Name: 的简便和环保路线制造聚乳酸支架与分级孔径 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 46 s
Description: 了解熔融共混与选择性浸出技术制备聚乳酸/聚乙二醇三层支架的方法，实现可控孔隙率和孔径梯度。该技术环保无溶剂，适用于组织工程修复损伤组织的研究。

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本工作由 INSTM 提供经费支持。

1. 支架制备
<ol>
	<li>在实验室搅拌机中研磨 NaCl 20 分钟，并在 100 °C 的加热器上干燥。</li>
	<li>将干燥后的 NaCl（每次 45 g）放入筛分机中，在不发生共振的最高可用频率下筛分 30 分钟。收集六种盐的粒径分级：500 µm 至 1000 µm（M 500）；300 µm 至 500 µm（M 300）；100 µm 至 200 µm（M 100）；90 µm 至 100 µm（M 90）；45 µm 至 65 µm（M 45）；最后为粒径小于 45 µm 的 M 10，如图 1所示。</li>
	<li>将所有材料真空干燥过夜，以避免加工过程中发生水解断裂。针对每种材料选择适当的温度，以最大化干燥程度，同时对于聚合物而言不得超过其玻璃化转变温度。因此，PLA 选择 T = 90 °C，PEG 选择 T = 25 °C，NaCl 选择 T = 105 °C。</li>
	<li>将 PLA、PEG 和 NaCl 按质量百分比 20/5/75 配比加入密炼机中，在 T = 190 °C 和转速 n = 60 rpm 下混合，持续加工直至扭矩达到恒定值，通常约需 10 分钟。随后迅速收集所得物料。</li>
	<li>使用在 210 °C 下运行的实验室压机制备单层样品，将共混物置于直径为 10 mm、高度为 3 mm 的圆柱形模具中，在常压下保持 60 秒，随后在 180 bar 压力下保持 3 分钟。之后在维持 180 bar 压力的条件下冷却至室温。</li>
	<li>通过压缩成型组装三层结构
	<ol>
		<li>以与步骤（1.5）相同的方式制备每一单层，但使用不同的模具，即直径为 10 mm、高度为 1 mm 的模具。最终获得 6 个直径为 10 mm、高度为 1 mm 的圆盘，分别含有六种不同粒径的盐：M 500、M 300、M 100，</li>
		<li>为组装三层支架 A（TLS A），将 M 500、M 300 和 M 100 在圆柱形模具内依次堆叠，并在 210 °C 的实验室压机中进行压缩成型：先在常压下保持 60 秒，再在 180 bar 压力下保持 3 分钟，随后在维持 180 bar 压力的条件下冷却至室温。 
		注：通过在相同模具中依次堆叠 M 90、M 45 和 M 10 制备 TSL B，并采用与 TLS A 相同的程序进行压缩成型操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>从圆柱形模具中取出圆盘，放入沸腾的去离子水浴中，不搅拌。3 小时后，从水浴中取出所得多孔结构，并在化学通风橱中于室温下干燥 12 小时。</li>
</ol>
2. 形态学分析
<ol>
	<li>通过扫描电子显微镜评估支架的形貌。
	<ol>
		<li>在液氮中将样品破碎，然后使用导电碳胶带将样品固定在铝制样品台上。最后，在氩气氛围下溅射镀金90秒，再进行成像，以避免测试过程中发生静电放电。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 支架孔径大小
<ol>
	<li>使用能够识别支架孔径分布的图像处理软件，对通过扫描电镜（SEM）分析获得的图像进行详细分析。 
	注意：本研究中，孔径分布分析采用基于 MATLAB 的软件完成，该软件此前已有描述33</li>
</ol>
4. 孔隙率
<ol>
	<li>在浸出前称量样品，并根据以下公式计算理论孔隙率： 
	<img alt="理论孔隙率方程，材料密度与孔隙率分析公式。" src="/files/ftp_upload/54595/54595eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 1"> 
	注：mNaCl、mPEG 和 mPLA 分别为 NaCl、PEG 和 PLA 的理论质量，假设为均相混合物。NaCl、PEG 和 PLA 的密度（ρ）分别为 2,16 g/cm3、1,12 g/cm3 和 1,24 g/cm3。</li>
	<li>浸出并干燥后称量样品，以测定样品的表观密度（ρscaffold），然后利用公式（2）通过支架表观密度与非多孔 PLA 密度之比的倒数来计算实际孔隙率。 
	注：该比值表示支架空隙体积与支架总体积（空隙 + 实体）之比。 
	<img alt="显示支架密度比的孔隙率计算公式；材料科学教育用方程。" src="/files/ftp_upload/54595/54595eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
5. 机械性能
<ol>
	<li>使用配备1 kN力传感器的拉伸试验机，以压缩模式测试样品。设定恒定的应变速率为1 mm min-1。</li>
	<li>为研究样品在生理环境中的力学性能，将测力计配备一个盛有磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.4）的水浴装置，并在37 °C下进行测试，测试设置与第5.1条所述相同。
	<ol>
		<li>每次在湿态环境下测量前，将样品置于真空烧瓶中用PBS浸泡5分钟，以确保PBS充分填充所有孔隙。随后，将支架在37 °C的PBS中静置15分钟，使其达到设定温度。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>采用文献32,34中描述的方法，通过连接至力学试验机的定制界面强度测试装置，测定TL A层与TL B层之间的界面粘附强度（IAS）。
	<ol>
		<li>将支架固定在夹具上，确保其与试验机的力传感器和底座压板正确对齐。使用高黏性胶黏剂将支架样品固定在铝制样品台（aluminum test stubs）上，并将其放入测试设备中进行测试。</li>
		<li>对于湿态条件下的测试，测试前需将样品在PBS中水化1小时。使用1 kN力传感器，在1 mm min-1的应变速率下施加拉伸载荷。 
		注：需注意，破坏可能发生在某一层的极限抗拉强度处，也可能由于界面处的分层所致。将应力-应变曲线的最大强度值作为界面粘附强度（IAS）进行评估。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Scaffaro, R., Morreale, M., Lo Re, G., Mantia, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((La+Degradation+of+Mater-Bi%C2%AE%2Fwood+flour+biocomposites+in+active+sewage+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">La Degradation of Mater-Bi®/wood flour biocomposites in active sewage sludge.</a> Polymer Degradation and Stability. 94 (8), 1220-1229 (2009).</li>
<li>Scaffaro, R., Botta, L., Passaglia, E., Oberhauser, W., Frediani, M., Di Landro, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+processing+methods+to+prepare+poly%28lactid+acid%29-hydrotalcite+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Engineering+%26+Science%22%5BJournal%5D)">Comparison of different processing methods to prepare poly(lactid acid)-hydrotalcite composites.</a> Polymer Engineering & Science. 54 (8), 1804-1810 (2014).</li>
