Name: 核酸的聚苯胺传感器 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-01T10:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学习使用聚苯胺传感器进行核酸的无标记检测方法，该技术无需酶处理即可区分单核苷酸差异。此方法成本低廉、操作简便，适用于RNA和DNA的直接检测，在诊断技术领域具有重要应用前景。

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作者无任何利益冲突需要披露。

1. 可加工聚苯胺的合成
<ol>
	<li>在250 ml圆底烧瓶中，将苯胺（1 ml，11 mmol）完全溶解于60 ml氯仿中。以600 rpm搅拌5分钟，并用冰浴冷却至0–5 °C，通常需要15–20分钟（图2A）。</li>
	<li>在圆底烧瓶中，于600 rpm搅拌条件下，将十二烷基苯磺酸钠（NaDBS）（7.44 g，21 mmol）加入苯胺溶液中。</li>
	<li>将过硫酸铵（APS）（3.072 g，13.5 mmol）溶解于20 ml水中，并在30分钟内逐滴全部加入，以避免反应过热。</li>
	<li>在0–5 °C下反应24小时，随后让反应体系在室温下继续放置24小时。</li>
	<li>观察反应混合物的颜色变化：15分钟后变为乳白色，2小时后变为深棕色，24小时后最终变为深绿色（图2B–F）。</li>
	<li>使用布氏漏斗过滤PANI-NaDBS溶液。将滤液转移至分液漏斗中，加入80 ml氯仿和120 ml水进行混合（图2G）。</li>
	<li>室温下静置24小时，从分液漏斗中收集深绿色的PANI，未反应的NaDBS和APS则保留在水相上清液中。</li>
</ol>
2. PANI探针混合与紫外照射
<ol>
	<li>用氯仿-水（1:3 v/v）将PANI溶液稀释10倍，并在微量离心管中将200 µl稀释后的PANI与6.4 µmol探针DNA寡核苷酸通过轻轻摇动混合15分钟。</li>
	<li>将PANI-DNA溶液置于交联仪中，以1,200 µJ/cm2的紫外线照射2分钟。紫外线照射必须严格控制在指定剂量内；过量照射会损害PANI的荧光变化，可能是由于PANI与DNA发生共价交联所致。</li>
	<li>在17,000 × g离心6分钟以沉淀复合物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。再次离心后，将沉淀重悬于PBS中。</li>
</ol>
3. PANI-探针的杂交
<ol>
	<li>向 200 µl PANI-探针复合物中加入 8 µl 100 µM 的互补 DNA 寡核苷酸或目标核酸。</li>
	<li>在 40 °C 下轻轻摇动反应液 15 分钟，进行杂交反应。</li>
	<li>在 17,000 x g 离心 6 分钟，沉淀 PANI 复合物，用 PBS 洗涤后重悬于水中。</li>
</ol>
4. 发射稳态荧光测量
<ol>
	<li>将不同处理的PANI加入96孔微孔板中，在250 nm激发波长下测定270-850 nm范围内的发射荧光。PANI的发射峰应在约500 nm处出现。</li>
</ol>
5. 杂交双链的荧光显微镜检测
<ol>
	<li>将PANI涂覆液滴加到硼硅酸盐玻璃盖玻片上，在40 °C下干燥48小时。</li>
	<li>在干燥的PANI薄膜上加入探针（8 µl，100 µM），并用紫外光（1,200 µJ/cm2）照射2分钟。</li>
	<li>用PBS洗涤PANI-探针薄膜，并在40 °C下干燥48小时。</li>
	<li>加入靶核酸进行15分钟杂交反应，靶核酸可以是生物样品或对照寡核苷酸（8 µl，100 µM），随后用PBS洗涤。</li>
	<li>使用500 nm长通滤光片，在40倍放大下获取荧光图像。</li>
</ol>

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<li>Chang, H., Yuan, Y., Shi, N., Guan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemical+DNA+Biosensor+Based+on+Conducting+Polyaniline+nanotube+Array%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Electrochemical DNA Biosensor Based on Conducting Polyaniline nanotube Array.</a> Anal. Chem. 79, 5111-5115 (2007).</li>
<li>Zhu, N., Chang, Z., He, P., Fang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrochemically+fabricated+polyaniline+nanowire-modified+electrode+for+voltammetric+detection+of+DNA+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Eletrochim.+Acta%22%5BJournal%5D)">Electrochemically fabricated polyaniline nanowire-modified electrode for voltammetric detection of DNA hybridization.</a> Eletrochim. Acta. 51, 3758-3762 (2006).</li>
</ol>

