Name: 利用毛细管电泳从植物组织量化有机酸:一个测试用例检查小粒种咖啡种子 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: 学习利用毛细管电泳技术定量分析植物组织中的有机酸，以咖啡种子为案例。该方法样品制备简便、通量高且成本低廉，适用于植物生理学和食品科学研究。

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作者感谢J.M. Smucker公司对本项目提供的资金支持。

1. 样品制备
<ol>
	<li>组装短链羧酸（SCCA）提取样品。每次处理1.0 g咖啡种子，以确保加工后仍有足量样品留存。
	<ol>
		<li>若样本在研磨前已被冷冻，则在整个处理过程中应保持组织处于冷冻状态，以防止冻融损伤和样本氧化。仅在研磨所需时，方可将样本从冰箱或超低温储存环境中取出。</li>
		<li>在研磨样品前，立即将新鲜样品置于液氮中速冻。为尽量减少样品操作，可将样品放入预先装有液氮的研钵中进行速冻。</li>
		<li>生成液体样品后应立即进行分析，或在液氮中速冻后于 -20 ºC 或 -80 ºC 保存直至分析。分析前，将冷冻样品从储存温度取出，使其充分解冻。液体样品直接进入步骤（3.5）进行处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>操作液氮前应穿戴适当的个人防护装备（包括护目镜、手套和实验服）。</li>
	<li>将组织样本研磨三次，直至形成均匀的细粉（即， 在液氮中使用陶瓷研钵和研杵将样品研磨成均匀粒径的粉末。 
	注意：获得均匀的颗粒尺寸对于最大化SCCA提取效率至关重要。
	<ol>
		<li>在加入样品前，先用液氮预冷研钵和研杵。加入样品时，保持研钵内盛有少量液氮。</li>
		<li>使用勺子向研钵中加入足量液氮，直至完全浸没样品。</li>
		<li>将易于研磨的样品（如叶片或烘焙咖啡豆）加入液氮中，用环形研磨动作进行粉碎。当液氮液面下降至刚好浸没样品时，开始研磨。</li>
		<li>将难以研磨的样品（如生咖啡豆）加入液氮中，冷冻10-30秒（或直至液氮停止剧烈沸腾）后再进行研磨。先使用垂直碾压动作将组织破碎成较小片段，再通过环形研磨动作完成组织的彻底研磨。</li>
		<li>重复步骤1.3.2–1.3.4两次，使样品总共研磨三次。通常，连续三次研磨可将样品研磨成质地类似面粉的粉末。</li>
		<li>如果未达到类似面粉的质地，需重复步骤1.3.2–1.3.4，直至样品研磨成粒径均匀且细小的粉末（提取效率与粒径成反比）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将粉末转移至玻璃小瓶或1.5 ml离心管中。建议研磨后立即进行后续处理，或在提取前将样品于-80 ºC保存。
	<ol>
		<li>如果样品在分析前需要储存，应将样品分成每份500 mg的等分试样（或 500 µl 将液体样品分装至多个管中保存。避免样品经历反复冻融循环，因为这可能会改变样品成分并对后续的样品检测产生不利影响。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 有机酸标准品制备
<ol>
	<li>为感兴趣的短链羧酸（SCCA）配制真实标准品。这些标准品将用于制备外标和内标溶液，以测定SCCA的浓度。对于咖啡样品，所关注的酸包括柠檬酸、苹果酸、乙酸和乳酸，内标物为己二酸。
	<ol>
		<li>确保所选内标物在样品中天然不存在，且内标物不会与样品谱图中的其他峰共洗脱。</li>
		<li>为每种目标SCCA运行标准曲线，并确定每种SCCA的线性响应范围（运行说明见第4节）。确保为样品中待测的每种SCCA均运行标准曲线。 
		注意：标准曲线可在缓冲液中或待测样品的背景基质中进行。在后一种情况（“标准加入法”）下，标准曲线各点的峰面积值需通过扣除样品背景后确定。</li>
		<li>预先用SCCA酸的名称、浓度和检测日期标记所有需要的试管和玻璃器皿。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用容量瓶配制每种标准品的储备液，浓度为已知浓度（10 mg/ml），以确保标准品配制过程中的准确性。
	<ol>
		<li>将固态SCCA标准品（柠檬酸和苹果酸）溶解于超纯水（18.2 MΩ）中，配制成所需浓度的储备溶液。
		<ol>
			<li>将100 mg标准品加入10 ml容量瓶中，配制成10 mg/ml的储备液。用超纯水定容至10 ml刻度线以溶解酸。</li>
			<li>配制较低浓度的酸标准品，或轻轻加热烧瓶，以促进难溶性SCCA标准品（如己二酸）溶解。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将液相酸标准品（乙酸和乳酸）用超纯水稀释至所需浓度。
		<ol>
			<li>预先用5 ml超纯水填充容量瓶。加入足量酸以配制10 mg/ml的溶液（根据供应商提供的酸密度计算），然后加水至溶液终体积为10 ml。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将每种储备液转移至洁净的15 ml玻璃试管中，试管需配有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫盖子，并用塑料封口膜密封。储备液可在密封的试管中于4 ºC保存1周。
