Name: 从黑质多巴胺神经元的Somatodendritic域亚细胞的膜片钳记录 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: 学习从黑质多巴胺神经元树突进行亚细胞膜片钳记录的方法，用于研究电压门控离子通道在亚细胞水平的功能特性。该技术可在一天内完成，为神经生物学研究提供可靠基础。

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感谢 Vincent Seutin 博士的持续支持，感谢 Christelle Gillissen 和 Laurent Massotte 提供出色的技术协助，感谢 Jean Defourny 博士和 Sandra Ormenese 博士在共聚焦显微镜使用方面的指导，感谢 Jacques Destiné 博士赠送第二台 Axopatch 200B 放大器，感谢 GIGA-成像平台共享共聚焦显微镜和 Imaris 软件，以及感谢 Stephen Freeman 博士对稿件的审阅。本工作获得了比利时科学基金会（F.R.S. - FNRS）资助（项目编号：U.N002.13 和 T.N0015.13），并在比利时大学基金会的支持下发表（Publié avec le concours de la Fondation Universitaire de Belgique）。

作者声明其不存在竞争性财务利益。

本报告描述了一种实施双体树突全细胞记录和局部树突记录的逐步操作方案。该方法可用于分别确定离子通道（例如，Ih）对突触后电位时程的影响，并绘制黑质多巴胺能（DA）神经元体树突区域中该离子通道（Ih）的分布情况。所获得的电生理学测量结果与post hoc组织化学技术相结合，以重建细胞形态。该方法最初用于研究位于黑质的DA神经元，但也可推广应用于邻近的黑质GABA神经元、腹侧被盖区DA神经元或其他中脑神经元。所有步骤也可在不作重大修改的情况下，用于研究黑质神经元树突中表达的其他离子通道。Post hoc形态学可视化尤其适用于具有轴突起自树突特征的神经元，例如黑质神经元25,26、海马区oriens-alveus中间神经元21或部分CA1锥体神经元67。有趣的是，具有此类特征的神经元似乎比普遍认为的更为常见67。形态学分析还可精确揭示电极和轴突的位置。通过免疫组织化学标记轴突起始段表达的蛋白质（如电压门控Na+通道或Ankyrin G），可进一步优化对轴突的检测68,69。
树突记录及后续神经元标记所获得数据的可靠性在很大程度上取决于脑片质量。因此，必须尽最大努力维持组织中细胞的活性。这可通过轻柔对待健康动物、使用高质量的工具与试剂、在整个脑片制备过程中保证组织充分供氧以及保持冰冻温度来实现。稳定记录依赖于健康神经元的选取。在全细胞记录模式下，串联电阻应尽可能低，并在整个实验过程中保持恒定。记录的稳定性还取决于高质量的操纵器，其应无漂移和振动。可通过优化移液管稳定性来减少这些干扰：检查移液管与持管器及前置放大器的连接，确保显微操纵器线缆松弛，避免温度骤变或载物台移动，并检查操纵器的机械结构。对于双细胞记录，使用甲基硫酸盐 13,15,21 已加入细胞内液，但使用了葡萄糖酸盐 9,14,25 可选择性地使用。然而，主要阴离子可能改变膜电位 70,71 以及一些电压依赖性电流 72细胞内液可添加ATP、GTP和磷酸肌酸以维持神经元的生理功能。此外，可在移液管溶液中加入荧光染料例如，Alexa 594 或 Sulforhodamine 101 41) 在进行胞体记录时用于观察树突，例如可用于定位压力施加位置（参考文献7中的图7） 41）或电刺激移液管。用于细胞贴附记录的移液管溶液含有高浓度 K+ 浓度且无钠+ 记录大规模 我h值得注意的是 Na+/+ 浓度比影响电流幅度 10，该电流的反转电位 11 以及门控的 我h 73或者， 我h 也可以使用外向-out记录 10然而，在这种记录构型中，通道附近细胞内的微环境可能会受到干扰。因此，电压依赖性激活方面可能存在差异。 我h 在比较使用细胞贴附式膜片和外向式膜片所获得的电流时，可观察到这一现象 10在膜片钳记录过程中偶尔会遇到神经元肿胀现象，其原因通常各不相同，例如水质不佳、细胞内外溶液之间渗透压或pH值存在显著失衡等 39 或溶液配制中的错误。电生理记录的质量直接影响所重建神经元形态的质量。双通道记录使用高阻抗的胞体电极（6 - 10 MΩ，如参考文献所示） 6,11) 以及在进行细胞贴附记录后进行单细胞体记录，以尽量减少细胞内环境的稀释 14因此，全细胞体记录在细胞贴附记录之后保持较短时间（&#60; 10 分钟）。来自胞体和树突电极的外翻膜片对于细胞膜的正常闭合以及细胞形态的后续恢复至关重要。除了细胞结构外，还可对记录到的神经元进行神经化学物质含量的测定。 59,74例如，可通过免疫标记细胞内蛋白酪氨酸羟化酶来明确鉴定多巴胺能神经元 13.
