Name: 活性有机碳评估土壤中连续熏蒸孵化程序 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: 了解连续熏蒸孵化程序评估土壤中活性有机碳和碳周转率的方法。该技术操作简单、成本低廉，可为土壤微生物学和养分循环研究提供可靠数据。

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作者们衷心感谢 Michelle Gonzales、Kenny Kidd、Brad Osbon 以及所有参与这些数据实验室操作的其他工作人员。作者们感谢 Andrew Scott 在开发用于模型拟合程序的软件代码方面提供的帮助。作者们还感谢美国农业部国家食品与农业研究所、可持续农业研究与教育项目、阳光资助计划南中部地区以及国家空气与水体改善委员会提供的资助，这些资助使得本文所展示的代表性结果的研究得以开展。

1. 采集土壤以获取能代表实验区域内及实验单元内条件的样品20
<ol>
	<li>识别样地属性的任何差异，例如坡度和土壤属性（包括质地、容重、pH、有机层深度和/或养分浓度）。识别样方内植被类型的任何差异。利用已知或已发表的样地属性变异系数估算值，估计达到预设相对误差所需的样本数量。</li>
	<li>根据样地和实验单元条件，使用土钻或其他采样设备按特定模式采集土壤样品。
	<ol>
		<li>对于均质条件，在每个实验单元内采用随机采样模式。
		<ol>
			<li>将采样点分配在实验单元内的完全随机位置，或采用之字形模式分布。</li>
			<li>在每个随机点或之字形分布的点位采集土壤样品。使用土钻或其他采样设备挖掘土壤样品前，先将矿质土壤表面的有机质刷开。 
			注：SFI 方法的建立基于 Oa 层及更深层土壤剖面13。若需使用 SFI 方法检测 Oa 层以上的土层，尚需进一步测试验证。</li>
			<li>将同一实验单元内采集的所有样品合并至一个容器中，并在容器内对各单个样品进行物理混合，为每个实验单元制备一个混合样品。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>对于更为常见的异质性条件，在每个实验单元内采用系统采样模式。
		<ol>
			<li>沿每个实验单元中心的样线采集土壤样品，使样线内各采样点之间的距离小于表征实验单元内部变异所需的间距。</li>
			<li>在每个实验单元内沿多条样线采集土壤样品，对于相对较大的实验单元或具有多个变异来源的实验单元，样线应形成网格状分布。</li>
			<li>将每条样线上采集的所有样品合并至一个容器中，并在容器内对各单个样品进行物理混合，为每条样线制备一个混合样品。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 为SFI测定法准备土壤
<ol>
	<li>在野外采集样品后，立即将样品放入装有冰袋的冷藏箱中。</li>
	<li>到达样品储存设施后，将样品置于4 °C冰箱中，直至进行样品制备和SFI实验操作。</li>
	<li>将土壤样品通过6.4 mm × 6.4 mm孔径的筛网过筛。每次处理完一个样品后，用水清洗筛网，以防止样品间交叉污染。</li>
	<li>对每个样品称取三个100 g的子样品，分别放入250 ml烧杯中。用Parafilm封口膜覆盖每个烧杯，并在25 °C室温下静置10天。</li>
</ol>
3. 取样品用于烘干重量测定
<ol>
	<li>在土壤样品预培养10天结束后，移除每个样品上的封口膜。</li>
	<li>记录一个铝制称量舟的重量。从所有样品中各取1 g土壤，放入称量舟中。</li>
	<li>记录湿土壤与称量舟的总重量。</li>
	<li>将装有土壤的称量舟置于105 °C的烘箱中。待样品达到恒重（通常需48小时）后，记录称量舟与土壤的重量。</li>
	<li>从湿土壤和干土壤与称量舟的总重量中减去称量舟的重量，得到湿土壤和干土壤的重量。通过将干土壤重量除以湿土壤重量，计算干重与湿重的土壤比值。</li>
</ol>
4. 熏蒸土壤样品
<ol>
	<li>在至少两个（根据样品数量可能需要更多）10.5 L 的玻璃真空干燥器底部放置湿润的纸巾，干燥器内需配有瓷板。</li>
	<li>对所有样品，将 30 g 土壤分别称量至三个独立的玻璃小瓶中。使用足够容纳 40 g 土壤且口径足够窄（可放入 40 mm 开口）的小瓶，若采用第 5 节所述的培养容器设计，则需满足此要求。</li>
	<li>若使用标签纸标识每个 30 g 土壤亚样品，请使用铅笔书写，因为熏蒸会降解墨水。</li>