	<ol>
		<li>确保在使用前SCCA标准品溶液中无沉淀析出，尤其是配制后已将储备液冷藏的情况下。可通过温和加热使沉淀重新溶解。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制 SCCA 提取液。加入内标物，使其在样品中的浓度足以被检测（0.05 mg/ml）。配制足量溶液以用于所有样品的提取。
	<ol>
		<li>通过将内标储备液用超纯水稀释至0.05 mg/ml，配制50 ml SCCA提取溶液。加入 250 µl 将内标储备液（10 mg/ml）定容至49.75 ml水中。</li>
		<li>如果需要稀释提取物，应调整提取液中内标物的浓度，使稀释后（0.05 mg/ml）内标物的最终浓度处于毛细管电泳系统定量限范围内（产生可检测但不过度饱和的峰，参见下文5.2.2）。</li>
		<li>每次提取系列实验前均需配制新鲜的提取液（即， 每个实验系列）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为感兴趣的SCCAs制备标准曲线样品（一系列适当稀释度），至少使用5个点。所采用的标准曲线浓度应在特定SCCAs的线性响应范围内，并覆盖样品中预期的SCCAs浓度范围。
	<ol>
		<li>在标准曲线溶液中加入所选的内标物，以便对样品中的内标物进行定量。内标物将用于辅助峰的鉴定以及计算提取效率（第6节）。</li>
		<li>将每种SCCA用超纯水稀释至上述确定的浓度（0.01、0.02、0.04、0.06、0.08 mg/ml；见上文2.4.2），分别置于新的微量离心管中（每种浓度/标准曲线点各一管）。每种标准曲线浓度点配制1 ml溶液。确保每个浓度点均包含全部四种酸标准品和内标物，并处于正确浓度。</li>
		<li>每次在毛细管电泳系统上运行样品时，均需为每组样品制备新的标准曲线点。标准曲线用SCCA样品在分析前应保存于4 ºC，分析将在从靶组织提取SCCA（第3节）后进行。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 有机酸提取
<ol>
	<li>预先标记样本管，为每个待提取的样本至少准备一支样本管。</li>
	<li>将待提取的样品从储存处取出，置于冰上，称取用于提取的材料。</li>
	<li>称取100 mg样品用于SCCA提取。
	<ol>
		<li>称量每个样品后，将组织转移至洁净的1.5 ml微量离心管中。尽可能量取接近目标质量的样品量，以减少变异。</li>
		<li>记录所测每个样品的质量，因为检测到的SCCAs含量将根据样品质量进行归一化处理（见下文6.5.2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>称量所有样品后，向每个样品管中加入 1 ml 提取液（步骤 2.4 中的水与内标混合液）。保持提取液与组织质量的比例在所有提取过程中一致（本实验中为每 100 ± 5 mg 组织加入 1 ml 提取液）。涡旋振荡 10 秒，充分混匀。</li>
	<li>将样品在室温下静置1小时。在此期间，每隔15分钟混匀各管，操作同步骤3.4。</li>
	<li>提取1小时后，将样品彻底混匀一次，转移样品管至微量离心机中。离心样品于 4 °C，10,000 × g 离心 10 分钟，以沉淀固体物质（细胞壁、颗粒物） 等等。).
	<ol>
		<li>处理液体样品时，加入适当浓度的内标物，短暂混匀后离心。离心后，将液体样品与固体样品的提取物同样处理。</li>
		<li>检测样品的pH值，以确认其与检测试剂盒（步骤4.6）或所用缓冲体系的pH范围相容。由于样品体积通常较小，可使用pH试纸监测pH值。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用注射器式圆盘滤器（3.8）准备过滤样品。 
	注意：转移上清液前，确保每个滤膜已正确安装至注射器，以防样品损失。每个待分析样品（包括标准曲线样品）均需准备一支装有圆盘滤膜的注射器。</li>
	<li>离心样品并准备好注射器滤器后，将每份样品的上清液转移至装有滤器的3 ml注射器中 0.2 µm 注射器滤器。每个样品均需使用新的滤器和注射器。在上样至毛细管电泳系统前，须对所有样品（包括标准曲线样品和缓冲液对照）进行过滤。</li>
	<li>将样品直接过滤至洁净的微量离心管中。过滤完成后，盖紧含有滤液的离心管，弃去注射器/滤器装置。</li>
	<li>立即将过滤后的样品放入CE系统中进行SCCA检测；或在 4 °C 过夜。如果样品需要过夜储存，需用塑料封口膜密封管口，以防止气体交换和样品蒸发。
	<ol>
		<li>若样品在过滤后需保存超过一天，应使用液氮速冻提取物，或在 -20 ºC 冷冻。解冻后，须检查每个样品是否形成沉淀，必要时重新过滤（同步骤 3.6）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 设置 SCCA 检测运行
<ol>
	<li>请参阅CE用户手册以获取与编程和控制软件相关的具体细节。</li>
