Name: 骨髓增殖性疾病的转导移植小鼠模型 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: 学习转导移植技术建立小鼠模型，利用高滴度病毒转导造血细胞并移植，研究基因在血液恶性肿瘤和正常造血中的作用。该方法可加速治疗策略开发与血液疾病研究。

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本工作由 V 基金会学者奖（AGF）和 MPN 研究基金会（AGF）资助。

本研究经加州大学欧文分校机构动物照护与使用委员会批准，并遵循其建议进行。所有操作均在异氟烷麻醉下实施，并尽一切努力减少动物痛苦。
1. 生态型逆转录病毒的产生
<ol>
	<li>使用商业化的质粒大提试剂盒或氯化铯纯化方法制备高质量质粒，浓度至少达到 1 µg/µl。 
	注意： 这些包括一个携带目的基因（此处为 CALR）的 MSCV 骨架载体7,8）以及所选标记（GFP、Neo， 等等。以及一种编码gag-pol-env的嗜亲性包装质粒（下文简称质粒）。</li>
	<li>解冻并扩增低代次293T细胞，使用添加10% FBS、L-谷氨酰胺及青霉素/链霉素的DMEM培养基（D10）。接种5 × 10⁶个细胞6 37 °C、5% CO₂的湿润化组织培养孵育箱中，置于10 cm组织培养处理皿内的细胞2.</li>
	<li>在培养基中扩增293T细胞。转染前一天，加入1 ml PBS洗涤细胞，并用真空泵抽吸去除上清液。</li>
	<li>用胰蛋白酶消化细胞时，加入 2 ml 0.05% 胰蛋白酶，于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化组织培养孵箱中孵育培养皿 2–3 分钟。2.</li>
	<li>为终止胰蛋白酶消化，向培养皿中加入 3 ml D10 培养基，将细胞转移至 15 ml 圆锥形离心管中。在 400 x g 条件下离心 10 分钟。</li>
	<li>吸弃上清液至真空瓶中，将细胞沉淀重悬于 2 ml D10 培养基中。</li>
	<li>使用血细胞计数板，通过台盼蓝排斥法对细胞进行计数。</li>
	<li>接种 2 × 106 每种病毒接种至三个10 cm经组织培养处理的培养皿中，每皿细胞数相同。 
	注意为获得最佳结果，转染时细胞汇合度不应超过30–50%，否则可能导致病毒产量低下。</li>
	<li>转染前立即用真空泵吸除培养基，并更换为5 ml新鲜D10培养基。</li>
	<li>为每个需转染的10 cm培养皿准备一支单独的无菌1.5 ml微量离心管。</li>
	<li>将760 µl低血清培养基移入每个微量离心管中，然后小心地将40 µl转染试剂直接加入培养基中。室温下在组织培养超净台中孵育5分钟。</li>
	<li>向每根试管中加入30 µg含目的基因的MSCV载体（若使用空载体则为15 µg）以及5 µg质粒，用移液器轻轻吹打混匀。在组织培养罩内室温孵育额外15分钟。 
	注意： 较小的载体往往具有较高的病毒产量。</li>
	<li>将每个反应的总体积（约 800 µl）小心地逐滴加入相应的 10 cm 培养皿中，轻轻左右倾斜培养皿以混匀。将细胞放回加湿的组织培养孵箱中。</li>
	<li>在组织培养箱中孵育8小时或过夜后，用真空吸液瓶吸除培养基，并轻轻加入10 ml新鲜D10培养基。</li>
	<li>转染后48小时，将上清液收集至35 ml注射器中，经0.45 µm滤膜过滤以去除细胞碎片。</li>
	<li>可选：向293T细胞中重新加入10 ml新鲜D10培养基，可在转染后72小时再次收集病毒。</li>
	<li>当不再收集病毒时，将293T细胞弃置于生物危害废物中。</li>
	<li>将病毒上清液分装至单次使用体积（例如，1 ml用于病毒滴度测定，6.5 ml用于骨髓感染）。用液氮速冻病毒，并于-80 °C保存。 
	注意： 避免反复冻融，因为这会显著降低病毒滴度。</li>
</ol>
2. 通过流式细胞术测定相对病毒滴度