<li>Thakur, V. K., Thakur, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+graft+copolymerization+and+applications+of+chitosan%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chemistry+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Recent advances in graft copolymerization and applications of chitosan: A review.</a> ACS Sustainable Chemistry and Engineering. 2 (12), 2637-2652 (2014).</li>
<li>Thakur, V. K., Thakur, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+green+hydrogels+from+lignin%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Macromolecules%22%5BJournal%5D)">Recent advances in green hydrogels from lignin: A review.</a> International Journal of Biological Macromolecules. 72, 834-847 (2015).</li>
<li>Thakur, V. K., Kessler, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+polymer+nanocomposite+materials%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Self-healing polymer nanocomposite materials: A review.</a> Polymer. 69, 369-383 (2015).</li>
<li>Thakur, V. K., Thakur, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+trends+in+hydrogels+based+on+psyllium+polysaccharide%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cleaner+Production%22%5BJournal%5D)">Recent trends in hydrogels based on psyllium polysaccharide: a review.</a> Journal of Cleaner Production. 82, 1-15 (2014).</li>
<li>Voicu, S. I., Condruz, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sericin+Covalent+Immobilization+onto+Cellulose+Acetate+Membrane+for+Biomedical+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Sustainable+Chemistry+%26+Engineering%22%5BJournal%5D)">Sericin Covalent Immobilization onto Cellulose Acetate Membrane for Biomedical Applications.</a> ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 4 (3), 1765-1774 (2016).</li>
<li>Scaffaro, R., Botta, L., Sanfilippo, M., Gallo, G., Palazzolo, G., Puglia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+in+the+melt+physical+and+biological+properties+of+poly%28caprolactone%29+and+chlorhexidine+to+obtain+antimicrobial+surgical+monofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Combining in the melt physical and biological properties of poly(caprolactone) and chlorhexidine to obtain antimicrobial surgical monofilaments.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 97 (1), 99-109 (2013).</li>
<li>Scaffaro, R., Maio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+self-assembly+of+a+PEGylated-graphene+aerogel%5BTitle%5D)+AND+%22Composites+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">Synthesis and self-assembly of a PEGylated-graphene aerogel.</a> Composites Science and Technology. 128, 193-200 (2016).</li>
<li>Scaffaro, R., Botta, L., Gallo, G., Puglia, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Drawing+on+the+Antimicrobial+and+Physical+Properties+of+Chlorhexidine-Compounded+Poly%28caprolactone%29+Monofilaments%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Influence of Drawing on the Antimicrobial and Physical Properties of Chlorhexidine-Compounded Poly(caprolactone) Monofilaments.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 12 (300), 1268-1277 (2015).</li>
<li>Scaffaro, R., Lopresti, F., et al. Effect of PCL/PEG-Based Membranes on Actinorhodin Production in Streptomyces coelicolor Cultivations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aScaffaro%2C+R+%22Macromolecular+bioscience%22">Macromolecular bioscience</a>. 16 (5), 686-693 (2016).</li>
