基于CFSE-试验鼠皮肤树突状细胞的迁移习进引流淋巴结在与感染牛分枝杆菌卡介苗
October 9th, 2016
描述了一种在小鼠中跟踪细胞从皮肤迁移到引流淋巴结的测定，这使得能够表征在脚垫感染卡介苗后动员到淋巴结的皮肤树突状细胞。
这种基于荧光细胞追踪器的检测的总体目标是监测和表征特定的目标细胞群，因为它们在脚垫感染卡介苗 （BCG） 后从皮肤迁移到引流淋巴结。我们使用这项技术来识别皮肤 BCG 感染后引流淋巴结所在的树突状细胞群。该技术允许在定义的 24 小时窗口内注射肿瘤来研究细胞迁移。
这种方法的视觉演示至关重要，因为足垫注射和淋巴结隔离步骤很难从文本中学习。对于牛微杆菌 BCG 注射液，在通过捏脚趾确认适当的镇静水平后，使用装有 29 号 1/2 英寸针头的注射器在 8 至 12 周龄小鼠的后足垫上接种 1 乘以 10 至 6 的细菌菌落形成单位在 30 微升 PBS 中。仅用 PBS 注射对照脚垫。
然后监测动物，直到它们完全躺着并能够将重量放在注射的脚垫上。对于 CFSE 注射，在 BCG 注射后的适当时间点，将一小瓶室温 5 毫摩尔 CFSE 在 PBS 中稀释 10 倍，注意彻底重新悬浮溶液。然后，在注射器中加入稀释的 CFSE，并将 20 微升剂量注入接受第一次注射的同一后足垫中。
CFSE 注射后 24 小时，小心地在大腿后部做一个垂直切口，并清除肌肉脂肪。接下来，使用剪刀和镊子暴露并切除位于膝盖凹陷脂肪袋深处的腘淋巴结。将淋巴结转移到冰上的 0.5 毫升无菌 PBS 中，并通过含有 5 毫升 PBS 的六孔板的一个孔内的 70 微米细胞过滤器对淋巴结进行匀浆，后端为 3 毫升注射器。
用另外 5 mL 缓冲液清洗过滤器，并将细胞溶液转移到 15 mL 试管中。然后，离心细胞并将沉淀重悬于足够体积的缓冲液中。为了标记细胞进行流式细胞术，我将 1 到 10 乘以 10 到第六个细胞放入 5 毫升圆底聚苯乙烯管中，并在新鲜的 FACS 缓冲液中洗涤细胞。
将沉淀重悬于 50 至 100 微升含有抗小鼠 CD16 CD32 的适当抗体混合物中，以阻断冰上 FACS 缓冲液中非特异性 FC 介导的相互作用，避光。30 至 45 分钟后，在 FACS 缓冲液中洗涤细胞，并将沉淀重悬于 50 至 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。腘窝淋巴结中的大部分 CFSE 标记在 MHC-II 高细胞和 CD11c 阳性低细胞中观察到，与迁移到皮肤引流淋巴结的皮肤树突状细胞一致。
与 PBS 注射的对照相比，这些标记细胞在 BCG 感染小鼠的腘窝淋巴结中出现的频率和总数都增加，这表明 BCG 增强了这些细胞向引流淋巴结的重新定位。皮肤树突状细胞在感染后长达 5 天内继续进入引流淋巴液，将当前模型中树突状细胞的迁移范围延长到远远超过腘窝淋巴结中抗原特异性 CD4 阳性 T 细胞初始激活的时间表。此外，迁移性皮肤树突状细胞表达高水平的共刺激分子，支持这些迁移性树突状细胞被激活的概念。
重要的是，淋巴结耐药单核细胞样和浆细胞样树突状细胞（通过高位内皮小静脉进入发炎的淋巴结，而不是传入淋巴管）对 CFSE 呈阴性，进一步验证了 CFSE 标记主要发生在脚垫中。此外，额外的流式细胞术分析显示，EpCAM 低 CD11b 高细胞亚群是响应 BCG 感染而引流到腘窝淋巴结的主要迁移皮肤树突状细胞亚群。一旦掌握，如果作得当，这项技术可以在五分钟内完成。
在尝试此过程时，重要的是要注意注射部位和注射量;在解剖过程中应非常小心，不要损伤引流淋巴结。该程序之后，可以执行其他方法，如流式细胞术或共聚焦显微镜检查，以进一步分析亚群特异性细胞微表达。这项技术为研究人员在 24 小时内追踪从皮肤到引流淋巴结的细胞以响应感染或疫苗接种铺平了道路。
观看本视频后，您应该对如何进行足垫注射以及定位和分离引流淋巴结以跟踪和表征感兴趣的迁移树突状细胞群有很好的了解。
概述
本文描述了一种用于监测树突状细胞从皮肤迁移到引流淋巴结的荧光细胞追踪试验，该试验用于观察卡介苗（BCG）感染后的树突状细胞迁移情况。该方法允许对这些细胞及其在免疫反应期间的激活状态进行表征。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 神经科学
背景
- 树突状细胞在免疫反应中扮演着至关重要的角色。
- 了解它们的迁移模式可以为疫苗开发提供信息。
- BCG用于研究小鼠的免疫反应。
- 追踪细胞迁移对于表征免疫细胞行为至关重要。
研究目的
- 开发一种用于追踪树突状细胞迁移的方法。
- 表征感染后树突状细胞的激活。
- 为研究人员提供该技术的视觉演示。
使用的方法
- 在小鼠中注射卡介苗和CFSE到足垫。
- 分离膝盖淋巴结进行分析。
- 使用流式细胞术评估细胞群体。
- 为清晰起见，视觉演示程序。
主要结果
- 卡介苗感染后，淋巴结中CFSE标记的树突状细胞数量增加。
- 识别对感染作出反应并迁移的特定树突状细胞亚群。
- 证据显示树突状细胞在初始T细胞激活之后继续长期迁移。
- 迁移的树突状细胞上激活标记物水平升高。
结论
- 该试验有效地追踪了树突状细胞对BCG的反应迁移。
- 它提供了有关免疫细胞激活动态的见解。
- 该方法可以快速掌握，从而促进进一步的研究。
常见问题
Executive Industry Relevance
This CFSE-based migration assay enables biopharma researchers to quantitatively track dendritic cell trafficking from peripheral tissues to lymphoid organs during infection or vaccination. By identifying migratory DC subsets and their activation states, the method supports target validation in immunomodulatory drug development and provides mechanistic insights for de-risking vaccine candidates. The assay’s simplicity and reproducibility facilitate integration into discovery pipelines assessing immunomodulatory mechanisms.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of dendritic cell migration as a functional readout for immunomodulatory target engagement.