多巴胺能神经元主要集中在黑质致密部，而在黑质网状部密度较低，且与数量更多的GABA能神经元相互混杂75。尽管多巴胺能神经元的胞体通常比GABA能神经元更大，但通过红外视频显微镜进行视觉识别仍存在不确定性，部分原因是致密部组织的不透明性造成观察困难。为克服这些限制，可通过使用在特定神经元群体中表达荧光标记的转基因小鼠（如TH65或DAT标记多巴胺能神经元，GAD标记GABA能神经元）结合落射荧光照明，实现对多巴胺能神经元的预先筛选。此外，也可将荧光染料加入胞体电极溶液中，以利于树突结构的可视化。尼普科夫盘共聚焦显微技术14,22,30或双光子显微技术7与红外微分干涉对比显微技术（IR-DGC）6联用，可进一步提高荧光标记细胞的分辨率。相较于微分干涉差（DIC）显微技术，微分干涉对比（DGC）具有多项优势：首先，由于无需使用DIC棱镜，IR-DGC图像可直接与荧光图像叠加49,52,53,76；其次，DGC可与光刺激及光遗传学技术结合使用77。
脑片制备的一个缺点是难以完全保持神经元的完整性。多巴胺能神经元的树突在三个空间平面上延伸78,79，因此在脑片中无法完全避免树突区的截断80。脑片切向的选择（冠状面、水平面或旁矢状面）需要权衡利弊，必须根据神经支配的起源及实验设计来确定合适的脑片切向。
直接树突膜片钳技术用于绘制细胞不同区室中功能性离子通道的分布图。此外，该技术还可用于确定通道功能特性的变异程度20。作为补充，可通过免疫组织化学方法在光学显微镜和电子显微镜水平上确定离子通道的位置和密度17,23。该方法还能够测定那些无法用膜片钳电极触及的细小结构中的通道密度。然而，这些通道可能处于不同的功能状态24，甚至相较于膜片钳记录所获得的通道而言处于失活状态。因此，要全面了解特定细胞区域中离子通道的位置及其特性，这两种技术都是必要的17。随着电压敏感性染料的发展，电压成像已被用于在多个位点检测神经元中动作电位（APs）和兴奋性突触后电位（EPSPs）的传播情况81。作为一种双膜片钳记录的替代方法，该技术甚至可用于无法用膜片钳电极记录的细小树突，但需要对信号进行精确校准并进行平均处理。
尽管在生理和病理生理条件下，通常通过胞体记录来广泛研究黑质（SN）和腹侧被盖区的多巴胺能神经元，但在这两种条件下，这些神经元树突的功能特性在很大程度上仍不清楚。已有多个研究团队成功实现了对黑质多巴胺能神经元树突的膜片钳记录13,25,26，该方法仍是解析这些精细亚细胞结构可兴奋特性的首选手段8。树突记录为进一步深入研究突触传递的效率与可塑性，以及树突兴奋性的可塑性提供了可能82,83。

神经元主要通过树突接收突触信息。兴奋性和抑制性突触信号从其产生部位传播到整合部位，在该部位动作电位（APs）被诱发，作为输出信号。在传播过程中，突触电位受到树突结构以及被动膜特性与活性膜特性之间相互作用的共同影响。这些高度可变参数的组合增强了神经元的计算能力&#160;1,2。然而，树突直径微小，阻碍了对其电学特性的研究。在过去几十年中，膜片钳技术的持续发展3、光学技术的进步4以及脑片制备方法的优化5，使得对非常细薄（0.7 - 3 µm Ø）的树突进行记录成为可能6,7。这些方法过去被广泛使用，至今仍被大量用于研究多种神经元中树突的兴奋性8。直接树突记录对于确定离子通道在不同神经元区室中功能特性的分布9-19及其差异20-22至关重要。这些数据是对利用免疫组织化学结合光学显微镜和电子显微镜检测到的离子通道分布的必要补充23,24。双体树突记录技术已被用于探索动作电位9,13-15,21,22,25-27和突触电位13,16,18在神经元胞体-树突区域的传播过程，建立详细的被动电缆模型28-30，以及研究神经元整合的时间分辨率31。
黑质（substantia nigra, SN）是位于中脑的一个区域，参与多种功能，如运动控制、奖赏编码以及习惯性行为。由于黑质内多巴胺能（DA）神经元特异性丢失导致多巴胺减少，与帕金森病患者所表现出的运动障碍密切相关32。黑质神经回路主要由两类细胞组成：多巴胺能神经元和GABA能神经元。有趣的是，这些神经元具有多种特异性特征，使其区别于其他神经元。大部分DA神经元以及部分GABA神经元的轴突起源于树突部位，表明其树突分支具有异质性（即存在带轴突和不带轴突的树突）25,26,33。因此，这类神经元的形态结构不同于典型的神经元组织模式——即遵循卡哈尔提出的动态极化定律：信息传递从树突开始，经胞体，最终到达轴突34。此外，DA神经元还被证实能够通过树突释放多巴胺35，产生簇状放电活动36，以及NMDA受体可塑性37。若无法在这些活动起始的位点进行直接记录，相关机制的研究将十分困难。为了深入理解离子通道在黑质神经元树突中的精确定位与其功能特性之间的关系，及其在树突兴奋性和信息传递中的作用，直接的树突记录是首选方法。
本报告描述了一种详细的实验流程，可用于从黑质神经元的树突获取单细胞和双细胞膜片钳记录，并进行相应的post hoc生物胞素标记。对胞体膜和树突膜进行膜片钳操作的基本原理非常相似。然而在实际操作中，与胞体记录相比，树突记录需要进行特定的优化。成功的树突记录依赖于脑片的质量、光学系统的最佳调节、膜片钳电极的轻柔操作以及记录的稳定性。

