体内小鼠基质凝胶栓塞实验研究人源内皮细胞-周细胞相互作用

本体内基质胶实验的总体目标是研究内皮细胞与寄生虫之间的相互作用。该基底膜基质（Matrigel）实验旨在帮助研究人员探讨雄性生殖过程中的主要步骤。此外，该实验还可用于鉴定参与血管形成关键步骤的信号通路，以及识别其功能障碍可能导致血管疾病和其他雄性生殖异常的基因。

该技术的主要优势在于，它使我们能够研究涉及内皮细胞及其支持细胞——周细胞的活体内血管形成过程。首先，在100毫米培养皿中加入10毫升适当的培养基，培养人源内皮细胞和寄生细胞。每两到三天更换一次培养基，直至细胞达到80%融合度。

为了制备用于与细胞混合的基质凝胶溶液，需在4°C条件下过夜解冻基质凝胶储备液。然后分装成每份1.5毫升的等分试样，可长期保存于-20°C，或在4°C下保存不超过两周。每个实验用凝胶栓需要200 µL基质凝胶。

因此，一支储存液管可为六个孔提供含有25%过量的溶液。通过加入15微升解冻的100倍浓度β-FGF储存液来制备每个所需的分装量。用移液器将β-FGF混入溶液中，然后在加入细胞前于冰上孵育至少30分钟。

此时，将一些28号规格的1毫升胰岛素注射器冷却以备注射使用。收集培养板中的细胞时，先吸去培养基，并用PBS洗涤细胞一次。吸去PBS后，加入一毫升胰蛋白酶溶液，然后将培养板放回培养箱中孵育一分钟。

然后，向培养板中加入2毫升培养基以悬浮细胞，并将悬液收集至15毫升离心管中。接着，使用血细胞计数板检测细胞悬液的浓度。随后，在15毫升离心管中分装细胞悬液。

实验组使用一百万个内皮细胞与200,000个寄生虫的组合。接下来，将细胞分装物在400×g条件下离心五分钟。然后，向细胞沉淀中加入计算好的基质凝胶体积，并通过轻柔吹打混匀，避免产生泡沫，因为气泡无法被注射。

将制备好的样品置于冰上保存，直至准备对小鼠进行注射。用异氟烷麻醉小鼠，并通过脚趾夹捏确认麻醉状态后，将小鼠连接至提供异氟烷的非重复呼吸系统，并将其腹侧朝下放置于加热垫上。随后，去除两侧后部区域约一平方厘米的毛发。

然后，使用70%酒精将暴露的皮肤擦拭干净。接着，将一毫升已制备的细胞溶液吸入预冷的注射器中，此剂量足以制备四个组织块。进行注射时，提起背部皮肤以确定皮下空间。

然后缓慢将200微升液体均匀注入肋骨后方的皮下间隙，缓慢拔出针头以防止渗漏。注射后，注射部位会形成一个隆起。用酒精擦拭该部位，再用记号笔标记隆起区域，以便后续识别。

然后，在小鼠的另一侧重复注射操作。务必在三分钟内完成所有细胞的注射，否则细胞会开始黏附在注射器上。注射步骤至关重要，操作需准确，以确保基质凝胶栓能够在皮肤与肌肉层之间形成，从而维持良好的形态，避免扩散。

在对下一只小鼠进行注射前，让已注射的小鼠在加热垫上停留一分钟，使基质有足够时间凝胶化。安乐死后，将小鼠置于手术台上。清除注射部位再生的毛发后，找到用于标识栓塞位置的标记线。

然后，使用精细的外科剪刀，沿着栓塞标记的边界，垂直于皮肤并深入至下方肌肉层进行切开。仔细沿标记边界的周围进行剪切。随后取出栓塞组织，保持其夹在皮肤层与肌肉层之间。

立即用一小烧杯 PBS 冲洗凝块以去除血液。然后，将整个凝块放入含有 25 毫升 4% 多聚甲醛的 50 毫升离心管中。在室温下固定 24 小时，期间不进行任何震荡。

第二天，将组织块转移至25毫升70%乙醇中固定24小时，随后进行石蜡包埋。仅含内皮细胞的组织块切片显示，部分血管在体内植入14天后未被宿主血液灌注。

相比之下，含有内皮细胞和寄生虫的植入物在体内植入14天后显示出大量灌注良好的血管。这些植入物中可见表达平滑肌肌动蛋白（红色染色）的细胞紧邻CD31阳性内皮细胞（绿色染色）。因此，寄生虫可能在新生血管形成过程中发挥重要作用。

观看本视频后，您应能够充分理解如何应用这一强大的体内技术，在多种细胞类型中研究血管形成。该技术将为研究人员利用小鼠模型探索血管生物学的多个研究领域提供重要途径。在完成本实验步骤后，还可进一步采用其他方法，如定量 PCR 和蛋白质印迹（Western immunoblotting），以回答更多科学问题，例如基因表达变化和蛋白质组学相关问题。

这种强大的技术将使研究人员能够研究在血管形成过程中内皮细胞与寄生虫在体内的相互作用，这是雄性生殖的关键步骤。该技术还将使研究人员能够研究其他与理解血管疾病（如肺动脉高压等）相关的细胞间相互作用。