自动点胶机器人技术在细胞表面和指导生物印刷

该协议描述了一种使用自动机器人沉积系统的生物打印方法，该方法将蚀刻的地形指导线索与带有水凝胶生物墨水的细胞的精确沉积相结合。打印的单元直接输送到蚀刻特征，并能够感知和定位它们。

这种自动机器人分配技术的总体目标是创建一个用于拓扑细胞引导的表面，然后按照编程模式将细胞输送到这些特征，从而控制细胞行为和分布。这种方法可以帮助回答生物医学工程领域的关键问题，例如表面拓扑结构如何影响细胞行为，无论是在单一培养还是共培养中。这种技术的主要优点是，与更成熟的方法相比，编程和打印细胞引导图案的时间更少。

它还包括用于受控分液的细胞递送步骤。当我们意识到沉积在水凝胶中的细胞的 2D 模式可以从表面引导中受益时，我们第一次有了这种方法的想法。因此，我们开发了这项技术，以匹配表面特征的方式打印水凝胶。

该协议描述了背压辅助机器人分配系统的使用作为基于表面蚀刻和挤压的生物打印机。要准备用于蚀刻和打印的聚苯乙烯表面，请选择 1 毫米厚的聚苯乙烯片材。较厚的床单会更容易弯曲。

然后，用氧等离子体处理片材。将氧气调节器设置为 2 格。然后，打开等离子机并打开真空泵。

继续将机器编程为每分钟 150 瓦和 30 标准立方厘米的氧气流量，并将板材暴露在这些条件下 10 分钟。然后，抽空腔室并密封门并开始循环。接下来，将处理过的片状物浸入纯胎牛血清中，并在 37 摄氏度下搅拌孵育 2 小时。

血清处理后，用 1X PBS 清洗片材 3 次，并对片材进行消毒。最后一次洗涤后，将片材放在 37 摄氏度的烤箱中晾干约 12 小时。首先准备用于蚀刻的打印触笔。

小心地将直径为 1.5 毫米的纺织针头插入分配注射器的喷嘴中，直到它楔入并固定。首次尝试创建生物打印排列时，在带有编号轴的方格纸上绘制所需的图案，以生成 x、y 坐标。然后将模式的坐标输入到电子表格中。

接下来，在打印软件中，选择 程序， 添加程序，然后 编辑， 添加点 建立程序。然后，将 x 和 y 坐标值从电子表格复制到打印分配软件中。每次运行前，校准机器人的 z 高度以设置触控笔接触位置。

首先，选择 Robot 选项。然后，单击 更改模式 并启用 Teaching Mode 选项。这将启用机器人的 JOG 功能。

要对机器人进行点动作，请首先选择 Robot 和 Meca Initialize 将机器人置于默认位置。然后是 Robot、JOG。接下来，在 x 和 y 插槽中，输入将触笔精确放置在图案原点上所需的距离（以毫米为单位）。

然后，同样以毫米为单位，在 z 槽中输入一个数值，使触针或喷嘴与表面接触，而不会使表面弯曲或缩进。这被指定为 z 的起始值。每个凹槽的深度可以使用 z 高度来改变。

例如，切割槽的深度可以是 40、80 或 170 微米。需要集中注意力和密切观察才能找到一个接触点，这样测针就不会弯曲或在表面上出现明显的凹痕。为确保成功，我们建议准备几张板材并在不同的 z 高度运行程序，以找到理想的起始位置。

下一步是定义每个坐标点的 print 指令。使用 Start of Line Dispense 定义第一个点和打印起始。使用 Line Pass 指定中间点，最后，使用 End of Line Dispense 向机器人发出信号以终止打印运行。

要将程序传达给机器人，请选择机器人，发送C&T数据。然后，通过选择 Robot （机器人）、Changing Mode （更改模式）、Switch Run Mode （切换运行模式） 并将设置切换到 Run （运行） 来启动运行。最后，开始打印。

为了制作生物墨水，将 2% 明胶溶解在补充有 10% FBS 和 2% 抗生素抗真菌剂的 Alpha MEM 中。将培养基在 60 摄氏度下放置 2 小时，让明胶溶解在培养基中。在 10 厘米培养皿中培养生物墨水的细胞至 70% 汇合。

可以使用任何响应表面导向特征的细胞，它们应表达荧光标记，以便在包埋过程中可以看到它们。去除培养基，用 PBS 洗涤细胞，并在 37 摄氏度下用 1X 胰蛋白酶-EDTA 溶液包被细胞 5 分钟，将贴壁细胞释放到悬浮液中。用培养基中和胰蛋白酶后，将细胞收集在悬浮液中，并以 1， 000 g 的浓度沉淀 5 分钟。

描述上清液并将细胞重悬于 0.5 mL 培养基中。测量细胞密度后，将悬浮液混合到冷却的生物墨水溶液中，制成每毫米 500 万个细胞的溶液。然后，将含有细胞的生物墨水倒入准备好的打印注射器中，该注射器被诱饵帽堵塞。

将加载的注射器冷却至 4 摄氏度，以获得可打印的粘度。然后，取出加载并冷却的注射器，取下注射器盖，并连接打印喷嘴。然后，将加载的注射器连接到分配系统并将其连接到气压管路。

为了将生物墨水打印到预先设计的图案上，边缘和线条需要清晰。精确印刷实际上是通过优化分配器的背压和印刷喷嘴的针规来实现的。对于带有 34 号锥形针头的 10 毫升注射器，将分配器的背压设置为 0.05 兆帕。

然后，在软件中，将写入聚苯乙烯薄膜表面的速度设置为每秒 5 毫米。现在，按照编程的模式，将细胞化的生物墨水沉积到预先蚀刻的凹槽上。沉积细胞后，让片状物在室温下孵育 20 分钟。

然后，用适当的生长培养基覆盖打印的细胞支架，并孵育细胞 24 小时，以便在进一步实验之前细胞附着。在生物墨水中通过生物打印接种的干细胞最终沉淀到表面，并沿着谨慎蚀刻的线条的方向被感应和拉长。在培养基中接种的细胞，没有生物打印，也沿特征方向对齐。

然而，它们也覆盖了整个表面，因此，生物墨水将细胞限制在打印的痕迹上。当接种到没有蚀刻特征的片材上时，细胞没有显示方向或对齐。看完这个视频，你应该对如何在聚苯乙烯片材上精确蚀刻凹槽，然后将细胞精确地生物打印到凹槽中有了很好的了解。

一旦掌握，这项技术可以在大约两到三个小时内完成。对于生物工程领域的研究人员来说，在需要细胞各向异性和定位的模型中揭示细胞表面相互作用非常有用。不要忘记生物墨水含有活细胞，打印片材时使用无菌技术非常重要。