	<li>将每份土壤样品的三个 30 g 亚样品中的两个放入真空干燥器中进行熏蒸，另一个亚样品放入不进行熏蒸的真空干燥器中。</li>
	<li>在 100 ml 烧杯中加入一层沸石，其量足以覆盖烧杯底部。</li>
	<li>向装有沸石层的 100 ml 烧杯中倒入 50 ml 无乙醇氯仿（CHCl3）。将装有沸石和 CHCl3 的 100 ml 烧杯置于装有 30 g 土壤亚样品的干燥器中央。此步骤应在通风橱中进行。</li>
	<li>在通风橱中，使用真空泵使 CHCl3 沸腾，以对每份土壤样品的两组亚样品进行熏蒸。
	<ol>
		<li>通过真空管路将真空泵连接至真空干燥器。启动真空泵，观察 CHCl3 开始沸腾。</li>
		<li>让 CHCl3 沸腾 30 秒，然后断开干燥器上的真空管路，使空气重新进入干燥器。此步骤有助于 CHCl3 气体进入土壤样品。重复该过程两次。</li>
		<li>进行第四次也是最后一次沸腾，使 CHCl3 持续沸腾 2 分钟。</li>
		<li>在真空仍运行的情况下，关闭真空干燥器的密封盖，以维持干燥器内的真空状态。关闭真空泵，并将真空管路从干燥器上断开。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>通过盖上盖子并密封真空塞，将未熏蒸样品所在的干燥器密封。将熏蒸和未熏蒸的干燥器置于黑暗环境（如柜子内）中静置 24 小时。切勿对装有未熏蒸样品的干燥器重复 4.7 小节中的真空操作。</li>
</ol>
5. 组装土壤样品培养容器
<ol>
	<li>将一根15 cm长的玻璃棒穿过中心钻有孔的10号橡胶塞。玻璃棒的直径应足以紧密地插入孔中。</li>
	<li>用与熏蒸和未熏蒸子样品编号相对应的标识，标记0.5 L半透明广口聚丙烯瓶。</li>
</ol>
6. 在通风橱下从干燥器中抽除氯仿
<ol>
	<li>打开真空干燥器的塞子，使空气流入干燥器内。取下干燥器的盖子，将样品和湿毛巾从干燥器中取出。</li>
	<li>使用真空泵从土壤样品中抽除 CHCl3 气体。
	<ol>
		<li>将盖子盖在干燥器上。用真空管将干燥器连接至真空泵。</li>
		<li>启动真空泵，运行五分钟。随后将真空管从干燥器上断开，使空气流入干燥器内。</li>
		<li>重复步骤 6.3.2 四次。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 将每个土壤子样品转移至培养容器中（图1），进行为期10天的培养
<ol>
	<li>用移液器将 1 ml 去离子水加入孵育容器中。使用橡皮筋将一个空玻璃小瓶连接到从 10 号塞子伸出的玻璃棒上，玻璃小瓶的开口端应朝向塞子的底部。玻璃小瓶的尺寸应足以容纳最多 40 ml 液体。</li>
	<li>将含有 30 g 土壤子样品的瓶子放入孵育容器中。</li>
	<li>从原始土壤样品中取 1 g 未熏蒸土壤，分别加入其对应的各个子样品（熏蒸和未熏蒸）中作为接种物。</li>
	<li>用移液器将 1 ml 2 M NaOH 加入连接在塞子/玻璃棒上的玻璃小瓶中。将塞子/玻璃棒压入孵育容器顶部，并用 Parafilm 密封孵育容器的开口。</li>
	<li>制备一个不含土壤的孵育容器。共组装三至五个无土壤的孵育容器。 
	注意：用于滴定无土壤容器样品的酸量对于确定孵育期间 CO2 矿化量至关重要，具体将在下文第 9.3 小节中描述。因此，设置多个无土壤容器是为了防止因某个无土壤容器样品处理或滴定错误，导致所有样品的 CO2 矿化计算出现偏差。来自无土壤容器样品滴定所消耗的酸量应接近；若其中某个样品的酸消耗量显著不同，可能是样品处理或滴定操作有误所致。
	<ol>
		<li>按照第 5 节的步骤组装孵育容器。</li>
		<li>按照 7.1 和 7.4 的步骤操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将所有孵育容器置于 25 °C 的避光储存区域。所有孵育容器在该区域中放置 10 天。</li>
</ol>
8. 对每个子样品进行滴定，以量化孵育期间微生物呼吸作用产生的 CO2
<ol>
	<li>从孵育容器中取出装有 2 M NaOH 的玻璃小瓶。</li>
	<li>用移液器将 2 ml 的 1 M BaCl2 加入装有 2 M NaOH 的玻璃小瓶中。</li>
	<li>用移液器或滴管向装有 BaCl2 和 NaOH 混合液的玻璃小瓶中加入一滴酚酞（C20H14O4）。将一个磁力搅拌子放入玻璃小瓶中，并将小瓶置于搅拌器上。</li>
	<li>开启搅拌器，用滴定管缓慢加入 0.1 N HCl，直至玻璃小瓶中混合液的红色变为无色。</li>