本工作由南密西西比大学理学院与技术学院、密西西比学院理学院与技术学院以及密西西比 INBRE 项目资助（美国国立普通医学科学研究所资助编号 P204M103476）。

基于聚苯胺（PANI）的核酸传感器需要将聚合物溶于水中，以实现与DNA和RNA的相互作用。PANI在水中的分散通过使用表面活性剂形成胶束来实现，如先前报道所述8。除本实验所用的NaDBS外，其他阴离子表面活性剂（如4-磺基苯二酸十二酯）、非离子型表面活性剂（如壬基酚聚氧乙烯醚）或阳离子表面活性剂（如十六烷基三甲基溴化铵）也可用于可加工性PANI的合成9,10。本方法的合成起始于将阴离子表面活性剂NaDBS以2:1的摩尔比加入单体苯胺中。NaDBS具有较高的亲水-亲油平衡值（HLB），可在氯仿-水体系中通过在胶束状聚合物油滴与水相之间建立平衡，促进苯胺单体的乳液聚合。随后以1:1.5的摩尔比加入氧化剂APS，生成不断增长的PANI胶束，其中内部核心起到成核剂的作用。这促使单体以头尾相连的方式连接，同时使PANI与周围溶剂保持动态平衡11,12。反应以受控方式进行，直至形成高分子量的聚合物13。本方案所制备的颗粒尺寸范围为50 nm至1,500 nm3。实现PANI缓慢生长但仍保持可溶性的关键在于缓慢加入氧化剂APS、低温条件以及避...

共轭聚合物为分子传感器提供了多种选择，包括荧光、电子和比色响应1。已有大量研究致力于将共轭聚合物应用于核酸传感器中。然而，大多数系统需要二级检测，限制了传感方式的选择2。最近，我们报道了一种基于聚苯胺（PANI）的共轭聚合物传感器平台，该平台利用了这种聚合物的特性，构建出一种无需标记的检测系统3。PANI 是一种高度共轭的电活性聚合物，具有荧光和电阻等适合用于生物体系检测的性质4。其结构中的激子不局限于局部，导致正电荷在单体单元之间具有迁移能力。这形成了一个灵活的正电荷支架，可与DNA的带负电骨架发生相互作用5,6。重要的是，通过静电作用结合的DNA具有特定取向，使得含氮碱基能够参与碱基配对。DNA的结合会改变PANI的电子特性，而这一效应可通过紫外照射进一步增强（图1）3。利用该系统，可将与目标核酸互补的寡核苷酸固定在PANI上。多项研究表明，在发生杂交后，由于构象转变为双链DNA结构，原本通过静电吸附在PANI或其他阳离子基质上的寡核苷酸会从基质上解离3,5,7。
在探针结合可调控共轭聚合物性质的传感器系统中，杂交事件的转导无需对探针或目标核酸进行标记或酶学修饰。共轭聚合物在检测方法上具有高度灵活性，其中一种方法是荧光检测。通过监测聚苯胺（PANI）的荧光信号，可检测低至10-11 M（10 pM）的目标核酸浓度3。该检测方法快速，在杂交发生后15分钟内即可完成；同时具有高特异性，能够区分目标分子中单个碱基的错配3。
PANI传感器的制备过程简便直接。采用标准合成方法，以苯胺单体、表面活性剂以及可控添加的氧化剂进行反应，可制备出高分子量且在水中分散性良好的PANI。产率可非常高，通过水洗可去除未反应的氧化剂，从而确保PANI不再继续生长。PANI与探针的结合在混合后可自发进行，适度的紫外照射有助于促进复合物的形成。杂交反应可立即进行，短时间孵育后即可检测PANI荧光的变化。该技术的简便性使其易于被众多实验室所采用。

