Phenotypic Characterization of Macrophages from Rat Kidney by Flow Cytometry
2016年10月18日
This manuscript describes a detailed protocol for phenotypic and quantitative analysis of resident macrophages from rat kidneys by flow cytometry. The resulting stained cells can be also used for other applications, including cell sorting, gene expression analysis or functional studies, thus increasing the information obtained in the experimental model.
该程序的总体目标是通过流式细胞术定量和表征大鼠肾脏的常驻巨噬细胞。这种方法可以回答流动性中的关键问题，例如每种 macraphage 类型对肾损伤的贡献是什么。该技术的主要优点是它允许对不同的蛋白质标志物进行肾导管插入。因此，限制演示该程序的细胞完整性将是康普顿斯大学的 A.P.A.S.D. 学生 Elena Olivares 和 A.P.A.S.D. 学生 Melania Guerrero 对于肾脏灌注和提取，首先捏一小层皮肤以确认大鼠已达到适当的镇静水平。并用 Vet 软膏覆盖眼睛。将动物仰卧放在手术台上。并用 70% 乙醇浸泡腹部。接下来，从耻骨到胸腔，通过腹部皮肤和腹膜做一个中央切口，露出胸膜和腹腔。使用灌注系统将 0.9% 盐水溶液注入腹主动脉以冲洗肾脏。切开腹部的主动脉以帮助释放血液。当所有血液从肾脏中去除后，切断肾门。然后按压每个肾脏的边缘，小心地解封器官。并将提取的肾脏转移到新鲜的 H.B.S.S.To 生成单个肾细胞悬液中，用剪刀将一个肾脏的一半切成小碎片。将组织块转移到 1.5 mL 试管中，向试管中加入 1 mL 新鲜制备的胶原酶，在 37 下孵育 30 分钟
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概述
本文描述了一种通过流式细胞术对大鼠肾脏中常驻巨噬细胞进行表型和定量分析的详细实验方案。所获得的染色细胞可用于多种应用，从而增强实验模型中获取的信息。
关键研究组成部分
科学领域
- 神经科学
- 免疫学
- 细胞生物学
背景
- 巨噬细胞在肾脏健康与疾病中发挥着关键作用。
- 流式细胞术可实现对细胞群体的详细分析。
- 了解巨噬细胞的行为有助于指导治疗策略的制定。
- 大鼠模型常用于研究肾脏功能。
研究目的
- 建立一种分离和分析肾脏巨噬细胞的实验方案。
- 促进对巨噬细胞在肾脏环境中功能的进一步研究。
- 为相关领域的研究人员提供资源支持。
使用的方法
- 用于细胞分析的流式细胞术。
- 巨噬细胞鉴定的染色技术。
- 细胞分选和基因表达分析的实验方案。
- 评估巨噬细胞活性的功能研究。
主要结果
- 成功分离大鼠肾脏中的常驻巨噬细胞。
- 对巨噬细胞表型进行详细表征。
- 在基因表达和功能研究中的潜在应用。
- 加深对巨噬细胞在肾脏健康中作用的理解。
结论
- 该方案为巨噬细胞分析提供了一种可靠的方法。
- 研究结果可为未来肾脏疾病的研究提供参考。
- 该研究可拓展至流式细胞术以外的其他应用领域。
常见问题
行业重要性概述
在肾脏疾病模型中对巨噬细胞亚群进行准确的表型表征，对于降低炎症驱动型肾病靶点验证的风险至关重要。本流式细胞术方案可实现对大鼠肾脏中促炎型（M1）和免疫调节型（M2）巨噬细胞表型的定量区分，有助于深入理解纤维化及免疫调控的机制。通过提供一种可靠的方法来评估巨噬细胞在肾损伤中的作用，该方法增强了临床前靶点筛选和信号通路研究的预测可靠性。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过量化肾脏损伤模型中M1/M2巨噬细胞比例，实现对治疗假设的验证。
- 操作价值：采用双标CD45/CD68设门结合CD86/CD163表面染色，高特异性地定义巨噬细胞表型。
- 预测价值：通过将巨噬细胞极化状态与纤维化及免疫调节通路关联，支持靶点风险评估。
筛选与检测方法开发
- 检测准备就绪：可生成标准化的定量流式细胞术结果，用于分析巨噬细胞频率及标志物表达水平。
- 可重复性：细胞死亡率低且完整性良好，能够在不同实验间获得一致的表型检测结果。
- 下游应用价值：分离得到的巨噬细胞仍具活性，可用于细胞分选、mRNA 和蛋白质分析，支持多组学后续研究。
转化与临床前研究
- 疾病相关性：可直接应用于以巨噬细胞表型驱动发病机制的炎症性肾病模型。
- 转化连续性：分选后巨噬细胞的表型数据可为临床前研究中的生物标志物发现和功能验证提供依据。
- 风险调整决策：能够客观评估免疫调节化合物对巨噬细胞极化的影响。
流程与工作流整合
该方法适用于从靶点验证到临床前评估的整个发现流程，可提供免疫学读数，为肾脏疾病模型中的先导化合物优化和作用机制研究提供依据。
- 发现生物学：通过表型定量，促进在肾损伤中针对巨噬细胞驱动通路的假设验证。
- 筛选：提供可重复的定量巨噬细胞数据，适用于检测验证和化合物筛选项目。
- 分析：提供多参数流式细胞术读数（M1型为CD45+/CD68+/CD86+；M2型为CD45+/CD68+/CD163+），支持组间比较分析。
- 转化研究：将巨噬细胞表型分析与疾病相关体系中的下游功能检测及基因表达谱分析相连接。
- 企业级复用：建立标准化的免疫表型分析工作流程，可应用于多种肾病模型及治疗领域。
运营与企业影响
- 科学价值：通过实现巨噬细胞表型的精确区分，减少巨噬细胞介导的肾脏损伤机制中的模糊性。
- 操作价值：提供标准化、低变异性的巨噬细胞分离与染色流程，适用于核心流式细胞术平台。
- 战略价值：通过将靶点调控与巨噬细胞极化可测量的变化相关联，提升“推进/终止”决策的准确性。
- 项目组合影响：基于临床前模型中巨噬细胞表型调控的效果，支持对免疫调节候选药物进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备流式细胞术补偿、设门策略以及巨噬细胞标志物验证方面的专业知识。
- 依赖于胶原酶消化设备和无菌细胞处理基础设施的可及性。
- 为实现可重复的M1/M2定量，需在不同实验场所间标准化抗体组合和荧光对照。
- 应用于其他组织时，可能需要优化解离酶和标志物组合。
- 与小鼠更丰富的巨噬细胞标志物谱相比，大鼠特异性巨噬细胞标志物（CD86、CD163）的可获得性有限。