<table><tbody><tr><td>双蒸馏水</td><td>Millipore</td><td>超级Q</td><td>电阻率 &gt;14 M&amp;Omega; 厘米，理想值为18.2 M&amp;Omega; 厘米，25&amp;nbsp;&amp;deg;C，经滤膜过滤（0.22） &amp;micro;m)，https://www.merckmillipore.com/BE/zh/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760</td></tr><tr><td>微滤烛式滤器</td><td>Robu</td><td>孔隙度，直径 3、6 mm 或 13 mm</td><td></td></tr><tr><td>带有振动探针的组织切片器</td><td>Leica</td><td>VT1200</td><td>切割参数：速度 0.07，振幅 1.40</td></tr><tr><td>组织切片器</td><td>Dosaka</td><td>DTK-1000</td><td>切割参数：速度 4，频率 7</td></tr><tr><td>剃刀刀片</td><td>吉列</td><td>超级银</td><td></td></tr><tr><td>解剖工具</td><td>布劳恩，埃斯库拉普</td><td></td><td></td></tr><tr><td>预留室</td><td></td><td></td><td>定制</td></tr><tr><td>PP 贝克尔斯</td><td>VWR</td><td>213-1725</td><td>400 ml</td></tr><tr><td>注射器滤器</td><td>默克密理博</td><td>Millex - GV 0.22 &amp;micro;m</td><td></td></tr><tr><td>氰基丙烯酸酯胶水&amp;nbsp;</td><td>UHU</td><td>&quot;瞬间胶&quot;</td><td>液体胶水</td></tr><tr><td>记录室&amp;nbsp;</td><td>Luigs &amp;和诺伊曼</td><td>切片微型培养室</td><td></td></tr><tr><td>水平式移液器拉制仪</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brown-Flaming P-97</td><td></td></tr><tr><td>移液器</td><td>Hilgenberg</td><td>1807524</td><td>外径2 mm、内径1 mm的玻璃毛细管，末端经火焰抛光并清洗</td></tr><tr><td>牙科蜡</td><td>科尔特&amp;egrave;ne/Whaledent</td><td></td><td>正畸托盘蜡条</td></tr><tr><td>铂金网格</td><td></td><td></td><td>使用自制的铂金圆盘将脑片固定在记录室中</td></tr><tr><td>显微操作仪</td><td>Narishige</td><td>MF-830</td><td>拉制毛细管尖端火焰抛光</td></tr><tr><td>硫酸甲酯钾</td><td>MP Biomedicals</td><td>215481</td><td></td></tr><tr><td>生物胞素</td><td>分子探针</td><td>B1592</td><td></td></tr><tr><td>压力计</td><td>GREISINGER electronic</td><td>GDH 13 AN</td><td></td></tr><tr><td>显微镜</td><td>Zeiss</td><td>FS</td><td></td></tr><tr><td>Dodt梯度反差</td><td>Luigs &amp;和 Neumann</td><td></td><td></td></tr><tr><td>操作器</td><td>Luigs &amp;和 Neumann</td><td>LN Mini 25</td><td></td></tr><tr><td>图像采集卡</td><td>The Imaging Source</td><td>DFG/USB2pro</td><td></td></tr><tr><td>相机</td><td>DAGE-MTI</td><td>NC-70</td><td></td></tr><tr><td>聚光镜</td><td>Zeiss</td><td></td><td>高数值孔径油浸式聚光镜</td></tr><tr><td>目标</td><td>Zeiss</td><td>W Plan复消色差物镜 441470-9900 VIS-IR</td><td>63倍放大、长工作距离、高数值孔径1.0水浸物镜</td></tr><tr><td>四重改变器</td><td>Luigs &amp;和 Neumann</td><td></td><td>在相机与显微镜之间</td></tr><tr><td>黑色 &amp;黑白视频监视器</td><td>索尼</td><td>SSM-175CE</td><td>16英寸，850电视线，模拟</td></tr><tr><td>样品瓶，琥珀色玻璃，带瓶盖</td><td>VWR</td><td>215-2409</td><td>将切片从实验装置转移至组织学实验室</td></tr><tr><td>轴突指南</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>书籍</td></tr><tr><td>Stimfit</td><td>https://github.com/neurodroid/stimfit</td><td></td><td>电生理数据的分析</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma</td><td>441244</td><td>使用前请参阅安全数据表及欧盟危险物质指令</td></tr><tr><td>细胞培养板</td><td>Greiner-Bio-One</td><td>662160</td><td>用于固定切片的染色</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merk</td><td>108643</td><td>使用前请参阅安全数据表及欧盟危险物质指令</td></tr><tr><td>小鼠抗TH单克隆一抗</td><td>Immunostar</td><td>22941</td><td>工作浓度：1/1,000</td></tr><tr><td>山羊抗小鼠二抗 - Alexa Fluor 568</td><td>Invitrogen - 赛默飞世尔科技</td><td>A-11031</td><td>工作浓度：1/500</td></tr><tr><td>正常山羊血清</td><td>Dako</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Diamond 抗荧光淬灭剂</td><td>Molecular Probes - 赛默飞世尔科技</td><td>P36961</td><td></td></tr><tr><td>荧光素亲和素 DCS</td><td>Vector Lab</td><td>A-2011</td><td></td></tr><tr><td>共聚焦显微镜</td><td>Olympus</td><td>FV1000</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NeuronJ</td><td>http://www.imagescience.org/meijering/software/neuronj/</td><td></td><td>ImageJ 插件</td></tr><tr><td>Imaris</td><td>http://www.bitplane.com</td><td></td><td>生物素填充神经元的重建</td></tr><tr><td>Neuromantic</td><td>http://www.reading.ac.uk/neuromantic/</td><td></td><td>生物素填充神经元的重建</td></tr><tr><td>WinWCP</td><td>http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td><td>电生理数据的分析</td></tr></tbody></table>

黑质多巴胺能神经元胞体树突区的亚细胞膜片钳记录

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

多巴胺能神经元的树突接收并传递突触输入，支持动作电位的逆向传播以及神经递质的释放。理解这些基本功能将有助于阐明这些神经元中的信息传递机制。树突膜片钳记录技术使得直接检测树突的电学特性及其依赖电压门控的离子通道成为可能。然而，由于树突结构细小，膜片钳电极难以顺利进入。本报告介绍了一种在急性脑片中对多巴胺能神经元树突进行稳定且可靠记录的逐步操作流程。电生理测量结合了post hoc细胞形态学的重建。实验成功的关键在于优化脑片制备、溶液与电极的配置、光学系统的适当调节，以及电极与记录结构接触时的稳定性。虽然体细胞膜片钳记录的标准原理同样适用于树突记录，但电极操作需更加轻柔。这些灵活的技术可广泛应用于研究树突可兴奋特性的多种科学问题。

上述方案旨在促进利用树突膜片钳记录技术采集数据。post hoc 组织化学与该技术相结合，有助于深入理解起源于树突或在树突中传播的多种电信号的机制。尽管使用膜片钳电极直接接触树突存在困难，但若在多个方法学环节上给予特别关注，可显著提高记录成功率。对于已熟练掌握稳定胞体记录技术的实验人员而言，通常可在大多数尝试中获得高阻封接（GΩ级）并完成实验。每次脑片制备过程中可获得一至两条高质量的树突记录。
获得包含健康胞体和树突的高质量脑片是记录这些精细结构的前提条件（图1）。挑选此类神经元的标准是：细胞整体表面光滑且均匀，在光学系统调节至最佳状态时，胞体和树突的对比度较低（图1A 和 1B）。选择对比度过高的神经元通常会导致记录不稳定（图1C 和 1C），因此应避免使用此类神经元。
与其他神经元相比，黑质多巴胺能神经元表现出特定的形态学和电生理学特征。这些通常通过单个胞体微电极评估的特征，也可在双胞体（dual somatic）记录中观察到。图2) 和树突体记录（图3）。长时程超极化电流注入可诱导膜电位整流，称为“下垂”（sag）图2B 和 5D）。在大多数情况下，轴突起源于树突位点，该位点通过互补标准鉴定确定 13,25,26，表明这些神经元的树突区室具有异质性（图3A - 3B因此，最先观察到动作电位的区室对应于轴突发出的区室。图3C - 三维) 13,25,26轴突通常在切片过程中因轴突被切断而形成轴突肿胀体（axonal bleb）作为末端 64，但该结构并未被系统性地检测到。
黑质多巴胺能神经元在 Ih 激活后出现明显的后超极化凹陷（sag），提示其高表达 HCN 亚基。为了确定 Ih 对突触信号整合的影响，在体树突双记录过程中，通过树突记录电极注入模拟的突触样电流（EPSC）波形55（图4）。这些模拟 EPSC 的动力学参数基于真实自发 EPSC 的上升和衰减时间常数。所产生的突触后电位（aEPSP）由胞体电极记录。浴施用 Ih 阻断剂 ZD 7288 后，aEPSP 持续时间延长，表明 Ih 参与调控突触信号的时间进程（图4B）。ZD 7288 还消除了膜电位的整流现象，证实该凹陷由 Ih 激活引起（图4C）。采用模拟 EPSP 所得结果可与电刺激诱发 EPSP 的实验结果相互印证65。为了精确定位 HCN 通道在多巴胺能神经元体树突区域的分布，实施了细胞贴附式记录（图5）。细胞贴附记录必须形成高阻封接（>> 1 GΩ）（图5B）。在多巴胺能神经元的树突中，Ih 在长时间超极化电压阶跃下缓慢激活，且需数百毫秒才能达到稳态电流（图5C），此现象与先前报道一致66。该结果表明，多巴胺能神经元树突中表达的 HCN 通道亚基组成与锥体神经元或其他细胞类型中的不同10,16,66。由于该通道在树突区的分布可能不均一，且树突区本身具有异质性，因此需将红外差分干涉对比（IR-DIC）图像与生物胞素染色后的共聚焦图像进行比对，以确定树突的身份（轴突起始树突或非轴突起始树突）（图3A 和 B）。因此，无论是体树突双记录还是通过后续胞体全细胞记录进行的细胞贴附记录，均需恢复细胞形态。