	<li>记录使玻璃小瓶中混合液变色所需的 HCl 体积。</li>
</ol>
9. 根据首次熏蒸-培养周期期间收集的数据测定微生物生物量碳16,21,22
<ol>
	<li>通过将每个子样品的湿重乘以步骤3.8中获得的干重与湿重之比，计算各子样品中土壤的干重。</li>
	<li>测定用于滴定无土壤培养容器的 HCl 平均用量。</li>
	<li>计算 CO2 在10天孵育期间使用以下公式计算矿化程度： 
	<img alt="二氧化碳静态平衡公式，方程符号表示，教学示意图" src="/files/ftp_upload/54614/54614eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 1"> 
	其中 CO2 = CO2 在10天培养期间发生矿化 
	NS = 用于滴定无土壤培养容器中样品的酸 
	S = 用于滴定孵育容器中含土壤样品的酸 
	M = HCl 的摩尔浓度 
	E = 6，当量重量 
	W = 培养容器中土壤的干重</li>
	<li>使用以下公式计算微生物生物量碳： 
	<img alt="生物利用度方程 BioC 计算公式，教学示意图" src="/files/ftp_upload/54614/54614eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="公式 2"> 
	其中，BioC = 微生物生物量碳 
	F = CO2 经熏蒸土壤子样品中矿化 
	NF = CO2 未熏蒸土壤样品中的矿化作用 
	K = 微生物生物量碳矿化为CO₂的比例2
	<ol>
		<li>通过直接测量确定 K 值 14土壤中C矿化的初步测试或已发表数值22该检测中，K 值通常采用 0.4523.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>对在首次熏蒸-培养循环中已进行熏蒸的土壤子样品，重复步骤4至8共七次，以完成连续的熏蒸与培养循环。</li>
</ol>
10. 通过八次熏蒸和培养碳循环过程中矿化的 CO2 测定活性碳和潜在碳周转速率
<ol>
	<li>使用以下公式计算每次熏蒸后添加到样品中的土壤接种物的校正因子： 
	<img alt="静力平衡方程；IC公式图；用于教学；数学概念；研究分析。" src="/files/ftp_upload/54614/54614eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程3"> 
	其中 IC = 接种物的校正因子 
	C' = 非熏蒸子样品在前10天培养期间释放的CO2量 
	r = 第一次熏蒸培养周期中接种土壤与熏蒸土壤的重量比 
	Ct = 培养周期（1, 2 … 8），当 t = 1 时，Ct-1 = 0</li>
	<li>使用以下公式估算每个子样品在每次培养期间释放的CO2量： 
	<img alt="用于光谱分析的Ct公式，研究文档中的方程。" src="/files/ftp_upload/54614/54614eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程4"> 
	其中 Ct = 培养期间释放的CO2量 
	NS = 用于滴定无土培养容器中样品的酸量 
	S = 用于滴定含土培养容器中样品的酸量 
	IC = 接种物的校正因子（由步骤10.1确定） 
	E = 6，当量重量 
	W = 培养容器中土壤的干重</li>
	<li>通过非线性回归推导活性有机碳（labile organic C）。
	<ol>
		<li>建立一个电子表格，包含每个样品的标识符、培养周期编号（1, 2 …8）以及培养期间释放的CO2量（由步骤10.2得出）。</li>
		<li>使用具备非线性回归功能的软件，将以下模型拟合至数据集： 
		<img alt="动力学过程中的指数衰减公式；Csum=LOC×(1–e^-kt)；分析中使用的方程。" src="/files/ftp_upload/54614/54614eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="方程5"> 
		其中 Csum = 八个培养周期中释放的CO2总量 
		LOC = 土壤活性有机碳 
		k = 潜在周转时间 
		t = 培养周期（1, 2 …8）</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤10.3.2中得到的潜在周转时间转换为天数：由于培养周期为10天，需将k的倒数乘以10。</li>
</ol>