<li>Scaffaro, R., Lopresti, F., Botta, L., Rigogliuso, S., Ghersi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melt+Processed+PCL%2FPEG+Scaffold+With+Discrete+Pore+Size+Gradient+for+Selective+Cellular+Infiltration%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Materials+and+Engineering%22%5BJournal%5D)">Melt Processed PCL/PEG Scaffold With Discrete Pore Size Gradient for Selective Cellular Infiltration.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 301 (2), 182-190 (2016).</li>
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<li>Gillette, B. M., Rossen, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+extracellular+matrix+structure+in+3D+multiphase+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Engineering extracellular matrix structure in 3D multiphase tissues.</a> Biomaterials. 32 (32), 8067-8076 (2011).</li>
<li>Seidi, A., Ramalingam, M., Elloumi-Hannachi, I., Ostrovidov, S., Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient+biomaterials+for+soft-to-hard+interface+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Gradient biomaterials for soft-to-hard interface tissue engineering.</a> Acta Biomaterialia. 7 (4), 1441-1451 (2011).</li>
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<li>Sundararaghavan, H. G., Burdick, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+with+depth+in+electrospun+fibrous+scaffolds+for+directed+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Gradients with depth in electrospun fibrous scaffolds for directed cell behavior.</a> Biomacromolecules. 12 (6), 2344-2350 (2011).</li>
<li>Zou, B., Liu, Y., Luo, X., Chen, F., Guo, X., Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+fibrous+scaffolds+with+continuous+gradations+in+mineral+contents+and+biological+cues+for+manipulating+cellular+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Electrospun fibrous scaffolds with continuous gradations in mineral contents and biological cues for manipulating cellular behaviors.</a> Acta biomaterialia. 8 (4), 1576-1585 (2012).</li>
<li>Nedjari, S., Schlatter, G., Hébraud, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thick+electrospun+honeycomb+scaffolds+with+controlled+pore+size%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Letters%22%5BJournal%5D)">Thick electrospun honeycomb scaffolds with controlled pore size.</a> Materials Letters. 142, 180-183 (2015).</li>
<li>Yusong, P., Qianqian, S., Chengling, P., Jing, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+mechanical+properties+of+multilayer+gradient+hydroxyapatite+reinforced+poly%28vinyl+alcohol%29+gel+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+-+Part+B+Applied+Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Prediction of mechanical properties of multilayer gradient hydroxyapatite reinforced poly(vinyl alcohol) gel biomaterial.</a> Journal of Biomedical Materials Research - Part B Applied Biomaterials. 101 (5), 729-735 (2013).</li>
<li>Kim, Y. B., Kim, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functionally+graded+PCL%2F%CE%B2-TCP+biocomposites+in+a+multilayered+structure+for+bone+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+A%3A+Materials+Science+and+Processing%22%5BJournal%5D)">Functionally graded PCL/β-TCP biocomposites in a multilayered structure for bone tissue regeneration.</a> Applied Physics A: Materials Science and Processing. 108 (4), 949-959 (2012).</li>
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<li>Molladavoodi, S., Gorbet, M., Medley, J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+microstructure%2C+mechanical+properties+and+cellular+viability+of+poly%28L-lactic+acid%29+tissue+engineering+scaffolds+prepared+by+different+thermally+induced+phase+separation+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+mechanical+behavior+of+biomedical+materials%22%5BJournal%5D)">Investigation of microstructure, mechanical properties and cellular viability of poly(L-lactic acid) tissue engineering scaffolds prepared by different thermally induced phase separation protocols.</a> Journal of the mechanical behavior of biomedical materials. 17, 186-197 (2013).</li>