<img alt="显微镜图像，差分干涉对比下的IR-DGC方法，10 μm比例尺。" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 使用红外视频显微技术观察黑质多巴胺能神经元的胞体及近端树突。（A） 黑质多巴胺能神经元的IR-DGC图像，显示了胞体和近端树突，以及分别位于胞体和树突的记录电极。对该健康神经元成功实施了双体树突记录。可见胞体-树突区域整体对比度低，表面平滑。 （B） 另一个健康的多巴胺能神经元示例。 (C) 表面较粗糙、不均匀且对比度较高的多巴胺能神经元。尽管获得了双通道记录，但由于两根移液管的接入电阻逐渐增加，记录稳定性欠佳，持续时间较短（约15分钟）。 (D) 第二个显示细胞体和近端树突对比度较强的多巴胺能神经元示例。在此情况下，全细胞记录模式建立后不久即观察到串行电阻显著升高。尝试通过负压降低串行电阻未获成功。图C和图D中的神经元可能在脑片制备过程中受损，应避免用于实验。 (E) 记录开始时，对一个健康的多巴胺能神经元进行同时的双体细胞记录。 (F) 与图中同一神经元 E 细胞体肿胀，约17分钟后可见。注意此时完全缺乏对比度，胞体呈球形，且可见明显的大细胞核，而健康神经元中此特征不明显。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="红外微分干涉对比（IR-DGC）显微成像与神经生理学示意图；神经元在电流和电压记录中对电刺激的反应活动。" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 2"> 
图 2. 对多巴胺能神经元进行同时双胞体记录。（A） 对多巴胺能神经元进行双胞体记录期间的 IR-DGC 图像。（B） 注入持续 1 秒的超极化与去极化电流（-160 至 80 pA，步长 80 pA），并用两个膜片电极同时记录到相应的电压变化。注意在长时间超极化电流脉冲下电压轨迹中出现的“下陷”（sag）现象，以及去极化电流脉冲期间动作电位后出现的大规模后超极化。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig2large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="神经元信号分析；显微镜检查，生物胞素标记，电生理图，树突-胞体" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图3"> 
图3. 多巴胺能神经元中的双通道体树突记录 （A） DA神经元的IR-DGC图像。树突与胞体电极之间的距离为 29 µm. （B） 共聚焦z轴投影图像中的神经元（见插图） A 用与异硫氰酸荧光素（FITC）偶联的亲和素标记。记录过程中神经元内灌注了生物胞素。轴突起始于靠近胞体的近端树突，如箭头所示。 (C) 同时进行图A神经元的胞体与树突双部位全细胞电压记录。通过胞体（左侧；黑色电流迹线）和树突（右侧；红色电流迹线）电极分别注入持续1秒的电流脉冲，在胞体（黑色电压迹线）和树突（红色电压迹线）记录到的动作电位。 (D) 体细胞和树突动作电位在扩展的时间尺度上显示。无论在体细胞还是树突注入电流，体细胞动作电位（黑色）均先于树突动作电位（红色）出现。该神经元中动作电位之间的延迟为 120 µs 和 210 µs 分别通过躯体和树突电流注入。动作电位上升相中，在动作电位半峰幅处测量延迟。动作电位首先出现在靠近轴突起始段的区室，证实了先前的观察结果。 25,26在此情况下，树突记录来自无轴突的树突。有关来自有轴突树突记录的示例见参考文献。 13 （见其图1）。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig3large.jpg" target="_blank">请点击此处以查看此图的放大版本。</a>
<img alt="电生理实验；树突注射，胞体记录，胞体反应图；膜片钳。" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 4"> 
图 4. 人工兴奋性突触后电位（EPSP）在多巴胺能神经元（DA 神经元）体树突轴上的传播。（A） 一个多巴胺能神经元的红外差分干涉对比（IR-DGC）图像。树突与胞体记录移液管之间的距离为 45 µm。两个膜片移液管均处于全细胞电流钳记录模式。（B） 通过树突移液管在电流钳模式下记录到的电流（上图），用于生成人工 EPSP。该电流通过树突记录移液管注入一个类似兴奋性突触后电流（EPSC）的波形（τrise = 0.6 ms；τdecay = 3 ms；幅度 = 100 pA）而获得55。下图显示了在对照条件下（黑色）以及浴施加 Ih 阻断剂 ZD7288（30 µM；红色曲线）后，在胞体记录到的传播性 aEPSP。每条电压轨迹均为 40 次单次扫描的平均值。注意在 ZD7288 存在时 EPSP 持续时间显著延长，表明 Ih 对 EPSP 时间进程具有贡献作用。（C） 在对照条件下（黑色）以及施加 30 µM ZD7288 后（红色），对长时程（30 pA；1 s）超极化电流脉冲所记录的胞体电压轨迹。注意在 Ih 被阻断后，膜电位整流（sag）现象消失。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig4large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<img alt="电生理实验：树突电压钳记录；示意图显示电流反应数据。" src="/files/ftp_upload/54601/54601fig5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 5"> 