	<li>准备用于检测SCCA的毛细管电泳（CE）样品瓶。确保样品瓶正确标记、清洁且无缺陷。</li>
	<li>使用前清洗并干燥CE小瓶的瓶盖。
	<ol>
		<li>将盖子浸入超纯水中，浸泡过夜。浸泡后，弃去浸泡液，并用超纯水将盖子再冲洗两次。</li>
		<li>将冲洗后的瓶盖转移至铺有无绒纸巾的洁净干燥表面，使其自然风干。使用前需确保瓶盖完全干燥，以避免压力失效。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将1 ml样品转移至每支CE小瓶中，注意避免样品意外溅入小瓶瓶口颈部。转移完成后，为每支小瓶盖上CE瓶盖。
	<ol>
		<li>若需稀释，直接使用超纯水在毛细管电泳小瓶中将咖啡种子样品按1:10或1:100比例稀释。对于超过1:100的稀释倍数，应先配制中间稀释液，以避免移液误差。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>为每个标准曲线点准备一个样品瓶，将步骤2.5中的标准曲线溶液（1.0 ml）转移至CE样品瓶中。转移后立即盖紧每个样品瓶。</li>
	<li>将0.04 g NaOH加入含有90 ml超纯水的烧杯中，溶解颗粒，配制0.1 M氢氧化钠（NaOH）溶液。将0.1 M NaOH溶液转移至100 ml容量瓶中，定容至100 ml。</li>
	<li>向一支干净的CE小瓶中加入1 ml 0.1 M NaOH溶液，盖上瓶盖。</li>
	<li>为每批要在毛细管电泳系统上运行的样品制备CE缓冲液小瓶。可使用商品化分离试剂盒，也可使用自配缓冲液13.
	<ol>
		<li>准备1个含有1 ml起始缓冲液的西林瓶并盖紧瓶盖。</li>
		<li>准备三个小瓶，每瓶加入1 ml运行缓冲液并盖紧。每批样品和标准曲线点检测前，或每检测35个样品后（以先发生者为准），需更换新的运行缓冲液。</li>
		<li>向另外三个小瓶中各加入 1 ml 超纯水，并盖紧瓶盖。</li>
		<li>准备1个带盖的空“废液”瓶。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在完成第4.8步所述小瓶的制备后，按照制造商说明，将装有缓冲液和水的小瓶以及废液小瓶（来自步骤4.8.2–5）装入毛细管电泳系统的缓冲液托盘中15仔细记录每个小瓶的位置，以便进行自动进样器编程。</li>
	<li>将含有标准曲线点的样品管和待检测样品的样品管按照制造商说明书中的描述放入进样器样品盘中。记录每个样品管的位置，用于自动进样器的程序设置（见下文步骤4.11.1）。</li>
	<li>准备条件化和样品分离方法（这些程序在以下提供） 表1 和 2，分别），并根据仪器操作说明编写样本序列文件。采用下述分离方法 表 2：用引发剂（20 psi）冲洗色谱柱 0.2 分钟；用加速剂（20 psi）冲洗 0.5 分钟；以 0.5 psi 将样品注入色谱柱 0.09 分钟；在 20 kV 条件下分离样品 12 分钟；用 NaOH（20 psi）冲洗 0.5 分钟；最后用清水（20 psi）冲洗 0.5 分钟。
	<ol>
		<li>使用CE控制软件编写样品运行程序（即， 工作列表；一个列表文件，用于详细说明样品的分析顺序以及用于分离每个样品的方法，使用“sequence”电子表格界面进行设置。电子表格中的每一行对应一次样品运行，并生成一个单独的数据文件。
		<ol>
			<li>确保在编写序列文件时，使用样品托盘中的正确位置来标识样品。确保每个数据文件具有唯一名称，以防止软件覆盖先前的文件。在包含样品分离方法的序列运行之前，将CE毛细管平衡程序设置为独立的序列运行。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>首先运行标准曲线溶液，随后运行SCCA样本，最后再次运行标准曲线溶液。这将有助于计算样本分析过程中可能发生的信号衰减程度。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="毛细管电泳表；步骤、时间、溶液、备注、30 kV、NaOH、压力设置" src="/files/ftp_upload/54611/54611table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表1"> 
Table 1: 用于通过毛细管电泳分离短链羧酸的毛细管预处理方法程序a.
<img alt="毛细管电泳流程表，详细列出样品进样的压力和电压步骤。" src="/files/ftp_upload/54611/54611table2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表2"> 
Table 2：采用毛细管电泳分析短链羧酸的分离方法程序a.
5. SCCA 检测运行执行与数据采集
<ol>
	<li>开始毛细管柱平衡运行。在色谱柱可用于样品分离前，通常需要进行两到三次平衡。色谱柱平衡操作应按照文中所述方法进行。 表1用0.1 M NaOH（20 psi）冲洗柱子1分钟，用水（20 psi）冲洗1分钟，用引发剂（20 psi）冲洗0.5分钟，用促进剂（20 psi）冲洗0.5分钟，在30 kV条件下分离促进剂10分钟，用0.1 M NaOH（20 psi）冲洗柱子0.5分钟，最后用水（20 psi）冲洗柱子0.5分钟。