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<li>Yoo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneous+minimal+surface+porous+scaffold+design+using+the+distance+field+and+radial+basis+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Medical+engineering+%26+physics%22%5BJournal%5D)">Heterogeneous minimal surface porous scaffold design using the distance field and radial basis functions.</a> Medical engineering & physics. 34 (5), 625-639 (2012).</li>
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<li>Scaffaro, R., Lopresti, F., Botta, L., Maio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+behavior+of+Polylactic+acid%2FPolycaprolactone+porous+layered+functional+composites%5BTitle%5D)+AND+%22Composites+Part+B%3A+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical behavior of Polylactic acid/Polycaprolactone porous layered functional composites.</a> Composites Part B: Engineering. 98, 70-77 (2016).</li>
<li>Halili, A. N., Hasirci, N., Hasirci, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multilayer+tissue+engineered+meniscus+substitute%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Materials+Science%3A+Materials+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">A multilayer tissue engineered meniscus substitute.</a> Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 25 (4), 1195-1209 (2014).</li>
<li>Bai, H., Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+gradient+scaffold+from+ice-templating+for+self-seeding+of+cells+with+capillary+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Biomimetic gradient scaffold from ice-templating for self-seeding of cells with capillary effect.</a> Acta Biomaterialia. 20, 113-119 (2015).</li>
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<li>Lo Re, G., Lopresti, F., Petrucci, G., Scaffaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+facile+method+to+determine+pore+size+distribution+in+porous+scaffold+by+using+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">A facile method to determine pore size distribution in porous scaffold by using image processing.</a> Micron. 76, 37-45 (2015).</li>
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<li>Maio, A., Fucarino, R., Khatibi, R., Rosselli, S., Bruno, M., Scaffaro, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+approach+to+prevent+graphene+oxide+re-aggregation+during+the+melt+compounding+with+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Composites+Science+and+Technology%22%5BJournal%5D)">A novel approach to prevent graphene oxide re-aggregation during the melt compounding with polymers.</a> Composites Science and Technology. 119, 131-137 (2015).</li>
<li>Maio, A., Agnello, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+eco-friendly+route+to+synthesize+graphene-doped+silica+nanohybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alloys+and+Compounds%22%5BJournal%5D)">A rapid and eco-friendly route to synthesize graphene-doped silica nanohybrids.</a> Journal of Alloys and Compounds. 664, 428-438 (2015).</li>
<li>Maio, A., Giallombardo, D., Scaffaro, R., Piccionello, A. P., Pibiri, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+a+fluorinated+graphene+oxide-silica+nanohybrid%3A+improving+oxygen+affinity%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">Synthesis of a fluorinated graphene oxide-silica nanohybrid: improving oxygen affinity.</a> RSC Advances. 6 (52), 46037-46047 (2016).</li>
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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