<ol>
	<li>解冻3T3细胞，并在D10培养基中维持培养。将细胞接种于10 cm组织培养处理皿中，在37 °C、5% CO2的加湿组织培养孵箱中培养。</li>
	<li>以三复孔进行病毒滴度测定。细胞准备步骤：加入1 ml PBS洗涤细胞，用真空瓶吸除上清液。</li>
	<li>消化细胞时，加入2 ml 0.05%胰蛋白酶，将培养皿置于37 °C、5% CO2的加湿组织培养孵箱中孵育。</li>
	<li>为终止胰酶消化，向培养皿中加入3 ml D10，将细胞转移至15 ml锥形管中，以400 × g离心10分钟。</li>
	<li>用真空瓶吸除上清液，将细胞沉淀重悬于2 ml D10中。</li>
	<li>使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数细胞。</li>
	<li>以每皿1 × 105个细胞的密度将3T3细胞接种至十五个60 mm组织培养处理皿中，过夜培养。</li>
	<li>使用D10将解冻后的病毒上清液分别稀释为1:3、1:10、1:30和1:100，总体积为1 ml。同时设置无病毒对照组。</li>
	<li>用真空瓶吸除3T3细胞的培养基，更换为4 ml D10。</li>
	<li>将不同稀释度的病毒上清液覆盖至3T3细胞上，并向每皿中加入聚凝胺（polybrene），使其终浓度为8 µg/ml。在37 °C、5% CO2的组织培养孵箱中孵育48小时。</li>
	<li>通过流式细胞术测定相对病毒滴度：
	<ol>
		<li>洗涤细胞：用真空瓶吸除培养基，加入5 ml PBS。</li>
		<li>用真空瓶吸除PBS，加入1 ml 0.05%胰蛋白酶，在37 °C孵育2–5分钟，使细胞从培养皿上脱落。</li>
		<li>加入3 ml D10，反复吹打以使残留细胞完全脱落，将细胞转移至FACS管中，以400 × g离心10分钟。</li>
		<li>倾去上清液，用3 ml PBS洗涤细胞，以400 × g离心10分钟，弃上清液，将细胞重悬于200 µl PBS中。</li>
		<li>将细胞上流式细胞仪9检测。在活细胞门控（由FSC vs. SSC确定）内采集20,000–30,000个事件，计算GFP+和GFP-细胞的百分比。 
		注意：当病毒上清液1:30稀释时，若GFP+ 3T3细胞比例达到至少50%，则认为病毒滴度合格。若该稀释度下GFP+细胞比例低于50%，可能导致转导效率不理想。病毒滴度计算方法参考Limon et al., Blood (1997)9。</li>
		<li>计算相对病毒滴度的公式为：病毒滴度 = 形成单位（PFU）/ml = [（3T3细胞数量 × GFP+细胞频率）/ 上清液体积（ml）] × 稀释倍数。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 转导供体骨髓细胞
<ol>
	<li>为准备用于骨髓（BM）采集的供体小鼠，首先使用异氟烷挥发器以5%浓度的异氟烷和1 L/min流速的补充氧气进行麻醉。通过夹捏足部评估小鼠反应性。 
	注意： 供体小鼠（8周龄以下）应在骨髓采集前5天（移植前8天）进行准备。一只供体小鼠提供的细胞足以用于至少2只受体小鼠。</li>
	<li>使用27 G × ½"针头，通过眶后静脉注射方式，向麻醉小鼠注射150 mg/kg的5-氟尿嘧啶（5-FU）。 
	警告！ 5-FU 是一种抗癌化疗药物。操作 5-FU 时务必在经认证的化学通风橱或管道式生物安全柜内进行。请咨询所在机构的实验室与动物安全委员会，以确定经 5-FU 处理小鼠的适当标识方式。
	<ol>
		<li>将麻醉后的小鼠侧置，用拇指和食指固定，使眼睛略微突出于头部。</li>
		<li>从针头位于内眦外侧、针尖斜面朝上开始，以45°角向内侧方向进针，插入至针头一半深度时停止。缓慢注射细胞，然后小心拔出针头。 
		注意： 如果该技术操作正确，眼球应轻微回缩，且针头插入时不应感到阻力。</li>
