利用连续熏蒸培养法测定土壤中的活性有机碳

该序贯熏蒸培养实验方法的总体目标是估算土壤中活性碳含量及碳的潜在周转速率。该方法可解答土壤微生物学领域的一些关键问题，例如土壤微生物用于转化土壤养分的底物数量。该技术的主要优势之一是操作相对简便且成本较低。

采集前，确定采样地点内土壤性质和植被的差异。根据相应的变异系数，确定所需样本数量及变异距离。对于异质性土壤条件，应设定网格采样模式，使每条样线上采样点之间的距离小于实验单元内的变异距离。

清除采样点土壤表面的有机物质。使用土钻采集每份土壤样品。对于网格的每条样线，将样品混合至同一个容器中。

采集后立即将每个复合样品放入装有冰袋的冷藏箱中。野外工作完成后，对土壤样品进行过筛。每次过筛一个样品后，用水清洗筛网。

对于每个复合土壤样品，取三份独立的100克样品放入烧杯中。用实验室封口膜覆盖烧杯，并在25摄氏度下预培养10天。然后，对于每个样品，移去封口膜，取1克土壤置于已预先称重的铝制称量舟中。

记录湿润土壤和称量皿的总重量。将每个样品置于称量皿中，在105摄氏度下干燥48小时。前24小时内每8小时称重一次，之后每6小时称重一次，直至连续两次称重无质量变化。

根据已知重量的称量舟，确定干土的重量。计算干土与湿土的重量比。开始熏蒸前，在两个带有瓷板的玻璃真空干燥器底部各放置一张湿润的纸巾。

指定一个干燥器用于熏蒸。每个样品准备三个窄口玻璃小瓶，每瓶装入30克土壤。用铅笔在实验室胶带上为每个小瓶标记标签。

每组实验中，将两个小瓶放入熏蒸干燥器内，第三个小瓶放入另一个干燥器中。将熏蒸干燥器置于通风橱内。在100毫升烧杯底部铺上沸石。

在通风橱中，将 50 毫升无乙醇氯仿倒入烧杯中。将烧杯置于熏蒸干燥器的中央，并关闭干燥器。将熏蒸干燥器连接至真空泵。

打开真空泵，使氯仿沸腾30秒。然后关闭并断开真空泵，使空气进入干燥器。重复此步骤再两次。

将氯仿再次煮沸四分钟。然后，关闭干燥器以维持真空状态。关闭并断开真空泵。

关闭并密封另一个干燥器。将两个干燥器在室温下避光存放24小时。随后，将熏蒸用干燥器置于通风橱中。

打开干燥器，取出纸巾。将装有土壤的样品瓶放入干燥器中，盖上干燥器盖，连接真空泵，打开真空以去除土壤样品中的氯仿气体。抽真空5分钟，然后打开干燥器。

重复此步骤四次，然后将装有土壤的试管从干燥器中取出，准备进行培养。为准备培养容器，标记广口聚丙烯瓶，用于盛装熏蒸和未熏蒸的子样品。另标记三个瓶子作为无土壤的对照，用于后续滴定。

对于每个标记好的瓶子，在10号橡胶塞中心钻一个孔，并将一段15厘米长的玻璃棒插入孔中。用橡皮筋将一个40毫升的玻璃小瓶固定在玻璃棒上。然后，从原始预培养的土壤样品中取1克土壤，分别加入其三个子样品中。

取一毫升去离子水加入已标记为熏蒸土壤的瓶子之一中。将一个熏蒸土壤小瓶放入该瓶内。用移液器吸取一毫升 2 摩尔氢氧化钠溶液，加入塞子组件的玻璃小瓶中。

小心地塞紧瓶塞，并用实验室封口膜密封瓶子。对剩余的土壤样品重复此操作。以相同方式准备无土壤的容器，但不加入土壤样品。

将孵育室置于室温下的避光处保存10天。孵育结束后，小心地从孵育容器中取出氢氧化钠小瓶。用移液器向小瓶中加入2毫升1摩尔的氯化钡。

向小瓶中加入一滴酚酞。向小瓶中加入一个磁力搅拌子，并在搅拌器上开始搅拌混合物。用滴定管缓慢加入0.1 N盐酸，直至溶液颜色由红色变为无色。

记录所加入盐酸的体积。对所有培养室重复进行滴定，并分别记录无土壤样品的数值。根据滴定数据以及土壤干重与湿重的比值，计算土壤样品在培养期间矿化的二氧化碳量。

根据此数据计算每组样品的微生物生物量碳。对熏蒸样品再进行七轮熏蒸与培养，每轮循环后均计算矿化的二氧化碳量。利用这些数据，通过非线性回归分析确定每个熏蒸样品中活性有机碳的含量及其潜在周转时间。

连续土壤熏蒸与培养法可识别不同植被条件下活性有机碳（LOC）及潜在碳周转速率的差异。大豆种植条件下的LOC值最高，这与大豆收获期间的生物量沉积有关。火炬松人工林的潜在碳周转速率最高，这与其酸性松针凋落物作为土壤有机质主要来源有关。

火炬松与柳枝稷间作系统的采样点环境条件最为多样，而柳枝稷牧草地在各采样点之间的土壤质地差异最大。这两种条件下，LOC值和潜在碳周转速率均表现出较大的变化范围。一旦掌握该技术，每份样品的处理时间约为30分钟，而每份样品的完整运行周期为80天。

为了准确实施该实验操作，需注意以下几点：确保干燥器和培养室均密封严密，同时避免向含有氢氧化钠的小瓶呼气。与此操作同时或在此操作之后，可对土壤样品进行多种不同的酶活性测定，以更深入地了解土壤微生物的功能。观看本视频后，您应能够充分掌握如何采用连续熏蒸培养法进行活性碳分析。

请务必注意，使用氯仿可能具有极高危险性。进行这些操作时，必须配备个人防护装备并在通风橱中进行，以确保安全。