第一个关键步骤是优化筛分效率。精确控制氯化钠颗粒的尺寸对于制备具有理想孔径分布的支架至关重要。另一个关键步骤是在样品从模具中取出时避免薄聚乳酸单层发生断裂。图像处理分析结果可能无法代表整个器件的整体情况。
在拉伸试验过程中，样品可能会从设备上撕裂脱落。
在筛分步骤之前，需确保盐已充分干燥，以便更好地控制氯化钠颗粒的尺寸。这一问题尤其对于最小的盐颗粒尺寸尤为重要，因其具有极强的吸湿性。在压缩成型步骤之前，应在模具表面涂覆一层薄薄的聚四氟乙烯（Teflon）喷雾涂层，以利于后续将样品从模具中取出。图像处理分析必须基于从支架不同区域拍摄的多张图像进行，以确保所选图像具有整体代表性的特征。最后，在进行拉伸测试之前（特别是在潮湿环境中进行的测试），应仔细检查粘合剂与样品之间的粘附情况。
该技术的主要局限在于无法获得连续的孔径梯度。事实上，此处所述方法仅能实现离散的孔径梯度，因其基于不同层的组装。在大多数情况下，结构明确的多层支架可能优于连续梯度支架，但并非总是如此。通过增加层数可在...

近年来，由于人们对塑料废弃物以及减少使用不可再生资源的日益关注，可生物降解聚合物在学术界和工业界的重要性不断上升1-7。特别是，生物相容性和可生物降解的合成聚合物已广泛应用于多个生物医学领域，如药物控释8,9、可吸收缝合线8,10、生物过程强化11和组织工程12。
组织工程致力于开发能够恢复和维持病变或受损组织正常功能的装置。大多数天然组织由不同类型的细胞和细胞外基质（ECMs）以特定的空间层级结构组成。例如，关节软骨（AC）包含多个区域，其胶原纤维和胶原结合蛋白的类型与取向各不相同。此外，软骨与骨具有显著不同的层级结构。在此背景下，制备每层具有工程化特性的多层支架，可综合考虑这些复杂系统的各个局部微环境，从而实现对异质性组织的替代13,14。
根据支架的细胞/生物学和（或）物理化学特性，组织工程采用的主要策略可分为单相、双相和三相。双相和三相方法（BTA）采用两种或三种不同的孔隙结构、材料或填料来制备多层功能性装置。此外，只要能够在其物理特性上形成梯度，也可使用单一材料来实现双相或三相装置12。
细胞迁移在形态发生、炎症反应、伤口愈合以及肿瘤转移过程中发挥关键作用。当材料表面至核心存在化学-物理特性的梯度时，可促进细胞的迁移行为。因此，满足上述要求的生物材料有助于研究细胞迁移。除了可触发细胞迁移的化学梯度（趋化性）外，细胞培养基底的力学特性也可诱导细胞运动（力学趋化性）15。
通过改变特定层的面积或载药量，多层结构还可实现聚合物基质中特定药物的可调控释放。
近十年来，为了开发具有孔隙率或孔径等形态学特性梯度（离散或连续）的支架，已提出多种方法16-31。最近的研究主要集中在采用以下方法制备BTA：颗粒沥滤12,28,32、气体发泡法16、静电纺丝17-19、逐层浇铸法20、快速成型技术21,22、热致相分离法（TIPS）22、离心冷冻干燥24,25、三重周期性极小曲面（TPMS）26以及冷冻铸造27-30。
在本研究中，我们提出了一种快速且简便的方法，通过熔融共混、压缩成型和盐沥滤相结合的技术，制备基于聚乳酸（PLA）的三层多孔支架（TLS）。与目前常用的大多数支架制备技术不同，本文所采用的策略可被视为完全环保，因其无需使用任何对环境以及活细胞和组织具有潜在危害的有毒溶剂32。通过对所制备器件的形貌特征和力学性能进行分析，本研究建立了基本的“加工-结构-性能”关系，为未来设计具有特定目标性能的多功能梯度支架提供了指导。