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作者无任何利益冲突需要披露。

SFI 方法是一种有效的检测手段，可用于评估不同管理措施（如施肥、耕作、植被控制和收获方式）及土壤条件下土壤活性有机碳（LOC）含量和潜在碳周转速率差异的实验方案。土壤活性有机碳含量和碳周转速率可用于理解养分循环的变化。SFI 方法还可通过首次熏蒸-培养过程测定微生物生物量碳。能够同时测定土壤活性有机碳、碳周转速率和微生物生物量碳，使 SFI 方法成为一种相对经济高效的分析方法。
在采用SFI方法的同时测定其他土壤参数，有助于更全面地理解土壤活性碳（LOC）及其相关变量变化对养分循环的影响。测定土壤总碳浓度可用于确定土壤活性碳库容相对于总碳的变化29。检测土壤酶活性有助于理解微生物对易利用碳底物的利用过程，从而揭示土壤养分形态和含量的变化机制。例如，脱氢酶在有机质降解过程中发挥关键作用，是反映整体微生物活性的有效指标30。脲酶和磷酸酶是与养分循环相关的酶类实例，因其分别与氮素和磷素的微生物转化过程密切相关31,32。
SFI 方法的操作步骤存在多种变异，熏蒸-培...

由于活性有机碳（LOC）在碳（C）和养分循环中的关键作用及其对土壤变化的敏感性，测定土壤LOC是评估土壤有机质质量的重要指标。森林和农业生态系统在很大程度上依赖于土壤有机质中养分的矿化作用作为养分来源。管理措施可改变土壤有机碳的储量及其周转速率，从而影响养分供应1。土壤有机碳主要由两种组分构成：一种是难降解碳，其周转速率长达数千年；另一种是活性有机碳（LOC），其周转速率从数周至数年不等2,3,4。土壤活性碳包括易于分解的底物，如微生物生物量碳、植物根际分泌物中的低分子量化合物（氨基酸、简单碳水化合物）以及植物残体分解产生的副产物和淋溶物1,4,5。由于土壤活性碳易于分解，因此对扰动或改变土壤的管理措施和自然现象高度敏感6。土壤活性碳是土壤微生物分解有机质过程中的主要能量来源7。因此，与稳定的土壤有机碳形态相比，LOC对养分循环的影响更为显著8。此外，在LOC引发的激发效应促进下，土壤微生物还主导了难降解土壤有机质分解过程中大部分的异养呼吸作用9,10,11。这种呼吸作用在全球碳循环中具有重要作用，因为土壤有机碳储量约为大气碳储量的两倍11。
由于土壤活性有机碳（LOC）在陆地生态系统中的重要性，已发展出多种方法用于估算土壤LOC。这些方法可大致分为三类：物理法、化学法和生物化学法。密度梯度分离法属于物理方法，通过该方法可将土壤有机碳分离为重质或轻质组分，或分离为粗颗粒有机碳和细颗粒有机碳12,13,14,15。分离方法操作相对简便，但结果往往不够一致，因为这些组分受土壤类型、矿物组成、植物残体的大小与密度以及土壤团聚体稳定性的变化影响较大13,15。此外，分离方法仅能提供关于LOC的定量信息15。
目前有多种化学方法可用于轻组有机碳（LOC）的测定。通过水相提取有机碳的方法操作相对简便，且这些方法通常能提供易于重复的结果。然而，这些提取方法并未涵盖微生物可利用底物的全部范围15。已有多种用于土壤有机碳化学分级的氧化方法被开发出来。氧化法的优点在于能够表征活性有机碳的数量和质量，尽管某些方法需要使用危险化学品，且不同方法在结果重复性方面存在差异15。酸水解提取法是另一种可用于测定LOC数量和质量的化学分级方法，但该方法的结果难以用于解释其生物学特性13,15。
已开发出用于解释土壤活性有机碳（LOC）的生化方法。活性有机碳可通过微生物在呼吸测定中释放的CO2进行测定。这些测定可提供真实可矿化有机物的估算值，但在测定过程中通常仅有最易分解的化合物被矿化15。通过熏蒸-培养法16和熏蒸-提取法17测定的土壤微生物生物量碳已被用于推断LOC。然而，这些方法提供的是微生物生物量中的碳含量，而非LOC本身。这两种熏蒸方法均需从熏蒸土壤的测定值中减去未熏蒸土壤的对应值，以确定微生物生物量碳；但有研究指出，不进行此项减法所获得的数值，除微生物生物量外，还可反映碳的活性有机组分18。
用于测定易降解有机碳（LOC）的顺序熏蒸-培养（SFI）方法13是一种生化方法，源自用于测定土壤微生物生物量碳的熏蒸-培养方法16。相较于其他估算LOC的方法，SFI方法具有一些优势。该方法的概念基础在于，LOC是可被微生物降解并调控微生物生长的碳，并且在物理上可接触、化学上可被土壤微生物降解。在田间条件下，微生物生长通常受到碳有效性、养分有效性、可利用孔隙空间和/或捕食作用的限制。这些因素在熏蒸后几乎被完全消除，从而为微生物生长创造了无障碍条件。该方法的培养期间不移除任何养分。经过多次熏蒸和培养循环后，微生物生长逐渐受限于碳的数量和质量（活性）13。在培养循环过程中累积释放的CO2可通过简单的负指数模型外推计算LOC11,13,19。潜在的碳周转速率也可由该指数模型的斜率推导得出，因此SFI方法相较于大多数其他LOC测定方法，具有同时估算LOC浓度及其潜在周转速率的优势11。对于其他方法，只有使用14C等示踪剂才能确定LOC的潜在周转速率13。因此，SFI方法是一种相对简单且经济的技术，可用于同时测定LOC含量及其潜在周转速率。

