黑质多巴胺能神经元胞体树突区的亚细胞膜片钳记录

该方法有助于解答神经生物学领域中的关键问题，例如单个电压门控离子通道如何影响特定神经元的功能。该技术的主要优势在于，能够在神经元的亚细胞水平上定位离子通道的功能。开始此操作时，将脑组织置于一个底部涂有SiliGuard层的9厘米培养皿中。

接下来，用冰冻的蔗糖-人工脑脊液（sucrose-ACSF）包围脑组织。为制备冠状切片，进行两次切割以去除小脑和脑的前部。然后在样品托上涂抹氰基丙烯酸酯胶水，并将脑组织块粘附于托上，使脑的前部朝向切片台。

随后，在脑组织上滴加几滴蔗糖-ACSF溶液，并缓慢将托盘浸入切片室中。接着，将剃刀刀片调整至与水平面成15度角。在到达黑质之前，沿鼻侧方向切割约500微米厚的冠状脑片。

然后调整厚度，切割出包含目标区域的300微米切片。使用连接在注射器上、与剃须刀片边缘平行的极细灌注针将切片从组织块上分离。随后，将切片转移至34摄氏度的保存室中孵育一小时。

在此步骤中，将脑片转移至记录室。使用铂金丝环将脑片固定在记录室底部，并确保脑片质量良好，表面光滑且均匀。然后选择一个具有在同一个平面上延伸较长距离的树突的神经元，并确保目标树突可连续追踪至一个界限清晰的胞体。

接下来，用电极液填充膜片钳电极。若以细胞贴附模式对树突进行膜片钳记录，需先识别并聚焦于树突的某一部分。向电极施加正压，并使用显微操作器将其缓慢下降。

然后将移液管靠近膜并调节压力，以形成一个小的凹陷。随后释放移液管尖端的压力，同时监测移液管电阻，对树突进行封接。对于细胞贴附式记录，应尽量获得大于1 GΩ的封接电阻，最好在3至10 GΩ之间。

随后，将移液管从膜上回撤数微米，以避免树突变形。此处观察到的动作电流代表黑质神经元的自发动作电位。为抑制动作电流，可在人工脑脊液（ACSF）中加入钙离子和钠离子通道阻断剂。

然后施加一个从 0 毫伏保持电位到 +90 毫伏的电压阶跃，以诱发超极化激活的阳离子电流。在记录结束时，击破膜片以获得全细胞模式。随后，缓慢而轻柔地将树突电极从神经元膜上撤出，以获得外向-out 膜片。

为了以全细胞模式记录相应胞体的电活动，请先定位该树突对应的胞体。将一支电阻为5至10兆欧、内充钾基细胞内液的移液管移至细胞体处，然后对移液管尖端施加短暂的负压，以破裂细胞膜，从而实现全细胞记录模式。

通过施加长时程的超极化和去极化电流脉冲，在电流钳模式下确认神经元的身份，并让移液管中的生物胞素沿树突扩散。10分钟后，撤出移液管以获得外向膜片。当移液管位于脑片上方后，采用一系列短暂的侧向向上移动，以促进细胞膜的适当闭合，从而完全退出记录腔室。

将脑片继续置于记录室中，在标准ACSF中孵育15分钟，以使生物胞素与记录的神经元充分平衡。然后轻柔地将脑片转移至一个含有标准ACSF的25毫升棕色玻璃瓶中，用于后续组织学处理。在此步骤中，使用落射荧光显微镜大致定位脑片中荧光标记的神经元。

使用10倍物镜快速观察神经元的树突分支，并定位轴突及轴突膨大部位。随后切换至共聚焦显微镜，选择488纳米激光二极管以激发标记的神经元。沿Z轴追踪轴突和树突的延伸部分，并连续采集图像，以获得整个细胞的Z轴层扫图像序列。

调整Z轴分辨率，以低倍和高倍采集细胞的共聚焦图像。最后，使用成像软件打开神经元的图像文件。通过肉眼比较Z轴投影图像与红外差分干涉对比（IR-DGC）图像，以确定电生理记录过程中膜片钳电极尖端的精确位置。

图中显示的是多巴胺能神经元及其近端树突上电极的红外差分干涉显微（IR-DGC）图像。电流迹线展示了在细胞贴附模式下，当施加5毫伏电压指令时，由内向整流通道（EN）产生的漏电流。从0毫伏膜电位开始的超极化电压阶跃诱导出一种缓慢激活的超极化激活阳离子电流。

将当前的电流迹线反转，并用单指数函数进行拟合，得到的时间常数为632毫秒。图中显示的是在存在电压门控钠离子和钙离子电流阻断剂的情况下，通过全细胞记录的细胞体对持续一秒的超极化和去极化电流脉冲所产生的电压反应，以消除细胞贴附记录期间的动作电位。一旦掌握，该技术若操作得当，可在一天内完成。

在进行该操作时，重要的是要记住获取健康的组织并维持稳定的记录条件。完成该操作后，还可采用其他方法（如免疫组织化学）来回答更多问题，例如所记录神经元的身份鉴定。该技术问世后，为神经生理学领域的研究人员探索可兴奋细胞中电压门控离子通道的功能特性及其作用奠定了基础。

观看本视频后，您应该能够很好地理解如何记录和检测通过树突中电压门控离子通道的电流分布。