基于CFSE的检测方法用于研究小鼠皮肤树突状细胞在感染牛分枝杆菌卡介苗（Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin）期间向引流淋巴结的迁移

本荧光细胞示踪剂检测方法的总体目标是，在小鼠足垫感染卡介苗（Bacille Calmette-Guerin，BCG）后，监测并表征从皮肤迁移至引流淋巴结的特定目标细胞群体。我们已利用该技术鉴定出在皮肤BCG感染后归巢至引流淋巴结的树突状细胞群体。该技术通过在明确的24小时时间窗口内注射标记物，实现了对细胞迁移过程的研究。

该方法的可视化演示至关重要，因为足垫注射和淋巴结分离步骤仅通过文字难以掌握。对于微小杆菌 Bovus BCG 的注射，在通过脚趾夹捏确认小鼠达到适当镇静水平后，使用装有29号1/2英寸针头的注射器，将30 µL PBS 中含1×10⁶个菌落形成单位的细菌接种至8至12周龄小鼠的后足垫。对照组足垫仅注射 PBS。

然后观察动物，直至其完全恢复卧姿并能够将重量施加于注射过的足垫。对于CFSE注射，在BCG注射后的适当时间点，将一管室温下5毫摩尔的CFSE用PBS稀释十倍，注意充分重悬溶液。随后，用稀释后的CFSE溶液填充注射器，并向之前接受首次注射的同一后足足垫内注射20微升。

CFSE注射后24小时，仔细在后侧大腿做一纵向切口，清除肌肉周围的脂肪组织。接着，使用剪刀和镊子暴露并切除位于膝窝脂肪囊深处的腘窝淋巴结。将淋巴结转移至盛有0.5毫升冰上预冷的无菌PBS的容器中，并将淋巴结置于含5毫升PBS的六孔板的一孔内，用3毫升注射器的末端通过70微米细胞滤筛研磨匀浆。

用另外5毫升缓冲液冲洗滤器，并将细胞悬液转移至15毫升离心管中。随后离心细胞，并用适量缓冲液重悬沉淀。为进行流式细胞术标记，将1×10⁶至10×10⁶个细胞分装至5毫升圆底聚苯乙烯管中，用新鲜FACS缓冲液洗涤细胞。

将沉淀物重悬于 50 至 100 微升含有抗小鼠 CD16/CD32 抗体的适当抗体混合液中，以阻断在冰上、避光条件下 FACS 缓冲液中的非特异性 FC 介导相互作用。孵育 30 至 45 分钟后，用 FACS 缓冲液洗涤细胞，并将沉淀物重悬于 50 至 100 微升新鲜 FACS 缓冲液中。在腘窝淋巴结中，大部分 CFSE 标记信号出现在 MHC-II 高表达且 CD11c 低表达的细胞中，这与迁移至皮肤引流淋巴结的皮肤树突状细胞特征一致。

与PBS注射对照组小鼠相比，BCG感染小鼠的腘淋巴结中这些标记细胞的频率和总数均增加，提示BCG可增强这些细胞向引流淋巴结的迁移。皮肤树突状细胞在感染后持续进入引流淋巴结，时间长达五天，这使得在本模型中树突状细胞的迁移过程明显超过了腘淋巴结内抗原特异性CD4阳性T细胞初始活化的时限。此外，迁移的皮肤树突状细胞表达较高水平的共刺激分子，支持这些迁移的树突状细胞已被活化的观点。

重要的是，通过高内皮微静脉而非传入淋巴管进入炎症淋巴结的单核样和浆母样树突状细胞均对CFSE呈阴性，进一步证实CFSE标记主要发生在足垫部位。此外，进一步的流式细胞术分析显示，在BCG感染后，EpCAM低表达、CD11b高表达细胞亚群是迁移至腘窝淋巴结的主要皮肤树突状细胞亚群。一旦掌握，该技术若操作得当，可在五分钟内完成。

在进行该操作时，需谨慎处理注射部位和注射体积；解剖过程中应格外注意，避免损伤引流淋巴结。操作完成后，可进一步采用流式细胞术或共聚焦显微镜等方法，对特定细胞亚群的微表达进行分析。该技术为研究人员提供了在感染或疫苗接种后24小时内，追踪细胞从皮肤迁移至引流淋巴结的途径。

观看本视频后，您应能够充分掌握足垫注射的操作方法，并学会定位和分离引流淋巴结，以追踪和表征感兴趣的迁移性树突状细胞群体。