<table><tbody><tr><td>苯胺&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A7401-500&amp;nbsp;</td><td>ACS级，液体，冷藏</td></tr><tr><td>过硫酸铵</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>A682-500&amp;nbsp;</td><td>ACS级，结晶状</td></tr><tr><td>十二烷基苯磺酸钠</td><td>Pfaltz &amp; Bauer&amp;nbsp;</td><td>D56340&amp;nbsp;</td><td>95% 固体</td></tr><tr><td>氯仿</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>MCX 10601&amp;nbsp;</td><td>液体</td></tr><tr><td>DNA引物</td><td>MWG operon</td><td>n/a</td><td>定制DNA序列，约20&amp;nbsp;bp</td></tr><tr><td>微孔板&amp;nbsp;</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>1402-9800&amp;nbsp;</td><td>96孔，聚丙烯材质（因其对氯仿无反应性）</td></tr><tr><td>微孔板密封膜</td><td>USA Scientific&amp;nbsp;</td><td>2920-0000&amp;nbsp;</td><td>减少孔间污染、样品溢出和蒸发</td></tr><tr><td>显微镜盖玻片</td><td>Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>12-544-D&amp;nbsp;</td><td>在经紫外照射的盖玻片上涂覆聚苯胺（PANI）</td></tr><tr><td>紫外交联仪&amp;nbsp;</td><td>UVP&amp;nbsp;</td><td>HL-2000&amp;nbsp;</td><td>能量：X100 &amp;mu;J/cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;；时间：2分钟</td></tr><tr><td>杂交炉</td><td>VWR</td><td>01014705 T</td><td>温度：400&amp;nbsp;&amp;#176;C；振荡15分钟</td></tr><tr><td>玻璃器皿&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>三颈圆底烧瓶用于反应；滴液漏斗、塞子、冷凝管、分液漏斗</td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Leica Microsystems&amp;nbsp;</td><td>Leica IMC S80</td><td>放大倍数20X；伪彩色536 nm；曝光时间86毫秒；增益1.0x；伽马值1.6</td></tr><tr><td>微孔板读数仪</td><td>Molecular Devices&amp;nbsp;</td><td>89429-536</td><td></td></tr></tbody></table>

一种基于聚苯胺的核酸传感器

A Polyaniline-based Sensor of Nucleic Acids

核酸检测是当前研究和临床诊断技术的核心。这些技术所采用的标准方法依赖于酶促修饰，可能引入偏差和假象。下一代检测平台的一个关键要素将是直接的分子传感，从而避免扩增或标记的需要。先进的纳米材料可能提供合适的化学特性，以实现无标记传感器。共轭聚合物非常适合生物传感，因其具有与生物分子相容的特性，并对局部环境变化表现出高灵敏度。本文介绍了一种利用导电聚合物聚苯胺检测核酸的方法。与目标核酸互补的简单DNA“探针”寡核苷酸通过静电作用固定在聚合物上，构建出能够区分目标分子中单个核苷酸差异的传感器系统。该技术不仅具有高度特异性和无偏倚的特点，而且成本效益极高。

图 2A 记录聚合反应开始时的反应体系设置， 即，APS 添加前。胶束的形成是反应过程的初始步骤——聚苯胺（PANI）在胶束界面处合成。 图 2B 5 分钟后呈现乳白色溶液。加入 APS 30 分钟后，反应液变为微棕色。 图2C 显示与寡聚体形成相关的颜色变化。 图 2D 4小时后呈现深棕色，表明存在高浓度的短链PANI，与反应速率极慢的情况一致。最终在48小时后，可观察到高分子量PANI形成的深绿色溶液，分散于氯仿-水体系中图 2E). 图 2F 在分液漏斗中显示出均匀分散的均相PANI溶液，无相分离现象。
检测核酸可在乳液中进行（图2）或滴涂薄膜的表面（图3）。聚...