		<li>检查小鼠是否有任何损伤迹象，例如肿胀或出血。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在5-FU处理后第5天获取骨髓（移植前3天）。
	<ol>
		<li>使用异氟烷蒸气发生器（5% 异氟烷，1 L/min 氧气作为补充）对小鼠进行麻醉。通过夹捏足部评估其反应性。</li>
		<li>通过颈椎脱位处死小鼠。用70%乙醇充分喷洒小鼠体表至毛发湿润，进行消毒。</li>
		<li>使用解剖剪在皮肤上做切口，并将筋膜从腿部肌肉上分离。接着，通过在髋部切断股骨、在踝部切断胫骨，将腿部从小鼠身上分离。</li>
		<li>弯曲腿部呈 &#34;L&#34; 用解剖剪在膝关节处切割，将每根腿骨按形状分离。</li>
		<li>使用解剖剪轻轻刮除每根腿骨远端的肌肉，使肌肉向腿骨一端聚集，直至软骨脱离。</li>
		<li>使用带有27 G × ½英寸针头的注射器，将每根腿骨中的液体经100 µM尼龙膜冲洗至50 ml锥形管中，冲洗液为含2% FBS的PBS。持续冲洗至骨组织变白，以最大限度获取细胞。</li>
		<li>使用注射器的推杆将细胞通过尼龙膜压入50 ml离心管中，以获得单细胞悬液。对另一只小鼠后肢重复上述操作。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>在 4 °C 条件下以 400 × g 离心细胞 10 分钟，弃上清液。用 5 ml 氯化铵钾（ACK）缓冲液重悬骨髓细胞，以裂解红细胞。将细胞置于冰上孵育 10 分钟。</li>
	<li>用 PBS 填充管子以终止细胞裂解。在 4 °C 下以 400 × g 离心 10 分钟，弃去上清液。如果骨髓沉淀呈红色，则重复裂解步骤。</li>
	<li>用5 ml PBS重悬细胞，使用血细胞计数板通过台盼蓝排斥法计数细胞。</li>
	<li>将细胞重悬于 2 x 106 每毫升加入2×预刺激混合液，该混合液含有添加了20%胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素、IL-3（14 ng/ml）、IL-6（24 ng/ml）和SCF（112 ng/ml）的DMEM培养基。在6孔板中每孔接种2 ml。</li>
	<li>在 37 °C 和 5% CO₂ 条件下将细胞孵育过夜2.</li>
	<li>向每孔含有骨髓细胞的培养孔中加入 2 ml 病毒上清液，并加入 polybrene（8 µg/ml）。在 30 °C、1,500 × g 条件下离心 90 分钟，然后将培养板放回组织培养孵箱中过夜。</li>
	<li>将细胞悬液用移液器转移至锥形管中，在 4 °C、400 x g 条件下离心 10 分钟，不要丢弃培养板。每孔用 2 ml 新鲜的 2x 预刺激混合液重悬细胞，并将细胞返回至原来的孔中。</li>
	<li>进行2nd 通过重复步骤 3.7–3.9 进行离心接种。</li>
</ol>
4. 将供体细胞移植到受体小鼠体内
<ol>
	<li>准备同基因型受体小鼠，通过致死剂量全身照射进行移植前处理 &#60; 注射骨髓细胞前24小时。 
	注意BALB/c小鼠的致死剂量照射通常为800–900 cGy，C57B/6小鼠则为1,000–1,200 cGy10剂量通常分为两次照射，两次之间至少间隔3-4小时。</li>
	<li>继步骤 3.11，轻柔吹打上清液，将转导后的供体细胞从 6 孔板中收集至锥形管中。用 1 ml PBS 清洗每孔，收集残留细胞并加入 50 ml 锥形管中。</li>
	<li>向孔中加入0.5 ml 0.05%胰蛋白酶，于37 °C组织培养孵箱中孵育5 min。</li>
	<li>向孔中加入 1 ml D10，通过轻柔吹打使残留细胞脱落。将细胞加入步骤 4.2 中对应的离心管中，在 4 °C、400 × g 条件下离心 10 分钟，收集细胞沉淀。</li>