	<ol>
		<li>在每次样品序列运行前对毛细管进行预处理。通过在整个运行过程中保持分离电压恒定，并观察光电二极管阵列图谱上呈现平坦的基线，以确保完成适当的预处理。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>诱导完成后，通过在软件中打开“控制”菜单并选择（即， 点击“运行序列”。监测光电二极管阵列（PDA）图谱以确保实现良好分离。
	<ol>
		<li>观察第一条色谱图，确保其基线平坦且各有机酸峰完全分离（达到基线分离）。样品过载会导致峰拖尾，出现长的峰尾，此时需要进行稀释。图1).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="色谱结果；乙酸峰检测；浓度梯度分析；图表。" src="/files/ftp_upload/54611/54611fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图 1"> 
图 1：PDA 色谱图对比，显示样品过载情况。随着分析物浓度升高，各个色谱峰的几何形状可能开始变得不对称。在（a）0.05 mg/ml 时，乙酸呈现一个定义清晰、双侧对称的峰形。当乙酸浓度升高至（b）0.07 mg/ml 和（c）0.10 mg/ml 时，出现拖尾峰（箭头所示）。这种峰拖尾现象是样品过载的良好指示。<a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54611/54611fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
<ol start="3">
	<li>测序运行结束后，在毛细管电泳分析软件中依次打开数据文件，并对峰进行积分。
	<ol>
		<li>对样品峰进行积分。
		<ol>
			<li>打开第一个文件，将自动积分步骤设置为排除运行开始的前3分钟（在此期间电压及因此的柱流方向如表1所述发生反转）。在同一菜单中，将峰选择标准设置为最小峰宽50单位、峰面积100单位（或采用制造商的默认设置），以提供适度较高的选择性，从而在图谱中将酸峰与背景噪声区分开。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>手动检查每个PDA图谱的峰边界和基线，以确保峰积分正确。积分不当的峰（例如，自动软件将略微不对称的SSCA峰识别为两个独立峰）需手动重新积分。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>积分完成后，查看峰面积百分比报告，然后选中并复制该报告，粘贴至单独的电子表格中。对每个样品重复此操作，以构建完整的运行峰报告，其中每一行代表一个单独的峰（即，若分离效果良好，每个峰应仅包含一种化合物）。</li>
</ol>
6. 数据分析
<ol>
	<li>使用在（5.4）中构建的电子表格准备数据分析。开始分析时，标注每条标准曲线点的酸标准品，包括内标。</li>
	<li>通过将样品中每个峰的保留时间除以该样品中内标物的保留时间，计算每个峰的保留指数。根据所得保留指数对数据集进行排序，以确定各样品中目标峰。</li>
	<li>在确定每种目标酸的峰后，使用外标法标准曲线点为每种酸绘制标准曲线。
	<ol>
		<li>通过测定每个SCCA标准品不同浓度的峰面积，绘制横轴为浓度、纵轴为峰面积的标准（浓度）曲线。对每条SCCA标准曲线绘制线性回归，并确定斜率方程（y = mx + b）。</li>
		<li>确保 R2 线性回归的值为0.90或更高，因为定量分析在标准曲线的线性范围内进行时最为准确。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用标准曲线线性回归方程的斜率（如上文6.3.2中计算所得）和峰面积，计算样品中特定短链脂肪酸（SCCA）的酸浓度。简而言之，将该酸的实测峰面积除以其标准曲线回归方程的斜率。
	<ol>
		<li>使用内标物（步骤6.5）校正步骤6.4中计算的原始浓度值，以补偿样品处理过程中的损失。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用内标法计算每个样品的校正因子。
	<ol>
		<li>内标的实际浓度除以即， 实验开始时加入的已知量）除以样品中内标物的实测值（即， 根据内标标准曲线斜率方程计算所得的量）乘以该校正因子，对样品中每种SCCA的原始浓度值进行校正。</li>
		<li>将内标校正后的SCCA浓度除以用于提取的样品质量，以校正样品质量的任何差异。该计算得到单位质量样品中分析物的含量（本示例中为每毫克研磨咖啡中的毫克SCCA），随后可转换为特定研究所需的适当单位（mg/mg、mg/g、g/g） 等等。).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在计算SCCA浓度（根据样品质量［适用于固体或液体样品］或体积［仅适用于液体样品］进行归一化）后，根据实验设计和研究问题的需求，将这些数值用于统计分析。</li>
</ol>

