一种基于聚苯胺的核酸传感器

本实验的总体目标是合成可分散于水中的聚苯胺，用于无标记检测核酸。该技术是一种经济高效的核酸检测方法。采用该技术的实验室会发现其操作简便、结果稳定且灵敏度高。

该技术的主要优势在于无需标记，可直接用于检测RNA和DNA，无需进行酶学操作。该技术在新型诊断技术领域具有应用潜力，且由于无需标记，可用于处理患者样本，操作步骤极少。直观的演示将有助于阐明传感器的工作原理。

该平台涵盖了聚合物科学和生物学，这些内容看似非常奇特，但实际上却异常容易实现。在250 ml圆底烧瓶中，将苯胺完全溶解于60 ml氯仿中。在600 RPM下搅拌5分钟后，用冰将溶液冷却至0至5摄氏度。

这通常需要15到20分钟。接下来，在圆底烧瓶中将十二烷基苯磺酸钠加入苯胺溶液，同时以600 RPM的速度搅拌。将过硫酸铵溶解于20 ml水中，并在30分钟内逐滴加入，以避免反应过热。

在 0 至 5 摄氏度下进行反应 24 小时。观察反应混合物在 15 分钟后最初变为乳白色，两小时后变为深棕色，24 小时后最终变为深绿色。然后让其继续在室温下放置 24 小时。

使用布氏漏斗过滤聚苯胺十二烷基苯磺酸钠溶液。将滤液与80 ml氯仿和120 ml水在分液漏斗中混合。室温孵育溶液24小时，然后从分液漏斗中收集深绿色的聚苯胺，未反应的十二烷基苯磺酸钠和过硫酸铵（APS）则保留在水相上清液中。

将PANI溶液用氯仿水稀释10倍，然后在微量离心管中加入200微升稀释后的PANI溶液与6.4微摩尔的探针DNA寡核苷酸，轻轻摇动15分钟使其混合。使用交联仪以每平方厘米1200微焦耳的紫外线照射PANI-DNA溶液2分钟。紫外线照射必须严格控制在指定剂量，这一点至关重要。

长时间暴露于紫外光会降低PANI的荧光变化，这可能是由于PANI与DNA之间发生了共价交联泄漏。在17,000 × g条件下离心6分钟，沉淀复合物，并用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤。再次离心沉淀后，重悬于PBS中。

向200微升PANI探针复合物中加入8微升100微摩尔的互补DNA寡核苷酸或目标核酸。在40摄氏度下轻轻摇动溶液混合物15分钟，进行杂交反应。然后在17,000 × g离心6分钟使PANI复合物沉淀，用PBS洗涤后重悬于水中。

将不同处理的PANI加入96孔微孔板中，在250纳米激发波长下，测定270至850纳米范围内的发射荧光。PANI的发射峰应在约500纳米处出现。为进行杂交双链的荧光显微镜检测，将PANI滴涂在硼硅酸盐玻璃盖玻片上，并在40摄氏度下干燥48小时。

在干燥的PANI薄膜上加入8 µL 100 µmol的探针，然后用紫外光照射2分钟。照射后，用PBS洗涤PANI探针膜，并在40 °C下干燥48小时。通过加入目标核酸进行15分钟的杂交反应。

这可以是生物样本或受控的目标寡核苷酸。随后用PBS洗涤。使用500纳米长通滤光片，在40倍放大下获取荧光图像。

图中显示了在紫外照射增强下聚苯胺（PANI）与DNA探针之间的静电相互作用。靶核酸的杂交引发双链形成，导致结构构象改变，从而使探针-靶标复合物从PANI表面解离。该图展示了在溶液和固体涂层介质中，有无探针存在时PANI荧光的变化情况。

荧光的增强是由于带负电荷的 DNA 产生的电子流，从而增加了聚合物的电子密度。当互补的目标寡核苷酸发生杂交时，探针会脱离，导致罗勒荧光的恢复。相反，与单个错配的目标寡核苷酸杂交则不会引起罗勒荧光的恢复。

该技术的主要创新之处在于采用弱紫外光实现精确相互作用，从而有助于区分非特异性结合与光诱导相互作用。一旦掌握，该技术操作本身耗时可达两小时，不包括感应时间和涂层干燥时间。在进行该实验时，需注意DNA可溶于水，而酸性茶液实际上会改变聚苯胺（PANI）的电子特性。

观看本视频后，读者应能充分理解如何合成水分散型聚苯胺，并利用其荧光特性检测核酸。读者将能够固定探针DNA并进行杂交以检测目标物。在操作单体时，需注意该合成过程具有危险性，必须在通风橱中进行，并佩戴护目镜、手套和实验服等防护装备。