图 5. 多巴胺能神经元树突中 Ih 电流的存在。（A） 多巴胺能神经元的红外差分干涉相衬（IR-DIC）图像，显示移液管位于近端树突上。（B） 在细胞贴附式构型下，施加 5 mV 电压指令时的容性电流和漏电流。本示例中封接电阻为 5 GΩ。（C） 从膜电位 0 mV 开始施加超极化电压阶跃（90 mV；上方），诱导出缓慢激活的 Ih 电流。电流迹线经反转后，采用单指数函数拟合，得到时间常数 τ = 632 ms。（D） 全细胞记录的胞体（图 A）对持续 1 秒的超极化和去极化电流脉冲（-160 至 120 pA，步长 40 pA）的电压反应。胞体全细胞记录在细胞贴附记录完成后进行。注意，由于细胞外施加 TTX 和 Cd2+ 以抑制细胞贴附记录期间的自发放电，因此未观察到动作电位（APs）。这些电压门控 Na+ 和 Ca2+ 电流阻断剂用于抑制动作电流。图 A 至 D 来自同一个神经元。（E） 另一个多巴胺能神经元的红外差分干涉相衬（IR-DIC）图像，以及树突上的移液管。（F） 在图 E 所示神经元近端树突切下的外向膜片中，通过测试脉冲至 0 mV（前脉冲为 -120 mV，持续 50 ms）激活的电压依赖性电流。保持电位为 -80 mV。注意电流具有时间依赖性失活特征。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54601/54601fig5large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物质</td>
			<td>g/mol</td>
			<td>浓度</td>
			<td>配制 1 L 所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.443</td>
			<td>125 mM</td>
			<td>7.305 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.007</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>2.100 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>74.551</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>0.186 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>137.99</td>
			<td>1.25 mM</td>
			<td>0.172 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖</td>
			<td>198.17</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>4.95 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>1 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>2 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">渗透压：~ 310 mOsmol/L（最佳范围：314 – 325 mOsmol/L），pH = 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：人工脑脊液（ACSF）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物质</td>
			<td>g/mol</td>
			<td>浓度</td>
			<td>配制 1 L 所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>58.443</td>
			<td>87 mM</td>
			<td>5.084 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaHCO3</td>
			<td>84.007</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>2.1001 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>7.551</td>
			<td>2.5 mM</td>
			<td>0.18637 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaH2PO4</td>
			<td>137.99</td>
			<td>1.25 mM</td>
			<td>0.17248 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>7 mM</td>
			<td>7 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>葡萄糖</td>
			<td>198.17</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>1.9817 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>蔗糖</td>
			<td>342.29</td>
			<td>75 mM</td>
			<td>25.672 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>0.5 mM</td>
			<td>0.5 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">渗透压：~ 326 mOsmol/L，pH = 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2： 制备脑片用的蔗糖-人工脑脊液（ACSF）。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物质</td>