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</ol>

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

与任何分析技术一样，有多个关键因素会显著影响所生成数据的质量和可靠性。首先，应高效地处理样品，并尽量减少冻融循环次数。反复冻融可能在样品处理或分析前就破坏其化学组成。其次，必须一致且均匀地将本实验方案的各个步骤应用于所有样品。由于样品制备和操作不一致所导致的技术误差，可能显著影响数据质量，并导致结果的变异性增加 &#34;噪声&#34; 在SCCA检测中，样品研磨后的粒径将影响SCCA提取的速度和效率。因此，确保样品被研磨至均一的粒径至关重要，这有助于维持各样品间提取效率的一致性，并降低样品间的变异性。同样，在标准溶液配制过程中的准确称量与移液、样品质量的精确测量，以及对提取时间的仔细监控（和归一化）将有助于生成更为均一的数据。花时间仔细对上述各项参数进行归一化、测量和记录，可确保数据的可靠性，并允许在运行后对可能出现的处理误差进行准确校正。第三，选择并使用合适的内标物至关重要。最终分析物浓度的计算高度依赖于各样品中内标物峰面积的准确校正。因此，内标物的测量必须准确且精确；理想情况下，内标物不应天然存在于样品中，也不应与其他化合物共洗脱。正确选择并在所有样品中使用内标物，不仅可使研究者有效控制因提取效率差异所导致的代谢物水平变化，还能显...