<table><tbody><tr><td>聚乳酸</td><td>NatureWorks</td><td>PLA 2002D</td><td></td></tr><tr><td>聚乙二醇</td><td>Sigma</td><td>83797-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Sigma</td><td>793566-5KG-D</td><td></td></tr><tr><td>磷酸盐缓冲液</td><td>Sigma</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>实验室混合器</td><td>Brabender</td><td>PLE 330 - Plasticorder</td><td></td></tr><tr><td>实验室压片机</td><td>Carver</td><td></td><td></td></tr><tr><td>扫描电子显微镜</td><td>Phenom-world</td><td>ProX</td><td></td></tr><tr><td>万能材料试验机</td><td>Instron</td><td>3365 (UK)</td><td></td></tr><tr><td>BioPuls 浴槽</td><td>Instron, Norwood</td><td></td><td></td></tr><tr><td>筛分机</td><td>Endecotts</td><td>E.V.F.1.</td><td></td></tr><tr><td>真空烘箱</td><td>ISCO</td><td>NSV9035</td><td></td></tr><tr><td>精密天平</td><td>Sartorius</td><td>AX224</td><td></td></tr></tbody></table>

一种简便且环保的制备具有梯度孔径聚乳酸支架的方法

A Facile and Eco-friendly Route to Fabricate Poly(Lactic Acid) Scaffolds with Graded Pore Size

近年来，功能梯度支架（FGS）在组织工程器械制造中发挥了关键作用。这一生物材料研究新兴领域的重要性在于，需要开发出能够模拟各种组织复杂功能的植入物，包括从一种结构或成分连续过渡到另一种结构或成分的能力。在这一背景下，一个备受关注的研究课题是骨-软骨界面组织的适宜支架设计。本研究通过熔融共混聚乳酸（PLA）、氯化钠（NaCl）和聚乙二醇（PEG）制备了具有梯度孔径的三层支架。通过调控NaCl的粒径分布和PEG的溶解性，实现了对孔径分布的控制。对支架的形貌和力学性能进行了表征，发现制备方法、孔结构与压缩力学行为之间存在相关性。采用自行设计的界面强度测试方法，定量评估了层间界面的粘附强度。此外，为了模拟人体生理环境，还在37 °C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中进行了力学测试。本文所提出的方法能够高度调控孔隙率、孔径分布及力学性能，从而提供了一种简单且环境友好的途径，用于制备具有定制化特性的三层支架。

通过样品形貌观察和图像分析计算孔径分布，分别对NaCl颗粒尺寸对支架孔隙结构的定性和定量影响进行了评估。 图 2a-f 显示了通过沥滤含有不同NaCl颗粒尺寸的材料所得单层支架的扫描电镜显微照片。
更详细地说，M 500（图 2a）显示出平均直径为 500 µm 的孔隙，这可能是由于在熔融混合过程中直径大于 500 µm 的盐颗粒发生破碎所致。从同一图中可明显看出，孔隙结构特征为数量较少的不规则孔隙，连通性较差，周围由约 10 µm 厚的孔壁包围。图 2b 展示了 M 300 的形貌。在此情况下，孔隙的平均直径处于熔融混合过程中所填充盐颗粒的相同尺寸范围（300–500 µm），从而证实熔融混合过程中未发生颗粒破碎。与 M 500 层相比，M 300 的孔壁更薄（约 5 µm）。M 100（图 2c</...

本研究采用熔融共混与选择性浸出相结合的方法制备了聚乳酸/聚乙二醇（PLA/PEG）支架。该方法可精确调控孔隙率和孔径，从而构建出具有三层结构的支架。同时，在生理环境中评估了其力学性能。