	<li>用 PBS 洗涤细胞，在 4 °C、400 x g 条件下离心 10 分钟。用 5 ml PBS 重悬细胞，通过台盼蓝排斥法使用血细胞计数板进行细胞计数。 
	注意：如果载体带有GFP标签，则使用流式细胞仪定量GFP阳性细胞的百分比。</li>
	<li>重悬 5 × 105 -&#160; 2 x 106 50 - 100 µl PBS 中的细胞，用于注射小鼠。</li>
	<li>使用无菌的27 G × ½"针头，通过眶后注射将细胞注入麻醉小鼠体内。 
	注意： 其他注射技术包括尾静脉、脾脏或股骨注射。
	<ol>
		<li>使用异氟烷麻醉小鼠，并通过捏足判断其反应性。</li>
		<li>将小鼠侧卧放置，用拇指和食指固定，使眼睛略微突出于头部。</li>
		<li>针尖斜面向上，以45°角将针头插入内眦外侧。 
		注意： 如果该技术操作正确，眼球应轻微回缩，且针头插入时不应感到阻力。</li>
		<li>检查小鼠是否有任何损伤迹象，例如肿胀或出血。 
		注意： 移植后数周内，小鼠的血细胞计数会偏低，因此易受感染。可采用抗生素预防或使用酸化水。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移植后一个月，通过流式细胞术检测外周血中GFP阳性细胞百分比，作为供体细胞植入情况的指标。 
	注意： 单独使用GFP无法确定细胞移植是否成功。病毒转导可能失败，但移植仍可能发生。在这种情况下，不会出现GFP+ 可检测到细胞，但移植细胞的植入是成功的。
	<ol>
		<li>用21 G × 1½英寸注射器穿刺隐静脉采集10 µl外周血，加入含100 mM EDTA的PBS中以防止凝血。</li>
		<li>加入1 ml ACK裂解液至血液中，冰上裂解10分钟。以400 × g离心10分钟，收集细胞沉淀。</li>
		<li>在真空抽滤瓶中吸去上清液，加入1 ml含2% FBS的PBS以终止裂解。在400 × g离心10 min，沉淀细胞。</li>
		<li>用真空抽滤瓶吸除上清液，将沉淀重悬于100 µl含2% FBS的PBS中。</li>
		<li>在流式细胞仪上运行样本，并在活细胞门控（由FSC确定）内收集300,000个事件 与 SSC）并计算GFP阳性细胞的百分比+ 和 GFP- 细胞9.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>移植后1个月时，还需使用全自动兽用血液学分析仪进行全血细胞计数（CBC）18 以监测疾病进展。 
	注意： 每月通过外周血中GFP百分比和全血细胞计数（CBC）监测疾病进展。</li>
	<li>实验终止时，使用异氟烷麻醉小鼠，并通过捏足评估其反应性。采用颈椎脱位法处死小鼠，取脾脏和骨髓用于组织病理学检查。 
	注意： 实验时长具有主观性，终止时间应根据预期的疾病表型进行评估。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本方案详细描述了如何在小鼠中进行骨髓移植，以重现一种由CALRdel52突变驱动的、类似于原发性血小板增多症并进展为骨髓纤维化的疾病。成功移植表达CALRdel52的细胞后，可导致血小板升高、巨核细胞扩增以及骨髓纤维化。由于骨髓移植是一个多步骤的过程，必须注意识别可能产生技术误差的环节，以避免表达目标基因的细胞植入不良，甚至导致小鼠死亡。
在转导-移植模型中，一个常被忽视的关键因素是病毒的质量。高滴度的病毒有助于实现良好的转导效率，从而为疾病建模提供坚实的基础；而使用低滴度病毒则会导致较少细胞表达目的基因。通过使用能够增加病毒与细胞接触的试剂（如聚凝胺和逆转录病毒结合蛋白）可提高转导效率。即使使用高浓度病毒，造血干细胞（HSCs）的转导仍较为困难，因为嗜鼠类逆转录病毒仅感染分裂中的细胞。&#34;预刺激&#34;培养基（含有SCF、IL-3和IL-6）的作用是诱导静息状态的HSC进入细胞周期。如果需要感染非分裂细胞，可以采用慢病毒系统作为替代方法。
另一个可能影响病毒产生的因素是所使用的转染试剂类型。最佳转染试剂应通过实验经验...

