该果蝇成虫盘瘤模型:基因的表达与肿瘤侵袭性的可视化和定量遗传马赛克
2016年10月6日
该协议将演示如何生成的果蝇眼睛/触角成虫盘（EAD）荧光标记，基因定义克隆肿瘤。它介绍了如何从第三龄幼虫，以及如何处理它们的可视化和量化基因表达的变化和肿瘤的侵袭性解剖EAD和大脑。
该协议的总体目标是演示如何解剖果蝇眼触角假想盘和大脑，携带遗传定义的荧光标记克隆，以及如何处理它们以可视化和量化基因表达变化和细胞侵袭性。所描述的程序有助于为基因和上皮发育、体内平衡或疾病的作用提供新的见解，并剖析它们的竞争、代偿性增殖或克隆间结合的潜在机制。该研究的主要优点是我们提供了一整套量身定制的方案，用于果蝇遗传镶嵌的深入定量和定性分析。
一般来说，刚接触果蝇模型的个体会很挣扎，因为他们无法从另一个假想盘中识别眼触角假想盘。为了便于识别幼虫体内带有荧光标记克隆的眼触角假想盘，建议在荧光显微镜下进行初步解剖。使用可抑制细胞标记物或 MARCM 进行镶嵌分析，能够在其他表型野生型环境中生成遗传定义的克隆斑块。
由无眼启动子驱动的 FLP 催化两个 FRT 元件之间的重组，该元件位于标有黄色基因的终止盒两侧。DNA 复制后，FLP 催化同源染色体之间非姐妹染色单体的交换，产生姐妹染色单体。一个携带野生型等位基因和 Gal80 阻遏蛋白，另一个携带突变体。
在有丝分裂中，这些细胞分离产生两个子细胞，一个是纯合突变体，另一个是野生型。Gal80 阻遏蛋白的缺失允许在突变体中表达 GFP，而野生型细胞保持 GFP 阴性。实验开始时，通过将 PBS 喷入果蝇瓶中以覆盖食物表面来收获花叶幼虫。
然后用刮刀软化顶层，将含有幼虫的食品浆倒入培养皿中。轻轻挑选幼虫并将它们转移到装满 PBS 的胚胎培养皿中。收集至少 20 只幼虫用于免疫染色，收集 80 只幼虫用于肿瘤侵袭性定量。
用 PBS 清洗幼虫以去除所有残留的食物。使用 8：16 倍放大倍率的荧光立体显微镜识别并丢弃所有豹子幼虫，这些幼虫是那些在全身显示随机 GFP 阳性点的幼虫。将含有 PBS 中剩余幼虫的培养皿放在冰上直至解剖。
为了在立体显微镜下解剖眼触角假想盘，使用一对镊子并轻轻抓住幼虫在头部后方大约 2/3 体长处。用第二对镊子抓住幼虫的嘴钩并将它们从身体上拉开。使用镊子将口钩从覆盖的角质层和外来组织（如唾液腺和脂肪体）上解开。
或者，为了准备眼睛触角盘脑复合物，保持腹侧神经索完整，使用镊子在身体中间切下幼虫。丢弃后半部分。用一对镊子的尖端握住幼虫体的前半部分，然后用第二对镊子的尖端将口钩向内推，并用第一对镊子将角质层卷过来，将幼虫从内向外翻转。
小心去除所有外来组织，包括肠道、脂肪体和唾液腺。轻轻地将口钩从角质层上拉开。通过切断从腹侧神经索延伸到肌肉和表皮的轴突突起，释放附着在口钩上的眼触角盘脑复合体。
要转移组织，首先通过上下移液数次来涂覆 P20 微量移液器吸头，然后使用相同的吸头转移解剖的组织。要转移较大的眼触角椎间盘脑复合物，请预先剪断 P20 尖端以扩大开口。章动时，将样品在 400 微升 4% PFA 固定剂中，在室温下固定 25 分钟。
然后去除固定剂，用 PBST 洗涤样品 3 次，每次 10 分钟，并进行章动。接下来，用 500 微升 DAPI 染色液替换 PBST，并在黑暗中章动 15 分钟。用 PBST 洗涤组织一次，每次 10 分钟。
要完成解剖，请使用 1 毫升移液器将组织转移回装满 PBS 的玻璃皿中。使用两对镊子通过切割视杆将用于量化侵入性的大脑与眼触角盘分开。通过将眼触角盘从口钩上剪下来释放它们。
将一滴封固剂滴在外展载玻片上，并使用镊子将液体分散成薄层。为了量化侵袭性，将每种基因型的至少 80 个固定的完整大脑放在一张载玻片上。根据需要拉直和定位组织。
轻轻地将盖玻片的一个边缘接触培养基，然后用镊子慢慢降低，以避免产生气泡。使用实验室抹布吸收边缘多余的封固剂。现在可以使用共聚焦成像检查组织。
请中立方对幻灯片进行匿名化处理，以便评分公正。并让至少两名研究人员独立评估幻灯片。仅在评分完成后披露基因型。
在配备 GFP 滤光片组的荧光立体显微镜下评估恶性程度。使用标记标记已经查看过的大脑以避免重复计数。荧光共聚焦图像显示从携带恶性 RAS V12 涂鸦突变 GFP 标记的克隆肿瘤幼虫中解剖的大脑，这些肿瘤用 DAPI 染色。
这些面板代表了肿瘤侵袭性的四个不同等级。无偏倚定量显示，抑制 JNK 信号传导和 RAS V12 草草地显示一个克隆抑制了肿瘤侵袭性。在对照眼触角盘中，JNK 敏感的 TRE-DsRED 报告基因仅标记从触角到眼部的窄条带细胞。