- Operational Value: Provides a standardized, quantitative method to assess cell trafficking in vivo.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates migration-competent dendritic cell populations for downstream functional or phenotypic screening.
- Operational Value: Supports assay standardization through defined CFSE labeling and lymph node isolation parameters.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Links dendritic cell migration to co-stimulatory molecule expression, informing mechanistic de-risking of vaccine adjuvants.
- Operational Value: Enables longitudinal tracking of migratory cells beyond initial T-cell activation, supporting risk-adjusted preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation by providing quantitative migration data that informs immunomodulatory mechanism of action.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of dendritic cell recruitment and activation in response to microbial stimuli.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing migratory responses across experimental conditions.
- Analytics: Enables frequency and absolute count measurements of labeled dendritic cells via flow cytometry for comparative analysis.
- Translational Research: Connects migratory dendritic cell phenotypes to activation markers, supporting biomarker alignment in preclinical models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for tracking cell migration in response to vaccines, adjuvants, or immunomodulators.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in dendritic cell-mediated immune responses by reducing mechanistic ambiguity in cell trafficking.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability through standardized injection, isolation, and staining procedures.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions in immunomodulator development by providing early functional validation of target engagement.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on dendritic cell migration and activation profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine footpad injection, lymph node dissection, and flow cytometry.
- Depends on access to CFSE, sterile PBS, cell strainers, centrifuges, and flow cytometers.
- Necessitates standardization across teams for consistent injection volumes, incubation times, and gating strategies.
- Adaptation to other model systems may require optimization of infection models and dendritic cell markers.
- Practical limitations include technical skill in lymph node isolation and potential variability in CFSE labeling efficiency.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:56
Bacille Calmette-Guérin (BCG) and CFSE Injection
2:08
Popliteal Lymph Node (pLN) Harvest, Single Cell Suspension Preparation and Cell Surface Staining
4:05
Results: Migratory Skin Dendritic Cell Draining LN Relocation after BCG Footpad Infection
6:04
Conclusion