核酸是评估生物系统的常见分析物；然而，酶学操作可能引入偏差，令人担忧。本文介绍了一种使用聚苯胺进行核酸无标记检测的方法。这种灵敏且成本效益高的传感器技术能够区分分子间单个核苷酸的差异。

核酸检测是研究和临床诊断技术的核心。这些技术中常用的标准方法……

本实验的总体目标是合成可分散于水中的聚苯胺，用于无标记检测核酸。该技术是一种经济高效的核酸检测方法。采用该技术的实验室会发现其操作简便、结果可靠且灵敏度高。该技术的主要优势在于无需标记，可直接用于检测RNA和DNA，无需进行酶促操作。该技术在新型诊断技术领域具有广阔前景，且由于无需使用标记物，因此可用于处理患者样本，操作步骤极少。直观的演示将有助于阐明该传感器的工作原理。该平台涵盖了聚合物科学和生物学，这些内容看似非常奇特，但实际上却异常容易实现。在250 ml圆底烧瓶中，将苯胺完全溶解于60 ml氯仿中。在600 RPM转速下搅拌5分钟后，用冰将溶液冷却至0至5摄氏度。这通常需要15至20分钟。接下来，在圆底烧瓶中将十二烷基苯磺酸钠加入苯胺溶液，同时以600 rpm的速度搅拌。将过硫酸铵溶解于20 ml水中，并在30分钟内逐滴加入，以避免反应过热。在0至5摄氏度下进行反应24小时。观察反应混合物，最初15分钟后变为乳白色，两小时后变为深棕色，24小时后最终变为深绿色。随后让其继续在室温下放置24小时。使用布氏漏斗过滤聚苯胺十二烷基苯磺酸钠溶液。将滤液与80 ml氯仿和120 ml水在分液漏斗中混合。室温孵育24小时后，从分液漏斗中收集深绿色的聚苯胺，未反应的十二烷基苯磺酸钠和过硫酸铵（APS）保留在水相上清液中。将PANI溶液用氯仿水稀释10倍，然后在微量离心管中加入200微升稀释后的PANI溶液与6.4微摩尔的探针DNA寡核苷酸，轻轻摇动混合15分钟。将PANI-DNA溶液置于交联仪中，以1200微焦耳/平方厘米的紫外线剂量照射2分钟。紫外线照射必须严格控制在指定剂量范围内，至关重要。长时间暴露于紫外线会破坏PANI的荧光变化，可能是由于PANI与DNA之间发生了共价交联。在17,000 × g条件下离心6分钟以沉淀复合物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。再次离心沉淀后，将沉淀物重悬于PBS中。向200微升PANI探针复合物中加入8微升100微摩尔的互补DNA寡核苷酸或目标核酸。在40摄氏度下轻轻摇动溶液混合物15分钟以进行杂交。将PANI复合物在17,000 × g离心6分钟沉淀后，用PBS洗涤并重悬于水中。将不同处理的PANI加入96孔微孔板中，在250纳米激发波长下测定270至850纳米范围内的发射荧光。PANI的发射峰应在约500纳米处出现。为进行杂交双链的荧光显微镜检测，将PANI滴涂于硼硅酸盐玻璃盖玻片上，并在40摄氏度下干燥48小时。在干燥的PANI薄膜上加入8微升100微摩尔的探针，随后用紫外光照射2分钟。照射后，用PBS洗涤PANI探针膜，并在40摄氏度下干燥48小时。通过加入靶核酸进行15分钟的杂交反应。这可以是生物样本或受控的目标寡核苷酸。随后用PBS洗涤。使用500纳米长通滤光片，在40倍放大下获取荧光图像。此处展示的是在紫外照射增强下，PANI与DNA探针之间的静电相互作用。靶核酸的杂交引发双链结构的形成，导致构象改变，从而使探针-靶标复合物从PANI表面解离。该图显示了在溶液和固体涂层介质中，有无探针存在时PANI荧光的变化情况。荧光增强是由于带负电荷的DNA产生电子流，从而增加了聚合物的电子密度。当互补的目标寡核苷酸发生杂交时，探针脱离，导致罗勒荧光的恢复。相反，与单个错配的目标寡核苷酸杂交则不会引起罗勒荧光的恢复。该技术的主要创新之处在于采用温和的紫外光实现精确的相互作用，从而有助于区分非特异性结合与弱相互作用。一旦掌握，该技术的操作过程（不包括感应时间和涂层干燥时间）最长可能需要两个小时。在进行该操作时，需注意DNA可溶于水，而酸性茶液实际上会改变聚苯胺（PANI）的电子特性。观看本视频后，读者应能充分理解如何合成水分散型聚苯胺，并利用其荧光特性检测核酸。读者将能够固定探针DNA并进行杂交以检测目标物。在操作单体时，需注意该合成过程具有危险性，必须在通风橱中进行，并佩戴护目镜、手套和实验服等防护装备。

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Research

科研

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Biochemistry

生物化学

核酸的聚苯胺传感器

“E-DNA”传感器是一种无需试剂的电化学生物传感器，即使直接在血液及其他复杂基质中检测，仍表现出良好的性能，目前已适用于多种核酸、蛋白质和小分子分析物的检测。本文介绍了一种此类传感器的制备与使用通用方法。...