羧酸是一类含有一个或多个末端羧基官能团的有机化合物，每个羧基连接在一个含有一个或多个碳原子的R基团上（R-C[O]OH）。含有1至6个碳原子的短链、低分子量羧酸（短链羧酸，SCCA）是细胞呼吸的重要组成部分，在细胞生长和发育所必需的多种生化途径中发挥功能。SCCA在细胞代谢1、细胞信号传导2以及生物体对环境的响应（如抗生作用3）中起着关键作用。因此，SCCA可作为细胞代谢紊乱、植物胁迫响应4,5和果实品质6,7的有用指示物。迄今为止，SCCA的定量主要依赖色谱技术，如高效液相色谱（HPLC）或气相色谱-质谱联用（GC-MS）。尽管这些方法能够实现极低的检测限，但其成本较高，通常需要使用腐蚀性或有毒试剂对目标SCCA进行衍生化处理，并且在GC或HPLC上进行耗时较长的分离过程。正因如此，近年来人们对采用自由区带毛细管电泳（CZE）技术定量有机酸的兴趣持续增加，该方法无需样品衍生化步骤8。
自由区带毛细管电泳（CZE）是一种色谱分离方法，由于其理论塔板数高、分析速度快且操作相对简便，正逐渐取代气相色谱-质谱联用（GC-MS）和高压液相色谱，成为阴离子、阳离子、氨基酸、碳水化合物以及短链羧酸（SCCAs）定量分析（特别是用于质量控制）的常用分析手段8,9,10。基于CZE的小分子分离（包括SCCAs）主要依据两个原理：一是带电离子在充满毛细管的缓冲液中所施加电场作用下的电泳迁移；二是整个缓冲体系在电渗作用下从毛细管一端向另一端的整体移动，通常朝向负极。在此系统中，小分子以不同的速度向负极移动，其迁移速度由分子净电荷与分子质量之比决定。由于每个分子在此系统中的迁移行为取决于其电荷状态以及整体电渗流速率（后者又受毛细管填充缓冲液中离子成分的影响），缓冲液的pH值和离子组成对CZE分离效率具有显著影响。正因如此，具有较高电荷-质量比的SCCAs成为CZE分离的理想目标。通过CZE分离的代谢物可采用多种方法进行检测，包括紫外吸收（UV absorbance）、光谱吸收（通常使用光电二极管阵列[PDA]检测）和/或质谱分析（CE-MS或CE-MS/MS）8。CZE所提供的多样化分离与检测方法使其成为一种极为灵活且适应性强的技术。因此，CZE在食品安全与质量11,12、药物研究13以及环境监测13,14等领域正日益被用作标准分析方法。
毛细管电泳已用于检测和定量短链羧酸近二十年13。毛细管区带电泳（CZE）具有高分辨能力（特别是对小分子带电物质）、运行时间短以及单个样品成本低等优点，使其成为分离和定量短链羧酸（SCCA）的理想技术13。本方法提供了一项利用毛细管区带电泳测定植物组织中有机酸浓度的实验方案。示例数据通过成功应用该方案测定咖啡种子在二次发酵处理后有机酸水平的变化而获得。该方案详细说明了基于毛细管区带电泳分离短链羧酸的关键步骤和常见错误，并讨论了如何将该方案成功应用于其他植物组织中短链羧酸的定量分析。

<table><tbody><tr><td>陶瓷研钵和研杵</td><td>Coorstek</td><td>60310</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter P/ACE MDQ 毛细管电泳系统</td><td>Beckman Coulter</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>玻璃样品瓶</td><td>Fisher Inc.</td><td>033917D</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml 微量离心管&amp;nbsp;</td><td>Fisher Inc.</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td>LC/MS 级水</td><td>Fisher Inc.</td><td>W6-1</td><td>Milli-Q 水（18.2&amp;nbsp;M&amp;Omega;&amp;#183;cm）也可接受</td></tr><tr><td>15 ml 玻璃管 / 聚四氟乙烯衬垫盖&amp;nbsp;</td><td>Fisher Inc.</td><td>14-93331A</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M 封口膜</td><td>Fisher Inc.</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>CElixirOA 检测试剂盒 pH 5.4&amp;nbsp;</td><td>MicroSolv</td><td>06100-5.4</td><td></td></tr><tr><td>BD Safety-Lok 安全型注射器</td><td>Fisher Inc.</td><td>14-829-32</td><td></td></tr><tr><td>17 mm Target 注射器滤器，PTFE 材质</td><td>Fisher Inc.</td><td>3377154</td><td></td></tr><tr><td>32 Karat，V. 8.0 控制软件</td><td>Beckman Coulter</td><td>285512</td><td></td></tr><tr><td>毛细管电泳（CE）样品瓶&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>144980</td><td></td></tr><tr><td>CE 样品瓶盖&amp;nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>144648</td><td></td></tr><tr><td>液氮</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>液氮可从大多数设施服务部门获得</td></tr></tbody></table>

利用毛细管电泳定量植物组织中的有机酸：以coffea arabica种子为例的研究

Using Capillary Electrophoresis to Quantify Organic Acids from Plant Tissue: A Test Case Examining Coffea arabica Seeds

