在拟南芥原生质体转染昼夜的表型有荧光时钟记者的快速分析
September 17th, 2016
生物钟的调节有关拟南芥转录组的三分之一，但基因的反馈到报时的比例尚不清楚。在这里，我们可视化的方法来使用一昼夜记者在原生质体瞬时表达的荧光成像拟南芥突变体的任何行快速评估昼夜的表型。
该测定的总体目标是通过测量转染原生质体发出的发光来确定拟南芥系中的昼夜节律周期。这种方法可以帮助回答昼夜节律生物学领域的关键问题，例如哪些基因反馈到计时机制本身。该技术的主要优点是它允许快速分析任何拟南芥突变体的昼夜节律周期，而无需生成稳定的转基因品系。
要开始此过程，请标记培养皿并向其中添加 10 毫升过滤的无菌酶溶液。将四条高压灭菌胶带固定在干净的实验室表面上，粘性面朝上，并在条带上标记培养皿的大小。从成长室收集计划。
剪下四周龄植物的叶子，将上表皮压在高压灭菌带上，使下表皮表面朝上。将魔术胶带条贴在下表皮表面。使用 15 毫升锥形管，轻轻地将条带压在叶子上，注意不要压碎叶组织。
小心地撕下胶带，剥去下表皮并露出叶肉细胞。接下来，剪下高压灭菌带以适合培养皿，然后用镊子将胶带移动到培养皿中，并将其漂浮在酶溶液上，叶子朝下。在平台摇床上以 60 RPM 旋转 60 分钟，在此期间原生质体将释放到溶液中。
60 分钟后，用镊子去除并丢弃高压灭菌胶带条。使用大口径移液器吸头，将含有原生质体的溶液移液到 15 毫升锥形管中。将原生质体在 4 摄氏度下以 100 gee 离心 3 分钟，然后小心去除上清液，因为沉淀非常松散。
向原生质体中加入 10 毫升 W5 溶液，然后通过轻轻旋转试管重悬。取出等分试样的原生质体进行计数。将原生质体放在冰上 30 到 60 分钟。
当原生质体在冰上时，通过在血细胞计数器中计数原生质体来评估产量。通过在 4 摄氏度下以 100 gee 离心 3 分钟来收集原生质体。小心去除上清液，因为沉淀非常松散。
最后，将原生质体重悬于 MMg 溶液中至浓度为每毫升 500， 000 个原生质体。通过将 10 μL 报告质粒添加到 15 mL 锥形管中，然后加入 400 μL 原生质体来开始原生质体转染程序。加入一体积的聚乙二醇或 PEG 溶液，轻轻倒置试管 12 次以转染原生质体。
在室温下孵育 8 至 15 分钟。原生质体必须孵育足够长的时间以确保高效转染，但不能孵育太久，因为这会降低它们的活力。接下来，用 4 体积的 W5 溶液稀释原生质体 DNA PEG 混合物，然后轻轻倒置 6 次混合。
在室温下以 100 gee 离心 2 分钟，收集转染的原生质体。用移液管除去上清液，再次要非常小心，因为沉淀非常松散。将原生质体重悬于 1， 250 μL 成像溶液中。
原生质体应该相当容易重悬，表明它们在转染后是完整的。将每孔 200 微升分装到 96 孔板的 6 个重复孔中，并用 W5 溶液填充任何空孔。用适合发光成像的透明粘性盖子密封板。
为了对原生质体进行成像，将 96 孔板转移到任何适合植物成像的发光成像装置中。转移后 10 至 15 分钟更换板上的胶盖，以避免孔之间出现冷凝和压力差。开始成像。
在室温下每 45 分钟读取一次板，持续 5 天。随后，使用任何分析软件（例如生物节律分析软件系统）分析发光结果。通过该方案分离的叶肉原生质体以 200 倍的放大倍数显示在该图像中。
原质体是野生型拟南芥，在 5 天内转染 cca1/lhy 突变体并在酶标仪上以恒定光照成像。正如预期的那样，该突变体中时钟控制基因表达的自由运行期缩短了。相反，ztl 突变体原生质体中的昼夜节律振荡时间延长。
在过表达 CCA1 的原生质体中，报告基因构建体表达没有振荡，因为 CCA1 的过表达会导致心律失常。该条形图显示了基于野生型和时钟突变原生质体中的发光轨迹的昼夜节律周期估计值。这些昼夜节律周期与使用耗时的转基因方法从整株植物生成的已发表数据一致。
在尝试此程序时，重要的是使用健康的植物并小心处理原生质体，因为它们很脆弱。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四个小时内完成。观看此视频后，您应该对如何分离、转染和成像拟南芥原生质体有很好的了解。
这些技术现在可以应用于任何突变细胞系，甚至可以对其进行修改以对其他植物物种的原生质体进行成像。
概述
本研究提出了一种使用质壁分离体发光成像评估拟南芥昼夜节律表型的方法。该技术允许快速分析各种突变系的昼夜周期，无需稳定的转基因系。
关键研究组成部分
科学领域
- 昼夜生物学
- 植物生理学
- 遗传分析
背景
- 昼夜钟影响着拟南芥转录组的大部分。
- 了解哪些基因对计时有贡献对于昼夜生物学至关重要。
- 传统方法需要稳定的转基因系，而这些需要耗费大量时间来创建。
- 这种新方法通过使用短暂表达的昼夜报告基因简化了过程。
研究目的
- 确定拟南芥系的昼夜周期。
- 识别反馈到昼夜计时机制的基因。
- 提供一种快速有效的方法来分析突变系的昼夜节律。
使用的方法
- 从拟南芥叶片中分离叶肉质壁分离体。
- 用发光昼夜报告基因转染质壁分离体。
- 测量发光以评估昼夜节律。
- 使用专门的软件分析发光数据。
主要结果
- 展示了能够测量各种拟南芥突变体的昼夜周期的能力。
- 确认cca1/lhy突变体表现出缩短的自由运行周期。
- 显示ztl突变体的昼夜振荡周期延长。
- 通过传统转基因方法验证该方法。
结论
- 该方法允许快速评估拟南芥的昼夜节律。
- 它可以应用于任何突变系，增强昼夜生物学的研究。
- 未来的应用可能扩展到其他植物种类。
常见问题
Executive Industry Relevance
Rapid phenotyping of circadian clock function in Arabidopsis protoplasts using luminescent reporters enables accelerated target validation and mechanistic de-risking in plant biology R&D. This approach streamlines the assessment of genetic perturbations on circadian regulation, supporting predictive confidence at early discovery inflection points. The method's flexibility allows broad portfolio screening without the bottleneck of generating stable transgenic lines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of gene function in circadian regulation through transient reporter assays.