			<td>g/mol</td>
			<td>浓度</td>
			<td>配制 100 mL 所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KMeSO4</td>
			<td>150.2</td>
			<td>120 mM</td>
			<td>1.8024 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>74.56</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>0.14912 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2ATP</td>
			<td>551.1</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>0.1102 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2GTP</td>
			<td>523.2 </td>
			<td>0.5 mM</td>
			<td>0.02661 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na2-磷酸肌酸</td>
			<td>255.1</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0.1275 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>380.4</td>
			<td>0.1 mM</td>
			<td>3.803 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>238.31</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0.23831 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>生物胞素</td>
			<td>1 mg/mL</td>
			<td></td>
			<td>0.1 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">渗透压：约 302 mOsmol/L，用 KOH 调节 pH 至 7.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表3：双记录用细胞内溶液。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>物质</td>
			<td>g/mol</td>
			<td>浓度</td>
			<td>配制 100 mL 所需量</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>74.56</td>
			<td>120 mM</td>
			<td>0.8947 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>2 mM</td>
			<td>200 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>1 M (溶液)</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>100 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>238.31</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>0.23831</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEA-Cl</td>
			<td>165.7</td>
			<td>20 mM</td>
			<td>0.3314 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-AP</td>
			<td>94.11</td>
			<td>5 mM</td>
			<td>0.04705 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BaCl2</td>
			<td>244.26</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>0.02443 g</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CdCl2</td>
			<td>183.32</td>
			<td>0.02 mM</td>
			<td>0.3666 mg</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTX</td>
			<td>1 mM</td>
			<td>200 nM</td>
			<td>20 µl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">渗透压：约 290 mOsmol/L，用 D-葡萄糖调节（参考文献 16）；pH = 7.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表4：细胞贴附记录的电极液配方。

亚细胞膜片钳记录技术为研究树突的功能特性提供了可能。然而，由于树突结构细小，难以接近。本文所述方案旨在促进从脑片中多巴胺能神经元树突获取稳定且可靠的记录 体外.