羧酸是一类含有一个或多个末端羧基（COOH）官能团的有机酸。短链羧酸（SCCAs；含三至六个碳原子的羧酸），如苹果酸和柠檬酸，在许多生物系统的正常功能中起着关键作用，参与细胞呼吸过程，并可作为细胞健康状况的指标。在食品中，有机酸含量对风味具有显著影响，SCCA水平升高会导致酸味或&#34;酸性&#34;口感。因此，快速分析有机酸含量的方法在食品和饮料工业中备受关注。然而，目前大多数用于SCCA定量的方法依赖于耗时的实验流程，需要使用有害试剂对样品进行衍生化处理，随后进行昂贵的色谱和/或质谱分析。本文介绍了一种替代方法，用于从植物材料和食品样品中检测和定量有机酸，该方法基于自由区带毛细管电泳（CZE），有时简称为毛细管电泳（CE）。CZE是一种成本较低且检测限低（0.005 mg/mL）的SCCA测定方法。本文详细描述了从植物样品中提取和定量SCCA的操作步骤。尽管本方法以咖啡豆中的SCCA测定为重点，但也可适用于多种植物性食品材料。

本方案已成功用于测定种子处理对绿色咖啡种子中SCCA含量的影响。本实验设置了六种处理：在培养基中含Leuconostoc pseudomesenteroides菌株GCP674的饱和微生物悬液（1）、将GCP674微生物悬浮于水中形成的水悬液（2）、含乙酸和乳酸的水溶液（浓度分别为0.15和0.4 mg/mL）（3）、使用过的M1培养基处理（4）、去离子水（dH2O）处理（5）以及未处理对照组（种子中不添加任何物质）（6）。对种子进行处理后，使其发酵24小时。每种处理设置四个独立重复。采用己二酸作为内标，测定柠檬酸（C）、苹果酸（M）、乙酸（A）和乳酸（L）的含量。
针对每种短链羧酸（SCCA）和内标物，均建立了标准曲线，浓度范围覆盖预计咖啡样品中的浓度（5、10、20、40、60 和 80 ng/µl）。如预期所示，每种酸在此浓度范围内均呈现线性响应，柠檬酸、苹果酸、乙酸和乳酸的决定系数（R²）分别为 0.98...

