用于细胞表面引导与生物打印的自动化机器人分配技术

该自动化机器人分配技术的总体目标是创建一种用于细胞拓扑引导的表面，并随后按照预设的程序模式将细胞递送至这些微结构特征上，从而实现对细胞行为和分布的精确控制。该方法有助于解答生物医学工程领域中的一些关键问题，例如表面拓扑结构如何影响单细胞培养以及共培养条件下的细胞行为。该技术的主要优势在于，与传统成熟方法相比，编程和打印细胞引导图案所需时间更少。

该方法还包含用于精确分配的细胞递送步骤。当我们意识到沉积在水凝胶中的细胞二维图案可受益于表面引导时，首次提出了这一方法。因此，我们开发了这种技术，以使水凝胶的打印方式能够与表面特征相匹配。

本方案描述了利用背压辅助型机器人分配系统作为表面蚀刻和基于挤出的生物打印设备的方法。为准备用于蚀刻和打印的聚苯乙烯表面，应选择厚度为一毫米的聚苯乙烯片材。较厚的片材更容易发生弯曲。

然后，用氧气等离子体处理该片材。将氧气气体调节器设置为两巴。接着，打开等离子体仪，并启动真空泵。

将设备设置为150瓦，并调节氧气气体流速为30标准立方厘米每分钟，使材料片在此条件下处理10分钟。随后，抽空腔室，关闭并密封舱门，启动运行周期。接下来，将处理后的材料片浸入纯胎牛血清中，于37摄氏度条件下振荡孵育2小时。

血清处理后，用1× PBS清洗材料片三次，并对材料片进行灭菌。最后一次清洗后，将材料片置于37摄氏度烘箱中过夜干燥，约12小时。首先准备用于刻蚀的打印探针。

小心地将直径为1.5毫米的纺织针插入分配注射器的喷嘴，直至其卡紧并固定。首次尝试创建生物打印结构时，应在带编号坐标轴的方格纸上绘制所需图案，以获得x、y坐标，然后将该图案的坐标输入电子表格中。

接下来，在打印软件中选择程序，添加程序，然后选择编辑，添加点以建立程序。随后，将电子表格中的 x 和 y 坐标值复制到打印分配软件中。每次运行前，校准机器人的 z 轴高度以设定触针接触位置。

首先，选择机器人选项。然后，点击“更改模式”并启用“教学模式”选项。这将启用机器人的点动（JOG）功能。

要操控机器人，首先选择“Robot”（机器人）菜单中的“Meca Initialize”（机械初始化），将机器人置于默认位置。然后选择“Robot”（机器人）菜单中的“JOG”（点动）。接下来，在 x 和 y 输入框中输入所需移动的距离（单位为毫米），使触针精确地位于图案的原点处。

然后，同样以毫米为单位，在 z 槽中输入一个数值，使探针或喷嘴与表面接触，但不使表面发生弯曲或压陷。此值即为 z 的起始值。可通过调节 z 高度来改变每条沟槽的深度。

例如，切割的凹槽深度可以为 40、80 或 170 微米。需要集中注意力并仔细观察，以找到一个接触点，使得触针无弯曲，且表面无明显压痕。为确保成功，我们建议准备多张样品，并在不同的 Z 轴高度运行程序，以确定理想的起始位置。

下一步是为每个坐标点定义打印指令。使用“行首开始点胶”来定义第一个点并启动打印，使用“行进过点”来指定中间点，最后使用“行末结束点胶”通知机器人终止打印运行。

要将程序传输给机器人，请选择“机器人”、“发送 C&T 数据”。然后，通过选择“机器人”、“更改模式”、“切换运行模式”并将设置更改为“运行”来启动运行。最后，开始打印。

制备生物墨水时，将2%明胶溶解于添加了10%胎牛血清（FBS）和2%抗生素-抗真菌剂的Alpha MEM培养基中。将培养基置于60摄氏度条件下持续两小时，以使明胶充分溶解。将用于制备生物墨水的细胞在10厘米培养皿中培养至70%融合度。

可使用任何对表面引导特征有响应的细胞，且这些细胞应表达荧光标记，以便在包埋过程中能够观察到。通过移除培养基、用PBS洗涤细胞，并在37摄氏度下用1×胰蛋白酶-EDTA溶液处理细胞5分钟，使贴壁细胞脱落并释放到悬液中。用培养基中和胰蛋白酶后，将细胞收集至悬液中，并在1,000 ×g下离心5分钟形成细胞沉淀。

描述上清液，并将细胞重悬于0.5毫升培养基中。测定细胞密度后，将细胞悬液混入已冷却的生物墨水溶液中，制备成每毫米含有五百万个细胞的溶液。然后，将含细胞的生物墨水倒入已准备好的、前端用堵头封闭的打印注射器中。

将装有材料的注射器冷却至四摄氏度，以达到可打印的黏度。然后取出已装载并冷却的注射器，取下注射器帽，安装打印喷嘴。接着，将装有材料的注射器装入分配系统，并连接至气压管路。

为了将生物墨水精确打印到预设计的图案上，需要确保边缘和线条清晰分明。通过优化分配器的背压和打印喷嘴的针头规格，可实现精确打印。对于带有34号锥形针头的10毫升注射器，将分配器的背压设置为0.05兆帕。

然后，在软件中将书写速度设置为每秒5毫米，作用于聚苯乙烯薄膜表面。现在，按照预设的程序模式，将含有细胞的生物墨水沉积到预先刻蚀的凹槽中。细胞沉积完成后，将该片材在室温下孵育20分钟。

随后，将打印好的细胞支架覆盖适量的生长培养基，并将细胞孵育24小时，以使细胞在进一步实验前充分贴附。通过生物打印将干细胞接种于生物墨水后，细胞最终沉降至表面，并沿预先刻蚀的微细线条方向感知并伸展。在未进行生物打印的情况下，直接接种于培养基中的细胞也沿这些微结构特征方向排列。

然而，它们也覆盖了整个表面，因此生物墨水将细胞限制在打印的轨迹中。当细胞被接种到没有蚀刻特征的片材上时，细胞未显示出任何取向或排列。观看本视频后，您应能充分掌握如何在聚苯乙烯片材上精确蚀刻沟槽，并将细胞精确地生物打印到这些沟槽中。

一旦掌握，该技术可在大约两到三小时内完成。对于生物工程领域的研究人员而言，该技术非常有用，可用于在需要细胞各向异性和定位的模型中揭示细胞表面相互作用。请勿忘记，生物墨水含有活细胞，因此在打印片层时采用无菌操作技术至关重要。