- Facilitates rapid biological de-risking by distinguishing mutants with altered clock phenotypes.
- Supports predictive confidence in target selection by providing quantitative period measurements.
- Accelerates portfolio triage by allowing high-throughput mutant screening.
Screening & Assay Development
- Prepares validated protoplast-based systems for downstream functional genomics workflows.
- Delivers standardized, reproducible luminescent readouts for quantitative assay development.
- Enables scalable screening of diverse genetic backgrounds without stable transformation.
- Supports reliable evaluation of gene perturbations in a controlled environment.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with translational biomarker strategies by linking gene function to circadian outputs.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation in plant systems.
- Reduces risk in advancing candidates by confirming mechanistic impact on clock function.
- Offers predictive de-risking for traits relevant to agricultural productivity.
Pipeline & Workflow Integration
This luminescent protoplast assay fits at the interface of early discovery and lead identification, enabling rapid hypothesis testing and functional screening before resource-intensive transgenic work.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of gene function in circadian regulation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative luminescence data for comparative analysis.
- Analytics: Generates time-series outputs suitable for statistical period estimation and phenotype classification.
- Translational Research: Bridges discovery findings to preclinical validation in plant models.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse mutant and species backgrounds.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable, and reproducible phenotyping workflows.
- Strategic Value: Enables faster go/no-go decisions and improves capital efficiency in early R&D.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of genetic targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protoplast isolation, transfection, and luminescent imaging.
- Needs access to plate-based luminescence readers and compatible analysis software.
- Demands careful handling and standardization to ensure protoplast viability and data quality.
- Adaptable to other plant species with protocol optimization.
- Limited by the transient nature of reporter expression and protoplast stability.