<table><tbody><tr><td>土壤取样钻具套装</td><td>JMC</td><td>PN039</td><td>市面上还可提供多家其他品牌的冲压式取土钻具</td></tr><tr><td>帕拉菲姆封口膜（Parafilm）</td><td>Curwood</td><td>PM999</td><td></td></tr><tr><td>铝制称量舟</td><td>Fisherbrand</td><td>08-732-103</td><td></td></tr><tr><td>通用型干燥烘箱</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-103-0511</td><td>市面上还可提供多家其他品牌的通用型实验室烘箱</td></tr><tr><td>10.5 L 真空干燥器</td><td>Corning</td><td>3121-250</td><td></td></tr><tr><td>玻璃闪烁瓶</td><td>Wheaton</td><td>968560</td><td></td></tr><tr><td>带螺纹玻璃瓶，41&amp;nbsp;ml</td><td>Fisherbrand</td><td>03-339-21N</td><td></td></tr><tr><td>氯仿（以戊烯稳定化）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67-66-3</td><td></td></tr><tr><td>沸石</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25201</td><td></td></tr><tr><td>玻璃棒</td><td>Fisherbrand</td><td>S63449</td><td></td></tr><tr><td>10 号橡胶塞</td><td>Fisherbrand</td><td>14-130P</td><td>橡胶塞可购买实心塞后在中心打孔以安装玻璃棒，也可直接购买带孔橡胶塞用于插入玻璃棒</td></tr><tr><td>广口聚丙烯共聚物（PPCO）瓶，0.5 L</td><td>ThermoScientific</td><td>3121050016</td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠，试剂级</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>氯化钡</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202738</td><td></td></tr><tr><td>酚酞指示剂</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25466</td><td></td></tr><tr><td>盐酸溶液，0.1 N</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA54-4</td><td></td></tr></tbody></table>

利用连续熏蒸培养法测定土壤中的活性有机碳

Assessment of Labile Organic Carbon in Soil Using Sequential Fumigation Incubation Procedures

管理措施和环境变化可改变土壤养分和碳循环过程。土壤活性有机碳作为一种易于分解的碳库，对干扰高度敏感，同时也是土壤微生物的主要底物，对养分循环具有基础性作用。由于这些特性，活性有机碳（LOC）已被确定为土壤健康的指示参数。量化LOC的周转速率也有助于理解土壤养分循环过程的变化。目前已开发出一种连续熏蒸培养法，用于估算土壤LOC及其潜在碳周转速率。该方法需要对土壤样品进行多次熏蒸处理，并在10天的培养期内，测定一系列熏蒸-培养周期中释放的CO2-C。然后通过负指数模型，从累积的CO2量外推得出活性有机碳含量及潜在碳周转速率。本文详细描述了该方法的操作步骤。

SFI 方法已如本文所述，被用于在美国东南部开展的一系列实验中24,25,26,27。这些实验共同涵盖了多种植被类型，包括火炬松（Pinus taeda L.）、柳枝稷（Panicum virgatum L.）、美洲黑杨（Populus deltoides Bartram ex Marsh.）和大豆（Glycine max L. Merr.）。在所有研究中，该方法均能灵敏地检测出不同施肥处理和耕作方式在活性有机碳（LOC）和/或潜在碳周转速率上的差异。本系列研究中报告的 LOC 及其潜在周转速率范围存在部分重叠（图 2）。这些研究中 LOC 范围的差异突显了 SFI 方法在检测活性碳及潜在碳周转差异方面的灵敏性。在所有植被类型中，火炬松与柳枝稷间作系统表现出最大的 LOC 范围；该植被类型的研究涵盖了相对于其他植被类型更为广泛的立地条件。研究样地在土壤类型以及火炬松上层林分年龄（从幼龄到轮伐期末期）方面存在差异。林分年龄的时间序列变化可能在此处所...

不稳定的有机碳（LOC）和潜在碳周转速率是反映土壤养分循环过程变化的敏感指标。本文详细介绍了一种基于对土壤进行系列熏蒸-培养循环，并利用培养期间积累的CO2来估算这些参数的方法。