相比之下，TRE-DsRED 活性在 GFP 阳性恶性克隆肿瘤中显着增强。到第 8 天，肿瘤细胞超过眼触角盘并扩散到腹侧神经索。与周围组织相比，侵袭的肿瘤细胞也显示出 JNK 活化增加。
虽然阻断 JNK 明显降低了肿瘤克隆中的 TRE-DsRED 活性，但增加激光强度揭示了与克隆相邻的上皮细胞的增强。此外，血凝素 delta DsRED 报告基因显示，与在对照眼触角上皮的凹陷中发现的少数血细胞簇相比，血细胞积聚在由恶性肿瘤组成的眼睛触角和脑组织中。抑制 JNK 后，相关免疫细胞的数量急剧减少。
通过使用从解剖马赛克眼触角盘中分离的总 RNA，通过 QRTPCR 确定增强的肿瘤浸润性、JNK 活性和血细胞浸润伴随着 MMP1 mNRA 的显着上调。一旦掌握，可以在 30 分钟内解剖 60 多对眼盘和大脑。在尝试此过程时，重要的是要记住产生足够数量的所需基因型的幼虫。
解剖时要快速但精确，以保持用于 RNA 分离的样品不含 RNS。解剖程序后，western blot 可用作免疫染色的替代方法，以评估不同基因型之间蛋白质表达的变化。创建遗传镶嵌物并使用所述程序对其进行分析，可以研究其他致命突变和癌基因公司的机制。观看此视频后，您应该对如何解剖第三龄幼虫的眼触角盘和大脑的马赛克组织以及如何处理它们进行免疫染色、转基因和端性的可视化有很好的了解， RNA 提取和侵袭性定量。
请注意，PFA 以及苯酚-氯仿和 DAPI 具有剧毒，在使用这些试剂时应始终采取预防措施，例如佩戴防护手套和穿衣服。
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概述
该协议展示了如何解剖果蝇眼天线想象盘和大脑，以可视化和量化基因表达变化和肿瘤侵袭性。它提供了一套全面的协议，用于分析基因定义的荧光标记克隆。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 遗传学
- 发育生物学
背景
- 果蝇是研究遗传马赛克的模型生物。
- 眼天线想象盘对理解上皮发育至关重要。
- 荧光标记有助于识别特定克隆。
- 理解基因竞争和增殖对于洞察疾病机制至关重要。
研究目的
- 提供解剖果蝇组织的协议。
- 可视化克隆肿瘤中的基因表达变化。
- 量化肿瘤侵袭性和细胞相互作用。
使用的方法
- 解剖第三龄幼虫以获得眼天线盘和大脑。
- 使用荧光显微镜进行初始解剖。
- 使用可抑制细胞标记的马赛克分析（MARCM）。
- 遗传马赛克的定量和定性分析。
主要结果
- 成功产生荧光标记的克隆肿瘤。
- 在果蝇模型中可视化基因表达变化。
- 洞察细胞侵袭性和竞争的机制。
- 增强对上皮稳态和疾病的理解。
结论
- 该协议能够详细分析果蝇的遗传相互作用。
- 荧光标记促进克隆动态的研究。
- 研究结果有助于理解发育生物学和疾病机制。
常见问题
Executive Industry Relevance
The Drosophila imaginal disc tumor model provides a genetically tractable system for mechanistic de-risking of oncogenic pathways and tumor-stroma interactions in a whole-organism context. By enabling visualization and quantification of gene expression changes and cellular invasiveness in defined genetic mosaics, the approach supports target validation and phenotypic screening in early discovery. It offers a disease-relevant system for assessing mechanistic drivers of tumor progression with predictive confidence for downstream translational efforts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing gene expression changes in fluorescently marked clonal tumors.