多巴胺能神经元的树突接收并传递突触输入，支持动作电位的逆向传播以及神经递质的释放。理解……

该方法有助于解答神经生物学领域的一些关键问题，例如单个电压门控离子通道如何影响特定神经元的功能。该技术的主要优势在于，能够在神经元的亚细胞水平上定位离子通道的功能。开始此操作时，将脑组织置于底部覆盖一层 SiliGuard 的 9 厘米培养皿中。接下来，用冰冻的蔗糖-人工脑脊液（sucrose-ACSF）包围脑组织。为制备冠状切片，进行两次切割以去除小脑和脑的前部。然后在标本托盘上涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并将脑组织块粘附于托盘上，使脑的前部朝向切片阶段。随后，在脑组织上滴加几滴蔗糖-ACSF，缓慢将托盘浸入切片室中。接着，将剃刀刀片调整至与水平面成15度角。在到达黑质之前，沿鼻侧方向切割约500微米厚的冠状脑片。然后调整厚度，切割包含目标区域的300微米切片。使用连接在注射器上、与剃刀刀片边缘平行的极细灌注针将切片从组织块上分离。随后，将切片转移至34摄氏度的孵育 chamber 中保存一小时。在此步骤中，将脑片转移至记录室。使用铂金丝环将脑片固定在记录室底部，并确保脑片质量良好，表面光滑且均匀。然后选择一个具有在同一个平面上延伸较长距离的树突的神经元，并确保目标树突可连续追踪至一个界限清晰的胞体。接下来，用电极液填充记录电极。若要以细胞贴附式记录模式记录树突，需先识别并聚焦于树突的某一部分。向电极内施加正压，并使用显微操作器将其缓慢下降。 然后将移液管靠近膜表面，调节压力以形成一个小凹陷。随后释放移液管尖端的压力，在控制移液管电阻的同时对树突进行封接。对于细胞贴附式记录，应尽量获得大于1 GΩ的封接电阻，最佳范围为3至10 GΩ。随后，将移液管从膜上回撤数微米，以避免树突变形。此处观察到的动作电流代表黑质神经元的自发动作电位。为抑制动作电流，可在人工脑脊液（ACSF）中加入钙离子和钠离子通道阻断剂。然后施加一个从0毫伏保持电位到90毫伏的电压阶跃，以诱发超极化激活的阳离子电流。记录结束时，击破膜片以获得全细胞模式。随后，缓慢而轻柔地将树突电极从神经元膜上撤出，以获得外向-out膜片。为了以全细胞模式记录相应胞体的信号，首先定位该树突对应的胞体。将一支电阻为五到十兆欧姆、内含钾基细胞内液的移液管下降至细胞体。然后对移液管尖端施加短暂的负压，以破裂细胞膜，从而实现全细胞模式。在电流钳模式下，通过施加长时程的超极化和去极化电流脉冲来确认神经元的身份，并使移液管中的生物胞素沿树突扩散。10分钟后，撤出移液管以获得外向膜片。当移液管移至脑片上方后，采用一系列短暂的侧向向上移动，以促进细胞膜的适当闭合，最终完全移出记录 chamber。将脑片继续置于记录室中，在标准ACSF中孵育15分钟，以使生物胞素与记录的神经元充分平衡。然后轻柔地将脑片转移至一个含有标准ACSF的25毫升棕色玻璃瓶中，用于后续组织学处理。在此步骤中，使用落射荧光显微镜大致定位脑片中荧光标记的神经元。使用10倍物镜快速观察神经元的树突分支，并定位轴突及轴突膨大。随后切换至共聚焦显微镜，选择488纳米激光二极管激发标记的神经元。沿Z轴追踪轴突和树突的延伸，连续采集图像以获得覆盖整个细胞的Z轴层扫图像序列。调整Z轴分辨率，以低倍和高倍采集细胞的共聚焦图像。最后，使用成像软件打开神经元的图像文件。通过肉眼比较Z轴投影图像与红外差分干涉对比（IR-DGC）图像，确定电生理记录过程中膜片钳电极尖端的精确位置。图中显示的是多巴胺能神经元及其近端树突上电极的红外差分干涉相差显微图像（IR-DGC）。电流迹线展示了在细胞贴附式记录构型下，当封接电阻为5 GΩ时，对+5 mV电压指令所产生的EN漏电流。从0 mV膜电位施加去极化电压阶跃，可诱导出缓慢激活的超极化激活阳离子电流。电流迹线被反转，并用单指数函数进行拟合，得到的时间常数为632毫秒。以下是全细胞记录的胞体在电压门控钠离子和钙离子电流阻断剂存在下，对持续一秒的超极化和去极化电流脉冲的电压反应，以消除细胞贴附记录期间的动作电位。一旦掌握，该技术若操作得当，可在一天内完成。在进行该操作时，重要的是要记住获取健康的组织并维持稳定的记录条件。完成该操作后，还可采用其他方法（如免疫组织化学）来回答更多问题，例如所记录神经元的身份。该技术一经建立，便为神经生理学领域的研究人员探索兴奋性细胞中电压门控离子通道的功能特性及其作用奠定了基础。观看本视频后，您应能够充分理解如何记录并分析流经树突中电压门控离子通道的电流分布。

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