管理措施和环境变化可改变土壤养分和碳循环。土壤活性有机碳作为一种易于分解的碳库，是……

该序贯熏蒸培养实验方法的总体目标是估算土壤中活性碳含量及碳的潜在周转速率。该方法可解答土壤微生物学领域的一些关键问题，例如土壤微生物用于转化土壤养分的底物数量。该技术的主要优势之一是操作相对简便且成本低廉。采集前，需识别采样地点内土壤特性和植被的差异。根据相应的变异系数，确定所需采集的样本数量及变异距离。在土壤条件异质性较高的情况下，应设定网格采样模式，使每条样线上各采样点之间的距离小于实验单元内的变异距离。清除采样点土壤表面的有机物质。使用土钻采集每份土壤样品。对于网格的每条样线，将样品混合至同一个容器中。采集后立即将每个复合样品放入装有冰袋的冷藏箱中。野外工作完成后，对土壤样品进行过筛。每次过筛一个样品后，用水清洗筛网。对于每个复合土壤样品，取三个独立的100克样品放入烧杯中。用实验室封口膜覆盖烧杯，并在25摄氏度下预培养10天。然后，对于每个样品，移去封口膜，取1克土壤置于已预称重的铝制称量舟中。记录湿润土壤与称量舟的总质量。将各样品置于称量舟中，在105摄氏度下干燥48小时。前24小时内每8小时称重一次，之后每6小时称重一次，直至连续两次称量质量无变化。根据已知的称量舟重量，确定干土的重量。计算干土与湿土的重量比。开始熏蒸前，在两个带有瓷板的玻璃真空干燥器底部各放入一张湿润的纸巾。指定一个干燥器用于熏蒸。每个样品准备三个窄口玻璃小瓶，每瓶装入30克土壤。用铅笔在实验室胶带上标注每个小瓶。每组实验中，将两个小瓶放入熏蒸干燥器内，第三个小瓶放入另一个干燥器中。将熏蒸干燥器置于通风橱内。在100毫升烧杯底部铺上沸石。在通风橱中，将 50 毫升无乙醇氯仿倒入烧杯中。将烧杯置于熏蒸干燥器的中央，并关闭干燥器。将熏蒸干燥器连接至真空泵。打开真空泵，使氯仿沸腾30秒。然后关闭并断开真空泵，使空气进入干燥器。重复此步骤两次。将氯仿第四次煮沸两分钟。然后，关闭干燥器以维持真空状态。关闭并断开真空泵。关闭并密封另一个干燥器。将两个干燥器在室温下避光保存24小时。随后，将熏蒸用干燥器置于通风橱中。打开放气阀，取出纸巾。将装有土壤的试管放入干燥器中，盖上干燥器盖子，连接真空泵，打开真空以去除土壤样品中的氯仿气体。抽真空5分钟，然后打开放气阀。再重复此步骤四次，然后将装有土壤的试管从干燥器中取出，准备进行培养。准备培养容器时，标记广口聚丙烯瓶，用于盛装熏蒸和未熏蒸的子样品。