- Scientific Value: Supports functional target validation through MARCM-generated mosaics that isolate mutant clones in wild-type tissue.
- Scientific Value: Facilitates biological de-risking by quantifying tumor invasiveness and associated stromal responses such as hemocyte infiltration and MMP1 upregulation.
Screening & Assay Development
- Operational Value: Provides a standardized dissection and fixation workflow for preparing eye-antennal discs and brains for immunostaining and transgenic reporter visualization.
- Operational Value: Enables quantitative assessment of invasiveness through blinded scoring of blinded slides by multiple researchers, reducing cognitive bias.
- Operational Value: Supports RNA isolation from dissected tissues for gene expression profiling via qRT-PCR or genome-wide approaches.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Links genetic manipulations to phenotypic outcomes in a disease-relevant system modeling epithelial tumor progression.
- Translational Value: Supports mechanistic de-risking by connecting JNK signaling inhibition to reduced tumor invasiveness and immune cell recruitment.
- Translational Value: Offers a platform for testing genetic or pharmacological modifiers of tumor-stroma interactions in vivo.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by providing a scalable system for hypothesis testing, pathway clarification, and phenotypic readouts that inform lead identification and preclinical prioritization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through visualization of transgenic reporters and antibody staining in defined genetic mosaics.
- Screening: Enables assay readiness via standardized tissue recovery, fixation, and staining protocols compatible with multiple transgenic lines and antibodies.
- Analytics: Generates quantitative outputs such as invasiveness scores and gene expression levels that allow comparative analysis across genotypes.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by modeling tumor invasiveness and stromal engagement in a whole-organism context.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for studying genetic interactions, oncogene cooperation, and tumor progression mechanisms across multiple larval stages and genotypes.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence by reducing mechanistic ambiguity in tumor-stroma and genotype-phenotype relationships.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized dissection, fixation, and blinded quantification procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early assessment of oncogenic potency and microenvironmental engagement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing quantitative data on tumor aggressiveness and molecular markers of progression.
Implementation Considerations
- Requires expertise in Drosophila handling, fluorescent microscopy, and genetic mosaic techniques such as MARCM.
- Dependent on instrumentation including fluorescent and confocal microscopes, microtomes for slide preparation, and RNA isolation tools.
- Necessitates cross-team standardization for tissue dissection, staining, and scoring to ensure consistency across users and experiments.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to different larval stages, genotypes, or transgenic reporters.
- Includes practical limitations such as the need for large larval numbers (≥80 for invasiveness quantification) and careful handling to avoid RNA degradation during dissection.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:16
Genetic Crosses and Collection of Third Instar Larvae
3:10
Dissection of Larvae
4:52
Fixing and Staining of Tissues
5:58
Tissue Mounting and Quantification of Tumor Invasiveness
7:10
Results: Visualization, Tumor Quantification, and Gene Expression
9:04
Conclusion