近年来，功能梯度支架（FGS）在组织工程器械制造中发挥了关键作用。……的重要性在于……

组织工程致力于开发能够恢复和维持病变或受损组织正常功能的装置。大多数天然组织由不同类型的细胞和细胞外基质以特定的空间层级结构组成。例如，关节软骨包含多个区域，其胶原纤维和胶原结合蛋白的类型及排列方向各不相同。组织工程中采用的主要策略可分为单相、双相和三相方法。双相和三相方法利用两种或三种不同的孔隙结构、材料或填料来制备多层功能性装置。如果能够构建一种或多种物理特性的梯度，也可使用单一材料来实现双相或三相装置。本研究提出了一种快速、简便的制备基于聚乳酸的三层多孔支架的方法。与许多其他支架制备技术不同，该方法具有环境友好性，无需使用任何对环境或组织中活细胞具有潜在危害的有毒溶剂。具体而言，该工艺结合了熔融共混、压缩成型和盐沥滤技术。对结构的形态学分析和力学性能进行了研究，特别关注所制备器件的工艺-结构-性能之间的关系。将氯化钠在实验室研磨机中研磨20分钟。随后，将氯化钠置于加热器上于100°C干燥，然后在筛分机中以不产生共振的最高可用频率筛分30分钟。所选的六个组分粒径范围分别为：1,000 微米至 500 微米、500 微米至 300 微米、200 微米至 100 微米、100 微米至 90 微米，以及 65 至 45 微米，最后一个组分的盐颗粒尺寸小于 45 微米。所有材料均在真空条件下干燥过夜，以避免加工过程中发生水解断裂，其中聚乳酸在 90 °C 下干燥，聚乙二醇在 25 °C 下干燥，氯化钠在 105 °C 下干燥。在熔融共混前，将聚乳酸、聚乙二醇和氯化钠按质量分数 20%、5% 和 75% 的比例在烧杯中进行机械混合。随后将混合物料加入间歇式混料机中。温度设定为190°C，转子转速设定为60 RPM。材料持续加工直至转矩达到恒定值，通常约需10分钟。随后将混合物挤出，并在液氮中迅速冷却。为了制备每一层，将共混物在实验室压机中于210摄氏度进行压缩成型。样品在直径为10毫米、高度为3毫米的适当圆柱形模具中成型。材料在常压和210摄氏度条件下预热60秒，然后将压力升至180巴，并保持3分钟。随后，在保持180巴压力的条件下，将共混物在室温下冷却。使用不同盐粒径制备的聚合物氯化钠共混物被放入直径为10毫米、高度为3毫米的适当圆柱形模具中。随后将材料再次进行压缩成型，持续5分钟。具体而言，制备了两种不同的三层支架。在一种情况下，通过组装填充有氯化钠颗粒的混合物获得了三层结构，其中颗粒粒径范围分别为 1,000 微米至 500 微米、500 微米至 300 微米，以及 200 微米至 100 微米。另一种三层支架则是通过组装填充有氯化钠颗粒的混合物获得，其中颗粒粒径范围分别为 100 微米至 90 微米、65 微米至 45 微米，最外层则使用粒径小于 45 微米的盐颗粒。随后将混合物从圆柱形模具中取出，称重，并置于沸腾的去离子水中浸泡三小时，期间不搅拌。将所得结构在通风橱内室温条件下静置干燥12小时。此外，为评估连通性及吸水率，分别在干燥前后对样品进行称重。各样品的理论孔隙率根据以下表达式进行计算。设计该混合物的组分旨在获得理论孔隙率为70.8%的支架。通过问题二计算得到的孔隙率与所有类型支架的理论值非常接近，因此可以合理推断所有致孔剂均已从支架中完全去除。采用扫描电子显微镜对支架的形貌进行表征。样品在液氮中脆断。 然后，使用导电碳胶带将样品固定在铝制样品台上。在生理环境中进行压缩试验之前，利用真空烧瓶将样品浸入磷酸盐缓冲液中，使溶液充满支架的所有孔隙空间。该方法可确保溶液完全填充支架的全部孔隙体积。最后，进行了拉伸测试以评估各层间界面的粘附强度。扫描电子显微镜分析证实，氯化钠颗粒尺寸对支架的多孔结构具有显著影响。图1a、f展示了通过浸出不同粒径盐颗粒制备的支架的扫描电子显微图像。孔径测量结果表明，支架的平均孔径主要受填充到聚合物基质中的氯化钠颗粒尺寸的控制。特别是，由含有粒径在1,000至500微米范围内过筛盐的共混物制得的支架，其孔隙的平均直径为500微米，这可能是由于在熔融共混过程中直径大于500微米的盐颗粒发生破碎所致。从同一图中可明显看出，孔隙结构表现为数量较少的不规则孔隙，连通性较差，并被厚度约为10微米的孔壁所包围。图1b展示了使用粒径范围为500至300微米的盐所获得支架的形态。在此情况下，孔隙的平均直径与熔融混炼过程中填充的盐颗粒粒径范围基本一致，表明在熔融混炼过程中未发生颗粒破碎。孔隙周围的壁较前一种情况更薄，约为五微米。使用粒径为200至100微米的盐所获得的支架呈现出双峰多孔结构，其特征是由100至200微米的大孔组成的非均相网络，大孔周围分布着较小的孔。这种孔结构增强了孔之间的连通性以及单位体积内的孔数量，但导致孔壁厚度显著变薄。使用粒径为100、90微米的盐所获得的支架则显示出大致呈立方形的孔，均匀分布在聚合物基质中。由于聚乙二醇溶剂化作用，在支架壁内部形成了微孔，使其表面实际上显得非常粗糙。使用粒径为45至65微米的盐所制备的支架，其扫描电子显微图像显示单位体积内具有大量孔隙，孔径范围为45至765微米。最后，使用小于45微米盐所制备的支架，其单位体积内的孔隙数量最多。孔结构显示出约20微米的平均孔径，具有高度的相互连通性以及非常薄的孔壁，壁厚低于1微米。组装后的支架呈现出三个截然不同的层次结构，每一层具有不同的平均孔径。正如预期，各层在组装及沥滤步骤后仍保持原有的孔结构。可以明显看出，整个装置不存在任何内部裂隙，各层之间也无基质不连续现象。在压缩试验中，随着样品平均孔径的减小，其弹性模量呈现下降趋势。在湿润条件下测试导致弹性模量下降约10%。然而，装置的整体力学性能并未发生改变。三层结构器件的弹性模量与其各自最弱层的弹性模量相当。测试结果表明，断裂发生在三层结构器件最弱层的中部区域，因此未观察到分层现象。所收集的数据证实，界面粘附强度高于最弱层抗拉强度的10倍，这与扫描电子显微镜分析的观察结果一致。综上所述，本研究通过熔融共混、压缩成型和选择性溶出相结合的方法，开发了具有明确孔径梯度的聚乳酸基可降解支架。扫描电子显微镜分析证实，该装置具有相互连通的孔隙结构，孔隙率约为70%，并通过控制熔融共混步骤中氯化钠的粒度实现了对孔径大小的可预测性。形态学分析还显示，三层支架具有结构固定良好的各层，且各层具有不同的孔径尺寸。界面粘附强度测试显示I层粘附良好，无脱层现象。