本文介绍了一种利用自由区带毛细管电泳法检测和定量植物材料中有机酸的方法。文中提供了一个该方法潜在应用的示例，即测定二次发酵对咖啡种子中有机酸含量的影响。

利用毛细管电泳定量植物组织中的有机酸：以Coffea arabica种子为例的研究

羧酸是一类含有一个或多个末端羧基（COOH）官能团的有机酸。短链羧酸（SCCAs；羧酸……）

本实验的主要目标是定量测定植物组织中有机酸的含量。该方法可用于解答植物生物化学与生理学领域的诸多问题，例如环境刺激对根系生长、作物发育以及食品或饮料品质的影响。该方法的主要优势在于样品前处理步骤简单、通量高，且毛细管电泳的成本低于质谱分析。尽管该方法用于阐明植物生理响应，但也可应用于食品科学与食品质量领域，因为有机酸对食品的风味、安全性和稳定性具有关键影响。首先，准备用于短链羧酸（SCCA）提取的样品。每次处理一克咖啡种子，以确保加工后仍有足够的样品留存。为了获得均匀的颗粒大小以实现最大的SCCA提取效率，首先用液氮预冷研钵和研杵。将样品加入研钵中少量的液氮内。使用勺子向研钵中加入足量的液氮，以完全浸没样品。将难以研磨的样品（如生咖啡种子）加入液氮中，冷冻10至30秒后再进行研磨。使用垂直碾压动作将组织破碎成较小的碎片。然后，使用环形研磨动作彻底研磨组织。重复冷冻和研磨步骤两次，使样品总共研磨三次。通常，连续三次研磨可将样品研磨成质地类似面粉的粉末。将粉末转移至玻璃小瓶或1.5 ml微量离心管中。研磨后立即进行后续处理，或在样品准备提取前于-80摄氏度保存。配制目标SCCA的纯品标准品，用于制备外标和内标溶液，以测定SCCA浓度。对于咖啡样品，应包含柠檬酸、苹果酸、乙酸和乳酸作为目标酸类，并以己二酸作为内标物。通过将100毫克标准品加入10毫升容量瓶中，配制10毫克/毫升的储备溶液。用超纯水定容至10毫升刻度线，以溶解酸类物质。将每种储备液转移至洁净的15毫升玻璃试管中，试管需配有聚四氟乙烯衬垫的瓶盖，并用塑料石蜡膜密封。储备液可在密封的试管中于4摄氏度保存一周。通过将内标储备液用超纯水稀释至0.05毫克/毫升，配制50毫升SCCA提取溶液。通过将250微升内标储备液加入49.75毫升水中来配制。接下来，为感兴趣的短链脂肪酸（SCCA）制备标准曲线样品。标准曲线至少应包含五个浓度点，其浓度范围应覆盖样品中预期的SCCA浓度，并处于线性响应范围内。使用超纯水将每种 SCCA 在新的微量离心管中稀释至确定的浓度，总体积为一毫升。确保每个浓度点均包含所有四种酸标准品和正确浓度的内标物。从储存处取出待提取的样品，并将其置于冰上。称取100毫克样品用于SCCA提取。测量样品时应尽可能接近目标质量，以减少变异。称量每份样品后，将组织转移至洁净的1.5毫升微量离心管中。记录所测定每个样品的质量，因为检测到的SCCAs含量将根据样品质量进行归一化处理。称量完所有样品后，向每个样品管中加入1毫升提取液。在所有提取过程中，保持提取液与组织质量的比例一致。涡旋振荡10秒，充分混匀。将样品在室温下静置1小时。在此期间，每隔15分钟涡旋振荡每个试管10秒以混匀。提取一小时后，将样品彻底混匀一次，并将样品管转移至微量离心机中。在4°C条件下以10,000 × g离心10分钟，使固体物质沉淀。为过滤样品，准备安装在注射器上的圆盘滤膜，确保每个滤膜正确连接至注射器。为每个待分析样品（包括标准曲线样品）准备一个装有圆盘滤膜的注射器。将上清液直接过滤至洁净的微量离心管中。过滤完成后，盖紧含有滤液的离心管，并丢弃注射器滤膜装置。取一毫升样品转移至每个毛细管电泳（CE）小瓶中，注意避免将样品溅入小瓶瓶颈处。样品转移完成后，为每个小瓶盖上CE瓶盖。按照文本方案中的描述设置SCCA检测运行程序。按照制造商说明书，将含有标准曲线点的样品瓶和待检测样品的样品瓶放入进样样品盘中。记录每个样品瓶的位置，用于自动进样器程序设置。按照文本方案中的描述完成平衡后，在软件中打开控制菜单，选择运行序列，开始样品分离。监测光电二极管阵列（PDA）托盘，以确保实现良好的分离效果。观察第一条色谱峰，确保其基线平坦，并能清晰分辨出各个有机酸峰。为积分样品峰，打开第一个文件，并设置自动积分参数，排除运行前3分钟的数据。在同一菜单中，将峰选择标准设置为最小峰宽50单位，峰面积100单位，以提供适度较高的选择性，从而在色谱图中将酸峰与背景噪声区分开。按照文本方案中所述进行数据分析。此处显示的是PDA色谱图的比较，突出显示了过载样品的情况。随着分析物浓度的增加，各个峰的几何形状可能开始变得不对称。在0.05毫克/毫升时，乙酸呈现一个定义清晰的双侧对称峰。当乙酸浓度增加至0.07或0.10毫克/毫升时，峰形变得不对称，并形成拖尾峰。这种峰拖尾现象表明样品过载，是一个很好的指示。此处显示的是绿原酸在未烘焙咖啡样品中的PDA谱图示例。未烘焙咖啡样品在装入毛细管电泳小瓶前经1:10稀释。感兴趣的酸类包括乙酸、柠檬酸、乳酸、苹果酸以及内标物己二酸。在进行该实验操作时，需注意将样品研磨至均匀一致，并小心移液，以最大限度提高实验的可重复性并减少实验误差。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用毛细管电泳（CE）对植物样品中的有机酸进行定量分析，并能够完成植物样品的研磨、有机酸的提取，以及为后续CE分析制备植物提取物。

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利用毛细管电泳从植物组织量化有机酸：一个测试用例检查<em&gt;小粒种咖啡</em&gt;种子

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利用毛细管电泳定量植物组织中的有机酸：以Coffea arabica种子为例的研究

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