无试剂检测核酸、蛋白质和小分子的电化学DNA生物传感器的制备

本视频展示了一种阻抗生物传感器检测方法，用于研究抗体与固定在换能器芯片上的靶抗原之间的相互作用。该生物传感器经工程化设计，含有一种双功能嵌合蛋白——即一个具有功能性催化位点的β-内酰胺酶，与一个可结合固定化靶抗原的纳米抗体相融合。当发生结合后，β-内酰胺酶对抗生素底物的催化水解反应产生电信号，从而确认抗原-抗体的相互作用。...

基于β-内酰胺酶的电导率生物传感器检测蛋白质-蛋白质相互作用

使用溶液法合成不对称的二茂铁化合物具有挑战性。本报告重点介绍通过固相合成法，采用简便且洁净的反应制备二茂铁-生物素生物偶联物的方法。实验表明，引入硫醇盐基团可赋予该化合物在金表面固定化的能力。...

通过固相树脂法合成不对称二茂铁衍生的生物共轭体系的方法学

我们描述了使用多晶硅纳米线场效应晶体管进行生物传感的关键步骤，包括器件的制备、DNA分子探针在纳米线表面的固定与验证，以及DNA检测的条件。...

用于化学与生物传感应用的硅纳米线场效应晶体管的制备

我们介绍一种利用两亲性聚合物和DNA对近红外荧光单壁碳纳米管（SWNTs）的晕相进行工程化改造的实验方案，旨在开发针对尚无已知识别元件的分子靶标的传感器。...

在单壁碳纳米管上利用仿生聚合物构建分子识别系统

在本研究中，我们报道了一种基于杂合β-内酰胺酶技术的电导型生物传感器新方法，用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。该方法依赖于β-内酰胺水解过程中质子的释放。...

基于β-内酰胺酶的导电生物传感器检测法用于检测生物分子相互作用

介绍了一种电化学DNA生物传感器的制备方案，该传感器由聚乳酸稳定的、金纳米颗粒修饰的丝网印刷碳电极组成，用于检测副溶血性弧菌（Vibrio...

开发一种电化学DNA生物传感器以检测食源性病原体

本方案描述了一种小型即用型卡盒的制备方法，该卡盒可用于单次检测中对多种核酸进行可视化检测，操作简便。该方法采用毛细管阵列，实现对转基因目标物的多重、高效检测。...

毛细管阵列中多种核酸的可视化检测

本文报道了一种纳菲昂（Nafion）包覆、聚苯胺功能化、电化学还原氧化石墨烯化学电阻型微 pH 传感器的制备方案。这种基于化学电阻的固态微 pH 传感器可在乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）发酵过程中实时检测 pH...

制造一种Nafion包覆的氧化石墨烯/聚苯胺化学电阻传感器以在微生物发酵过程中实时监测pH值

本文介绍了一种利用DNA折纸结构作为引导模板，在基底上制备离散且精确的无机纳米结构的实验方案。该方法通过在透明基底（蓝宝石）上制备等离激元金纳米弓形天线加以验证。...

用于传感应用的DNA折纸介导的无机结构基底纳米图案化

基于脱氧核酶的纳米机器可用于核酸的高选择性和高灵敏度检测。本文以EB病毒片段的检测为例，详细描述了利用免费软件设计含有10-23核心的脱氧核酶纳米机器的实验方案及其应用。...

基于DNAzyme 10-23的核酸识别纳米机器

学习使用聚苯胺传感器进行核酸的无标记检测方法，该技术无需酶处理即可区分单核苷酸差异。此方法成本低廉、操作简便，适用于RNA和DNA的直接检测，在诊断技术领域具有重要应用前景。

一种基于聚苯胺的核酸传感器

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