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Research

科研

JoVE Journal

Bioengineering

生物工程

的简便和环保路线制造聚乳酸支架与分级孔径

在脉动流生物反应器中培养的、带有血管平滑肌细胞的弹性 PGS...

弹性体 PGS 支架在动脉组织工程中的应用

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组织工程用静电纺丝纤维的后期加工处理

本文介绍了一种用于构建生物相容性多层基质的独特策略，该基质具有不同层之间的连续界面，适用于组织工程。此类支架可通过多种生物、化学或力学信号，为调控细胞行为提供理想的可定制环境...

密度梯度多层聚合（DGMP）：一种用于组织工程中构建多区室、可定制支架的新型技术

在本视频中，我们将演示用于多孔金属植入物的改性技术，以提升其功能并控制细胞迁移。这些技术包括构建孔隙梯度以调控三维环境中的细胞运动，以及制备模拟基底膜的结构以调控二维环境中的细胞运动。此外，还介绍了一种基于高效液相色谱（HPLC）的方法，通过分析血液蛋白来监测植入物在体内的整合情况。...

具有孔隙梯度、聚电解质及其间接监测的金属植入物多尺度改性 在体

本文介绍一种制备具有纤维梯度排列的电纺纳米纤维支架的方案，并探讨其在调控细胞形态与取向中的应用。纳米纤维支架在物理和化学性质上的梯度特征在生物医学领域具有广泛的应用前景。...

具有纤维排列梯度的电纺纳米纤维支架

能够适配颅颌面（CMF）骨缺损并具有骨传导性和生物活性的支架材料备受关注。本实验方案描述了一种基于聚己内酯二丙烯酸酯（PCL-DA）的形状记忆支架的制备方法，该方法采用融合盐模板的溶剂浇铸-颗粒沥滤（SCPL）技术，并施加具有生物活性的聚多巴胺涂层。...

一种生物活性PCL基“自适配”形状记忆聚合物支架的制备

组织工程支架需要重现细胞微环境复杂的生化和生物物理特性。本文展示了利用界面聚电解质复合纤维作为平台，构建具有持续生化释放能力的复合型多组分聚合物支架的方法。...

用于生物分子时序控制释放的界面聚电解质纤维复合支架

通过一种包含两个步骤的方法制备了具有生物活性且机械性能可靠的金属支架：首先采用动态冷冻铸造法制备多孔钛，然后对钛支架进行涂层和致密化处理。该致密化过程简单、高效，并可适用于制备功能梯度支架。...

用于生物医学应用的可调机械性能与生物活性金属支架的制备

本方案的三个关键步骤是：i）开发出具有合适组分和一致性的纤维素水凝胶油墨，ii）将支架3D打印成具有优良形状保真度和尺寸精度的不同孔隙结构，iii）在模拟体内条件下验证其用于软骨再生的力学性能。...

3D打印多孔纤维素纳米复合水凝胶支架

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制备高开孔多孔微球（HOPMs） 通过 微流控技术

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一种简便且环保的制备具有梯度孔径聚乳酸支架的方法

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