定义底物特异性的脂肪酶和磷脂酶考生
2016年11月23日
许多预测的（磷酸化）脂肪酶在其底物特异性和生理功能方面的表征不佳。在这里，我们提供了一个方案来优化酶活性，寻找天然底物，并提出这些酶的生理功能。
该程序的总体目标是加速潜在脂肪酶和磷脂酶的生理底物的检测。这种方法可以帮助回答昆虫学领域的关键问题，例如磷脂酶如何促进生物膜中的脂质重塑。该技术的主要优点是可以独立进行酶活性的优化和寻找酶的天然底物。
虽然这种方法可以深入了解细菌脂肪酶和磷脂酶的底物特异性，但它也可以被修改以研究任何其他模式生物的水解酶。当我们寻找一种可以降解内在膜脂质磷脂酰胆碱 inorhizobium meliloti 的酶活性时，我们首先想到了这种方法。要制备无细胞蛋白提取物，请将细菌细胞悬液解冻并储存在冰上。
然后，以每平方英寸 20， 000 磅的重量将细胞悬液通过冷压力池 3 次。在 4 摄氏度下以 5， 000 倍 g 离心 30 分钟，去除接触良好的细胞和细胞碎片。离心后，从上清液中制备 100 和 500 μL 的等分试样，用于后续分析。
使用文本方案中表格中列示的移液方案设置先前优化的酶测定。为了初步覆盖不同的酶活性，请使用在水解时产生有色产物的人工底物，例如对硝基苯酚或 PNP 衍生物。遵循 405 纳米吸光度增加的时间过程，这是由于分光光度计在 30 摄氏度内在 5 分钟内形成 PNP。
最后，按照文本协议中的说明执行计算。对于脂质的放射性标记，在 5 毫升所需培养基中制备目标生物体的过夜预培养物，并在 30 摄氏度下生长。从预培养物中，接种到 100 毫米培养瓶中的 20 毫米新鲜培养基中，以获得 620 纳米处 0.3 的初始光密度用于培养。
接下来，在无菌条件下将 1 毫升等分试样的培养物转移到 14 毫升无菌聚苯乙烯圆底管中。向 1 毫升培养物中加入 1 微居里 114 c 乙酸盐。然后，在 30 摄氏度的搅拌下孵育液体培养物 24 小时。
孵育期结束时，将培养物转移至 1.5 mL 微量离心管中，并在室温下以 12， 000 x g 离心 5 分钟。将沉淀重悬于 100 微升水中。此时，将细胞悬液储存在零下 20 摄氏度或立即继续提取极性脂质。
为了提取极性脂质，将 375 微升二比一甲醇加入氯仿溶液中，加入 100 微升细胞水悬浮液中。涡旋样品 30 秒，然后在室温下孵育 5 分钟。孵育后，在室温下以 12， 000 倍 g 离心 5 分钟。
然后，将上清液转移到新的 1.5 mL 微量离心管中。接下来，向上清液中加入 125 微升氯仿和 125 微升水。涡旋 30 秒后，在室温下以 12， 000 倍 g 离心样品 1 分钟。
将下层氯仿相转移到新管中。然后，用氮气流干燥溶液。将干燥的脂质溶解在 100 微升氯仿中，溶于甲醇溶液中。
为了通过薄层色谱分离中性极性脂质，将三微升脂质样品等分试样涂在高效薄层色谱硅胶铝板上，从板边缘开始 2 厘米。如果在一维色谱中分析多个样品，则不同样品应用点之间应保持至少 1.5 厘米的距离。将流动相转移到 TLC 显影室中，内部涂有色谱纸。
盖上玻璃板，让腔室饱和 30 分钟。将 HPTLC 硅胶铝片与干燥的脂质样品转移到腔室中。在取出板之前，让板在密闭腔室中显影 30 分钟。
然后，让溶剂在流动罩中干燥 2 小时。一旦显影的 TLC 片材干燥，将其与可调光发光屏幕在密闭盒中孵育三天。然后，将孵育的屏幕暴露于 PSL 扫描仪并获取分离的放射性标记脂质的虚拟图像。
为了测定甘油二酯或 DAG 脂肪酶活性，首先将 5， 000 CPM 的 14 C 标记的 DAG 添加到 1.5 毫升微量离心管中。此外，将 Triton X-100 溶液加入试管中并通过涡旋混合。在氮气流下干燥溶液。
对于最终的 100 μL 测定，添加 Tris-HCl 缓冲液、氯化钠溶液和双蒸水。涡旋 5 秒钟。通过向溶液中加入 5 μL 酶来引发反应。
将溶液在 30 摄氏度下孵育 4 小时。在提取脂质之前，通过添加 250 μL 甲醇和 125 μL 氯仿来终止反应，如本视频前面所述。继续通过 1DTLC 分析中性极性脂质，然后像以前一样进行 PSL 成像。
尽管预测的磷脂酶 SMc01003 显示出与人工对硝基苯酚酰酯的活性，但其活性仅为大肠杆菌无细胞提取物中背景活性的两倍或三倍，其中未表达外源基因。这表明对硝基苯酰酯似乎不是 SMc01003 的良好底物。虽然大肠杆菌的无细胞提取物不能降解甘油二酯，但表达预测的磷脂酶 SMc01003 的菌株的提取物会导致甘油二酯降解。
虽然 SMc01003 被预测为磷脂酶，但它实际上是一种甘油二酰基脂肪酶，可将甘油二酯降解为单酰基甘油和一种脂肪酸。然后它将单酰基甘油进一步降解为甘油和另一种脂肪酸。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在几周内完成。
看完这个视频后，你应该对如何优化脂肪酶和磷脂酶的酶活性，以及如何继续寻找它们的生理底物有了很好的了解。该程序的一个关键优点是可以将酶活性的优化与寻找天然酶底物分开。不要忘记，使用有机溶剂或放射性物质可能非常危险，因此在执行此程序时应始终采取必要的预防措施。
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概述
本文介绍了一种旨在优化脂肪酶和磷脂酶活性并识别其天然底物的协议。该方法旨在增强对这些酶在生物系统中生理作用的理解。
关键研究组成部分
科学领域
- 生物化学
- 酶学
- 昆虫学
背景
- 许多脂肪酶和磷脂酶尚未被充分描述。
- 了解它们的底物特异性对阐明其功能至关重要。
- 该研究侧重于生物膜中的脂质重塑。
- 该方法可以适用于各种模式生物。
研究目的
- 加速检测脂肪酶和磷脂酶的生理底物。
- 提供对这些酶在脂质代谢中的作用的见解。
- 开发一种允许独立优化酶活性的方法。
使用的方法
- 从细菌悬液中制备无细胞蛋白提取物。
- 酶活性的优化。
- 寻找酶的天然底物。
- 应用该方法研究不同生物体中的水解酶。
主要结果
- 该方法成功地识别了脂肪酶的天然底物。
- 它提供了对细菌酶底物特异性的见解。
- 该技术可以修改用于各种水解酶。
- 在理解脂质重塑过程中的潜在应用。
结论
- 该协议增强了对脂肪酶和磷脂酶功能的理解。
- 它为研究酶活性提供了一种多功能的方法。
- 研究结果可以为更广泛的脂质生物学研究做出贡献。
常见问题
Executive Industry Relevance
Defining substrate specificities for lipase and phospholipase candidates is critical for de-risking early discovery and clarifying enzyme function in lipid metabolism. This workflow enables biopharma teams to experimentally validate predicted enzyme activities, supporting target confidence and mechanistic understanding. The approach accelerates the transition from computational prediction to actionable biochemical data, informing portfolio triage and downstream assay development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables experimental confirmation of predicted lipase and phospholipase activities.