转导-移植是用于在小鼠中建立血液系统恶性肿瘤模型的一种有效方法。该技术在髓系恶性肿瘤研究中尤为有价值，最早可追溯到首次证明异位表达BCR-ABL1可在小鼠中真实再现慢性粒细胞白血病的研究1。此后，该技术进一步推动了对携带JAK2V617F和MPLW515K/L突变的骨髓增殖性肿瘤（MPN）的广泛研究。
骨髓增殖性肿瘤（MPN）是一组以成熟髓系细胞过度生成和骨髓纤维化为特征的血液系统恶性肿瘤。这类疾病通常起源于获得体细胞突变的造血干细胞的克隆性扩增，其突变基因包括 Jak2、MPL 或 CALR。通过转导-移植方法建立的 JAK2V617F 和 MPLW515K/L 小鼠模型可表现出真性红细胞增多症和骨髓纤维症的临床特征2-5。最近，也已利用转导-移植方法成功构建了携带钙网蛋白突变的 MPN 小鼠模型6。这些小鼠表现出类似原发性血小板增多症的疾病表型，包括血小板增多、巨核细胞数量增加以及骨髓纤维化。总体而言，这些模型不仅为深入理解 MPN 的分子发病机制提供了重要工具，也为在临床前条件下开发和研究治疗策略提供了有力平台。
本论文详细描述了以 CALRdel52 突变为重点的转导-移植技术。该技术涉及将经逆转录病毒转导并表达突变构建体的骨髓细胞移植到经照射的同系受体小鼠体内。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞系&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT-10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>293T 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>3T3 细胞</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;质粒&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EcoPak，也称为 pCL-Eco</td><td>Addgene</td><td>12371</td><td>可使用如 EcoPack 2-293 等逆转录病毒包装细胞系替代 EcoPak 质粒与标准 293T 细胞。其他 &amp;gamma;-逆转录病毒包膜和包装质粒可从 Addgene 等供应商获得。</td></tr><tr><td>MSCV-IRES-GFP (MIG)</td><td>Addgene</td><td>20672</td><td>其他 &amp;gamma;-逆转录病毒转移质粒可从 Addgene 等供应商获得。</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;耗材&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>27 G x 1/2&quot; 针头</td><td>BD</td><td>305620</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清</td><td>Corning</td><td>MT-35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/L-谷氨酰胺</td><td>Corning</td><td>MT-30-009-CI</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA (0.05%)</td><td>Corning</td><td>MT-25-052-CI</td><td>可自行配制</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT-21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>10 cm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Fisher</td><td>12565268</td><td></td></tr><tr><td>60 mm 