在小鸡学习感应信号与候选因子浸泡珠结合防渗屏障中的应用

这种手术干预的目的是通过阻止信号分子从内侧组织扩散到侧板中胚层中的细胞并研究其对基因表达的影响，阐明雏鸡胚胎中肢体诱导的机制。这种方法可以帮助回答发育生物学中的关键问题，例如，控制肢芽启动的诱导信号是什么。这种技术的优点是雏鸡胚胎可以进行手术作并且非常健壮，此外，未手术的对侧控制肢芽作为非常有用的内部控制。

Susan Wilde 将演示该程序。首先，切下一块 1 厘米见方的 0.013 毫米厚的铝箔，并用 70% 乙醇擦拭消毒。然后，将正方形放在 6 cm 无菌塑料培养皿上。

为防止静电粘附，请丢弃盖子，用同一箔纸为盘子制作一个新的盖子。接下来，在放大倍率为 1.6 倍的双目显微镜下将培养皿放在载物台刻度的顶部。使用 15 号刀片小手术刀切割 1.3 毫米宽、2 毫米长的箔条。

使用两对 4 号钟表制造商镊子分离铝箔条。然后，在铝箔屏障的中心做一个直角弯曲，使其类似于铰链。将屏障排在培养皿的中心，一侧平靠培养皿，另一侧朝上指向培养皿外，在手术日之前准备 20 个或更多屏障。

将铝箔盖盖在培养皿上，并将屏障存放在不会打扰的地方。将鸡蛋侧躺，牢牢抓住一对 AA 型强力镊子，用受控的刺入动作刺穿含有气囊的鸡蛋的钝端，同时用另一只手握住鸡蛋。确保内壳膜已破损。

接下来，用双手拿起鸡蛋，沿其水平轴旋转 180 度。接下来，取一条约 5 厘米见方的透明胶带，将其紧紧贴在鸡蛋的最上表面，以防止鸡蛋打开时蛋壳碎裂到胚胎上。用一把弯曲的剪刀轻轻地打破鸡蛋最上部中心的蛋壳及其相关的内细胞膜。

用剪刀的一把刀片打一个非常小的孔，这样空气就可以通过胚胎进入鸡蛋。用剪刀将壳上的孔扩大成直径约 1 厘米的圆圈。从鸡蛋中取出这块鸡蛋大小的壳。

用一块大约 5 厘米见方的透明胶带盖住鸡蛋上的孔。按压胶带，仅将其粘在孔的边缘，留下剩余的胶带。然后可以抓住游离的胶带，轻松解封鸡蛋。

从培养箱中取出 15 期胚胎，将鸡蛋放在双目显微镜下设置为 3.2 倍或更高的放大倍数的鸡蛋架上。然后，撕掉上层透明胶带。使用钢制微刀，在卵黄膜上切开一个切口，并将中胚层横向放置在胚胎右侧体节 26-32 附近。

用一端的 5 号微镊子拿起屏障，然后扭转屏障，将自由端插入切口。尽快用透明胶带密封鸡蛋并将其放回孵化器。如果要将珠子与屏障一起插入，首先，按照随附文本协议中的说明准备维甲酸浸泡的珠子。

接下来，取珠子和一对 5 号微镊子，将其插入切口远端外侧中胚层的切割面。然后，将屏障插入珠子近端的切口中。密封鸡蛋并立即将其放回孵化器。

如果要在没有屏障的情况下插入一个或多个珠子，请不要做长切口。相反，在卵黄膜上做一个小切口，在要放置珠子的位置进入侧板中胚层。然后，拿起珠子和 5 号微镊子，将其插入侧板中胚层的孔中。

用镊子的封闭端将其进一步推入。从培养箱中取出带窗口的第十阶段胚胎，将鸡蛋放在双目显微镜下的鸡蛋架上，如果需要，可以设置为 3.2 倍或更高的放大倍率。然后，使用钢制微刀，在卵黄膜和侧板中胚层切开，在胚胎尾端的原始条纹外侧，与体节对齐，大约有六个体节长。

接下来，用一对 5 号微型镊子在从培养皿中伸出的一端拿起屏障，然后扭动手将屏障的自由端插入切口。尽快用透明胶带密封鸡蛋并将其放回孵化器。如果要在没有屏障的情况下插入微珠，请通过卵黄膜做一个小切口，并在要放置微珠的位置进入侧板中胚层。

然后，取出珠子和一对 5 号微型镊子，将其插入侧板中胚层的孔中。最后，用镊子的封闭端将其进一步推入。这里显示的是 15 期胚胎中体节 26-32 的推定腿水平的屏障位置。

该屏障导致 Fhf10 和 Fhf8 表达在手术侧的腿芽区域不存在，而存在于未手术侧的左侧。然而，在手术侧的第 19 阶段和第 23 阶段都观察到 Tbx4 表达。这意味着单独的 Tbx4 表达不足以从 lpm 启动后肢生长。

当在第 15 阶段将恒温酸浸泡的珠子放置在屏障远端时，Tbx4、Fgf10 和 Fgf8 都在手术侧表达，因为它们位于左侧对照侧。因此，在正常发育中，在肢芽开始生长之前，来自体节的视黄酸是必不可少的。看完这个视频后，您应该对如何使用不透水屏障和候选浸泡因子珠子来研究诱导信号如何调节雏鸡胚胎中肢芽的启动有一个很好的了解。