子传输模型描述。我们展示了在活体中对表达GFP的黑腹果蝇（Drosophila...

介观荧光断层成像技术 体内 发育过程成像 果蝇

利用定量PCR，我们展示了如何使用成熟的鸡胚尿囊膜模型对人肿瘤细胞向远端器官的转移进行定量分析。...

利用禽类胚胎模型对癌症转移进行定量分析

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用于肿瘤的4D活细胞成像的MAME模型：影响恶性进展的微环境相互作用

激活的癌基因（如 RASV12）与细胞极性基因（如...

一种用于头部分节复合体中良性和侵袭性肿瘤遗传诱导与可视化的方法 黑腹果蝇

黑腹果蝇Drosophila melanogaster幼虫盘的解剖与免疫染色

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用于肿瘤发病机制中候选协同基因功能基因组学分析的嵌合体斑马鱼转基因技术

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在 Drosophila 幼虫盘上皮中诱导与诊断肿瘤

本方案旨在对细胞取向和组织生长动态进行成像与分析 果蝇 果蝇在变态过程中腹部上皮的变化。本文所述方法可应用于研究不同发育阶段、组织及亚细胞结构 黑腹果蝇...

成像与分析发育过程中组织方向性与生长动态 黑腹果蝇 蛹期上皮组织

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异种肿瘤移植 黑腹果蝇 使用可编程纳升级自动注射器

本文提供了一步一步的操作方案，并附有建立异种移植瘤的技巧，以及肿瘤行为分析、全组织免疫荧光染色和共聚焦成像定量分析的指导原则。...

斑马鱼幼鱼异种移植模型的建立及肿瘤行为分析

利用具有常见患者突变驱动的免疫健全、同源性肿瘤模型进行临床前测试，对免疫治疗研究至关重要。本方案描述了一种通过电穿孔递送质粒DNA来构建脑肿瘤小鼠模型的方法，该模型可模拟常见患者突变，从而提供一种准确、可重复且稳定的小鼠模型。...

建立脑肿瘤模型 体内 利用电穿孔法递送代表患者突变特征的质粒DNA

学习利用果蝇眼触角成虫盘和脑组织解剖技术，结合荧光标记克隆与MARCM方法，实现基因表达变化的可视化与肿瘤侵袭性的定量分析。该方案为研究上皮发育、稳态维持及疾病机制提供了重要的实验工具。

Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

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