培养皿</td><td>Fisher</td><td>150288</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Fisher</td><td>NC9840454</td><td></td></tr><tr><td>5-FU</td><td>Fisher</td><td>A13456-06</td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;#181;m 细胞筛</td><td>Fisher</td><td>22363549</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 锥形管</td><td>Fisher</td><td>12565270</td><td></td></tr><tr><td>6 孔板</td><td>Fisher</td><td>130184</td><td></td></tr><tr><td>FACS 管</td><td>Fisher</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m 注射器滤器</td><td>Fisher</td><td>0974061B</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>ACK 缓冲液</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>可自行配制</td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-3</td><td>Peprotech</td><td>213-13</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 IL-6</td><td>Peprotech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>重组小鼠 SCF</td><td>Peprotech</td><td>250-03</td><td></td></tr><tr><td>X-tremeGENE 9</td><td>Roche</td><td>6365809001</td><td>转染试剂</td></tr><tr><td>1.5 ml 离心管</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Accuri C6</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>X 射线照射仪</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

转导-移植是一种在小鼠中快速高效地建立人类血液系统恶性肿瘤模型的方法。该技术可实现目的基因在造血细胞中的表达，可用于研究该基因在正常和/或恶性造血过程中的作用。本方案以骨髓增殖性肿瘤（MPN）中 recently 发现的钙网蛋白（CALR）突变为示例，详细描述了如何进行转导-移植实验。在本方案中，从经5-氟尿嘧啶（5-FU）处理的供体小鼠中获取全骨髓细胞，用编码突变型CALR的逆转录病毒进行转导，然后移植到经致死剂量照射的同系受体小鼠体内。表达突变型CALR的供体细胞通过绿色荧光蛋白（GFP）进行标记。移植后的小鼠表现出MPN表型，包括外周血血小板升高、骨髓中巨核细胞增多以及骨髓纤维化。我们逐步介绍了如何制备逆转录病毒、测定病毒滴度、转导全骨髓细胞以及将细胞移植至经照射的受体小鼠。

转导-移植技术可使表达目的基因的细胞在受体小鼠中实现造血重建。图1展示了携带钙网蛋白突变的骨髓增殖性肿瘤（MPN）小鼠模型的转导-移植流程概览。简言之，使用表达CALRwt或CALRdel52的逆转录病毒去感染来自C57B/6供体小鼠的骨髓（BM）细胞。将转导后的细胞移植至经照射处理的C57B/6受体小鼠体内，供体细胞的植入通常在移植后第一个月内完成。疾病表型的迹象在移植后3个月开始显现，表现为小鼠血小板和巨核细胞数量增加，随后在移植后6至10个月出现骨髓纤维化。若供体细胞未能成功植入，小鼠可能在移植后前两周内死亡。除注射操作不当或注射过程中造成创伤外，其他技术性错误也可能导致转导细胞植入不良或小鼠死亡。例如，受体小鼠接受的照射剂量不足时，大多数造血细胞将来源于受体自身而非供体。相反，若照射剂量过高，则可能导致小鼠出现辐射诱导的疾病甚至死亡。病毒滴度过低将导致供体细胞感染效率下降，结果仅有少量供体细胞表达目的基因，从而可能导致小鼠无法表现出预期的表型。因此，使用高滴度病毒对供体细胞进行转导至关重要。图2展...