- Clarifies substrate specificity, reducing ambiguity in target function assignments.
- Supports mechanistic de-risking by linking enzyme activity to physiological roles.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of lipid remodeling pathways.
Screening & Assay Development
- Provides standardized protocols for optimizing enzyme assays with artificial and natural substrates.
- Delivers reproducible, quantitative readouts using chromogenic and radiolabeled substrates.
- Prepares validated enzyme systems for downstream compound screening or inhibitor profiling.
- Enables scalability and platform reuse across hydrolase families and model organisms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns enzyme substrate specificity with physiological lipid remodeling processes.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of enzyme function.
- Informs risk-adjusted advancement decisions for enzyme-targeted programs.
- Provides mechanistic insights relevant to disease-relevant lipid pathways when applicable.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges computational enzyme prediction and experimental validation, supporting workflows from early discovery through lead identification and preclinical research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by defining enzyme-substrate relationships.
- Screening: Establishes assay readiness and reproducibility for evaluating enzyme activity under varied conditions.
- Analytics: Delivers quantitative measurements of substrate turnover and product formation for comparative analysis.
- Translational Research: Connects enzyme activity to physiological lipid remodeling, supporting biomarker alignment when relevant.
- Enterprise Reuse: Offers a modular protocol adaptable to diverse hydrolase targets and biological systems.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in enzyme function and target validation.
- Operational Value: Standardizes assay optimization and substrate screening for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of enzyme targets for advancement.
Implementation Considerations
- Requires expertise in enzymology, lipid biochemistry, and analytical chromatography.
- Needs access to spectrophotometry, radiolabeling, and thin-layer chromatography infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay conditions and data interpretation.
- Adaptable to various model organisms and hydrolase classes with protocol modifications.
- Involves safety considerations for handling organic solvents and radioactive materials.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:02
Use Artificial Substrates for Optimizing Enzyme Activities of (Phospho)lipases
2:20
In Vivo Identification of the Physiological Substrate of a Lipase
5:48
In Vitro Identification of the Physiological Substrate of Diacylglycerol (DAG) Lipase
7:00
Results: Predicted Phospholipase SMc01003 Acts on Artificial p-Nitrophenyl Acyl Ester and DAG
8:01
Conclusion
