定义脂肪酶和磷脂酶候选物的底物特异性

本实验的总体目标是加速鉴定潜在脂肪酶和磷脂酶的生理底物。该方法有助于回答昆虫学领域的关键问题，例如磷脂酶如何参与生物膜中脂质的重塑过程。该技术的主要优势在于，酶活性的优化与酶的天然底物筛选可独立进行。

尽管该方法可用于研究细菌脂肪酶和磷脂酶的底物特异性，但也可经修改用于研究其他任何模式生物的水解酶。我们最初产生该方法的想法，是在寻找能够降解根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）内在膜脂磷脂酰胆碱的酶活性时。制备无细胞蛋白提取物时，需将细菌细胞悬液解冻并置于冰上保存。

然后，将细胞悬液在20,000 psi（磅每平方英寸）压力下，通过预冷的压力破碎室反复处理三次。在4°C条件下，以5,000 × g离心30分钟，去除完整细胞和细胞碎片。离心后，从上清液中分装100和500微升的等份样品，用于后续分析。

根据文本方案中列出的移液方案，建立先前已优化的酶活性检测体系。为初步覆盖不同的酶活性，可使用水解后产生有色产物的人工底物，例如对硝基苯酚（para-nitrophenol）或 PNP 衍生物。在分光光度计中，于 30 摄氏度条件下孵育 5 分钟，监测 405 纳米波长处吸光度随时间上升的情况，以反映 PNP 的生成。

最后，按照文本方案中所述进行计算。对于脂质的放射性标记，取目标生物体在5毫升所需培养基中制备过夜预培养物，并在30摄氏度下培养。从预培养物中接种至100毫米培养皿中的20毫升新鲜培养基中，使培养物在620纳米处的初始光密度达到0.3。

接下来，在无菌条件下，将1毫升培养物转移至一个14毫升无菌聚苯乙烯圆底试管中。向1毫升培养物中加入1微居里的114 c乙酸盐。然后，在30摄氏度下振荡培养液体培养物24小时。

孵育结束后，将培养物转移至1.5毫升微量离心管中，在室温下以12,000 × g离心5分钟。将沉淀重悬于100微升水中。此时，可将细胞悬液于-20摄氏度保存，或立即进行极性脂质的提取。

为了提取极性脂质，向100微升水相细胞悬液中加入375微升甲醇与氯仿体积比为2:1的溶液。涡旋混合样品30秒，然后在室温下孵育5分钟。孵育结束后，在室温下以12,000 × g离心5分钟。

然后，将上清液转移至一个新的1.5毫升微量离心管中。接着，向上清液中加入125微升氯仿和125微升水。涡旋振荡30秒后，在室温下以12,000 × g离心1分钟。

将下层氯仿相转移至新的离心管中。然后用氮气流干燥溶液。将干燥后的脂质溶解于100 µL氯仿-甲醇溶液中。

为通过薄层色谱分离中性极性脂质，取3微升脂质样品溶液，点样于高效薄层色谱硅胶铝板上，起始位置距板边缘2厘米处。若在单向色谱中分析多个样品，不同样品点样点之间应保持至少1.5厘米的距离。将流动相转移至薄层色谱展开槽中，槽内壁衬有层析滤纸。

用玻璃板盖住，使层析缸平衡30分钟。将带有干燥脂质样品的HPTLC硅胶铝板转移至层析缸中。在密闭层析缸中展开30分钟，然后取出板。

然后，将溶剂在通风橱中干燥两小时。待展开的薄层色谱板干燥后，将其与光激发发光屏置于密闭暗盒中孵育三天。随后，将孵育后的发光屏放入PSL扫描仪中曝光，获取分离的放射性标记脂质的虚拟图像。

为了测定二酰甘油（DAG）脂肪酶活性，首先将 5,000 CPM 的 14C 标记 DAG 加入一个 1.5 毫升的微量离心管中。同时，向管中加入 Triton X-100 溶液，并通过涡旋混合。在氮气流下将溶液干燥。

在最终体积为100微升的反应体系中，加入Tris-HCl缓冲液、氯化钠溶液和重蒸水。涡旋混匀5秒。向溶液中加入5微升酶以启动反应。

将溶液在 30 摄氏度下孵育 4 小时。加入 250 微升甲醇和 125 微升氯仿以终止反应，随后按照本视频前面所述方法提取脂质。接着通过一维薄层色谱（1DTLC）分析中性极性脂质，并如前所述进行后续的 PSL 成像分析。

尽管预测的磷脂酶SMc01003对人工合成的对硝基苯酚酰基酯具有活性，但其活性仅为空白对照（即未表达任何外源基因的大肠杆菌无细胞提取物）背景活性的两到三倍。这表明对硝基苯酚酰基酯似乎并非SMc01003的良好底物。然而，大肠杆菌的无细胞提取物无法降解二酰甘油，而表达预测磷脂酶SMc01003的菌株提取物则能够引起二酰甘油的降解。

尽管SMc01003被预测为一种磷脂酶，但实际上它是一种二酰基甘油脂肪酶，可将二酰基甘油降解为单酰基甘油和一个脂肪酸。随后，它进一步将单酰基甘油降解为甘油和另一个脂肪酸。一旦掌握，若操作得当，该技术可在数周内完成。

观看本视频后，您应能够充分理解如何优化脂肪酶和磷脂酶的酶活性，以及如何进一步寻找它们的生理底物。该方法的一个关键优势在于，酶活性的优化可与天然酶底物的搜寻过程相互分离。请务必注意，使用有机溶剂或放射性物质可能具有极高危险性，在执行本实验步骤时，必须始终采取必要的安全防护措施。