另标记三个瓶子作为无土壤的对照，用于后续滴定。对于每个标记好的瓶子，在10号橡胶塞中心钻一个孔，并将一段15厘米长的玻璃棒插入孔中。用橡皮筋将一个40毫升的玻璃小瓶固定在玻璃棒上。然后，从原始的预培养土壤样品中取1克土壤，分别加入其三个子样品中。取1毫升去离子水加入标记为熏蒸土壤的瓶子之一中。将一个熏蒸土壤小瓶放入该瓶内。用移液管吸取1毫升2摩尔氢氧化钠溶液，加入塞子组件的玻璃小瓶中。小心地塞紧瓶塞，并用实验室封口膜密封瓶口。对剩余的土壤样品重复此操作。以相同方式准备无土壤的容器，但不加入土壤样品。将孵育室置于室温下的避光处保存10天。孵育结束后，小心地从孵育容器中取出氢氧化钠小瓶。用移液器向小瓶中加入2毫升1摩尔的氯化钡。向小瓶中加入一滴酚酞。向小瓶中加入一个磁力搅拌子，并在搅拌器上开始搅拌混合物。用滴定管缓慢加入0.1 N盐酸，直至溶液颜色由红色变为无色。记录所加入盐酸的体积。对所有培养室重复滴定操作，并单独记录无土壤对照组的数值。根据滴定数据及土壤干重与湿重之比，计算土壤样品在培养期间矿化的二氧化碳量。根据此结果，计算每组样品的微生物量碳。对已熏蒸的样品再进行七轮熏蒸与培养，每轮循环后均计算矿化的二氧化碳量。利用这些数据，通过非线性回归确定每个熏蒸样品中活性有机碳含量及其潜在周转时间。连续土壤熏蒸与培养法可识别不同植被条件下活性有机碳（LOC）及潜在碳周转速率的差异。大豆种植条件下的LOC值最高，这与大豆收获期间的生物量沉积有关。火炬松人工林的潜在碳周转速率最高，这与酸性松针凋落物作为土壤有机质的主要来源有关。在所有采样点条件中，湿地松与柳枝稷间作系统的环境条件最为多样，而柳枝稷牧草地在各采样点之间的土壤质地差异最大。这两种条件下，LOC值和潜在碳周转速率均表现出较宽的范围。一旦掌握该技术，每份样品的处理时间约为30分钟，而完成每份样品的整个运行周期需要80天。为了准确执行该实验操作，需注意以下几点：确保干燥器和培养室均密封严密，同时避免向含有氢氧化钠的小瓶呼出气体。与此操作同时或在此操作之后，可对土壤进行多种不同的酶活性测定，以更深入地了解土壤微生物功能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何采用连续熏蒸培养法进行活性碳分析。请注意，使用氯仿可能具有极高的危险性。进行这些操作时，必须配备个人防护装备并在通风橱中进行，以确保安全。

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环境

活性有机碳评估土壤中连续熏蒸孵化程序

生物炭是一种富含碳的材料，可作为土壤改良剂，具有可持续固碳、改善基质质量和吸附污染物的能力。本方案描述了在环境中大规模应用此类改良剂之前，所需进行的17种生物炭表征分析方法。...

用于污染场地修复的六种生物炭的物理、化学与生物学表征

磷脂脂肪酸可提供有关土壤微生物群落结构的信息。本文介绍了从土壤样品中提取磷脂的单相氯仿混合物提取方法、利用固相萃取柱对提取的脂质进行分离纯化的方法，以及通过甲醇解反应生成脂肪酸甲酯，随后采用毛细管气相色谱法对脂肪酸甲酯进行分析。...

土壤中微生物磷脂脂肪酸的提取与分析

本文介绍了一种方法，该方法在提高通量的同时，平衡了操作难度与准确性，可用于从微生物细胞膜中提取脂质，进而对大量样本研究中的总脂质以及指示性脂质的相对丰度进行表征，以确定土壤微生物群落结构。...

一种适用于大量样本实验中表征土壤微生物的脂质提取与分析方法

土壤有机质（SOM）是多种土壤功能和过程的基础，但其傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征常受到土壤矿物干扰的限制。本方法通过使用经验获得的矿物参考光谱，从土壤光谱中扣除矿物干扰，从而提高利用FTIR光谱法分析土壤有机质的实用性。...

通过光谱减法改进土壤有机质的红外光谱表征

本方案描述了一种高通量方法，结合互补的分析技术和组学技术，最终实现对不同生态系统中天然有机质和微生物蛋白质组的全面配对表征。该方法可进行可靠的比较，有助于识别对描述温室气体产生及预测环境变化响应具有重要意义的代谢途径和转化过程。...

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本方案是一种高效且快速的方法，可在短短7天内从大量土壤样本中培养酵母和烟曲霉（Aspergillus...

从土壤中分离可培养的酵母菌和霉菌以研究真菌种群结构

本文介绍了一种用于筛选土壤生物多样性中参与难降解材料降解的真菌菌株的实验方案。首先，分离能够在腐殖酸或木质纤维素上生长的真菌菌株，随后通过酶学实验以及对烃类和塑料等污染物的降解能力测试其活性。...

从土壤生物多样性中分离与筛选降解难降解材料的真菌

实验室土壤增温实验通常在多个培养箱中采用两种或以上的恒定温度。通过介绍一种复杂的环境培养箱，我们提供了一种精确的温度控制方法，用于模拟温度变化的幅度和振幅 原位...

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利用数字滴液PCR（ddPCR）测定土壤中的微生物生物量

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利用连续熏蒸培养法测定土壤中的活性有机碳

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