本文描述了建立转导-移植小鼠模型所使用的方法学。详细阐述了进行骨髓移植时应避免的技术性错误。读者应清楚理解高病毒滴度、转染/转导以及照射的重要性。

转导-移植是建立人类血液系统恶性肿瘤小鼠模型的一种快速高效的方法。该技术可实现……的表达

本实验的总体目标是利用转导-移植方法，获得在造血细胞中表达目的基因的小鼠。该方法可在较短时间内帮助判断目的基因是否诱导血液系统恶性肿瘤。由于该技术能够快速构建可用于测试潜在治疗药物的小鼠模型，因此在血液系统恶性肿瘤的治疗和诊断方面具有广泛的应用前景。尽管该方法可为血液系统恶性肿瘤提供研究线索，也可用于研究目的基因在正常造血过程中的作用。通常，初次进行该实验的人员会遇到困难，因为该实验包含多个步骤。此外，产生高滴度的病毒对于本实验的成功至关重要。该操作的可视化演示非常重要，因为小鼠操作较为困难，需要反复练习。按照文本方案确认小鼠麻醉深度后，将小鼠侧卧放置，用拇指和食指固定动物，使眼睛略微突出于头部。通过眶后注射方式给予每千克体重150毫克的5-氟尿嘧啶（5-FU）时，将一支27号半英寸针头以45度角刺入，针尖斜面朝上，方向朝内侧，当针头插入至一半深度时停止。缓慢注射溶液，然后小心拔出针头。观察小鼠是否有损伤迹象，如肿胀或出血，并确保小鼠恢复并开始行走。五天后，按照文本方案处死动物，使用70%乙醇充分喷洒小鼠体表至毛发湿润，以进行消毒。用解剖剪在皮肤上做切口，并将筋膜从腿部肌肉上分离。然后在髋部切断股骨，在踝部切断胫骨，将腿部从鼠体上分离下来。将腿部弯成L形，用解剖剪在膝关节处剪断，分离每根腿骨。然后，轻轻将肌肉从腿骨的一端刮离，直至软骨完全分离。接着，使用带有27号半英寸针头的注射器，以添加了2% FBS的PBS缓冲液冲洗每根腿骨，冲洗液需滤过100微米尼龙膜，收集至50毫升锥形管中，直至骨骼变白，以最大程度获取细胞。用注射器活塞将细胞碾压通过尼龙膜，进入50毫升锥形管，从而获得单细胞悬液。用同样的方法处理另一侧小鼠后肢。将收集的细胞在4℃下以400 × g离心10分钟，弃去上清液。随后加入5 mL氯化铵-氯化钾（ACK）溶液重悬骨髓细胞。将细胞悬液置于冰上孵育10分钟，以裂解红细胞。使用PBS填充离心管以终止裂解反应。然后再次离心细胞，并弃去上清液。用 5 毫升 PBS 重悬细胞，并使用台盼蓝排斥法通过血细胞计数板计数细胞。随后，加入 2 倍预诱导干细胞培养基，将细胞重悬至每毫升含 2 × 10⁶ 个细胞的浓度。然后，每孔加入 2 毫升细胞悬液至 6 孔板的各孔中。将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。孵育结束后，向每孔加入2毫升病毒上清液，随后加入8微克/毫升的聚凝胺。在30摄氏度下以1500 × g 离心90分钟。然后将培养板放回培养箱中过夜。用移液器将细胞悬液转移至锥形管中，在4°C条件下以400 × g离心10分钟。每孔使用2倍预诱导干细胞培养基重悬细胞，并重新接种至原始孔中。根据文本方案准备好用于移植的受体小鼠后，用移液器轻轻将转导供体细胞从六孔板中吸出，转移至锥形管。每孔用一毫升 PBS 清洗，并将残留细胞收集至管中。每孔加入 0.5 毫升 0.05% 胰蛋白酶，于 37 摄氏度孵育五分钟。接着，向孔中加入一毫升 D-10，并通过轻柔吹打使残留细胞脱落。然后将细胞加入相应的离心管中，在 4 摄氏度下以 400 × g 离心 10 分钟。用 PBS 再次洗涤细胞。然后，离心后用 5 毫升 PBS 重悬细胞，并使用台盼蓝排斥法和血细胞计数板对细胞进行计数。用于小鼠注射时，将 5 × 10⁵ 至 2 × 10⁶ 个细胞重悬于 50 至 100 微升 PBS 中。将小鼠侧置，用拇指和食指固定，使眼睛从头部略微突出。针尖斜面朝上，以45度角将针头插入内眦外侧并注射。注射后，检查小鼠注射部位是否有损伤迹象，如肿胀或出血，并参照文字方案进行额外的注射后护理。最后，根据文字方案分析血液中GFP的表达。该图展示了如何计算相对病毒滴度，其中GFP阳性百分比是根据从活细胞门控收集的事件计算得出的。图中显示的是每个细胞含有一个以上病毒颗粒的滴度，而这些样本代表每个细胞含有单个病毒颗粒的滴度。理想情况下，使用病毒上清液1:30稀释时，可检测到至少50%的GFP阳性细胞。本实验展示了一例成功的移植受体，其中CALRdel52小鼠表现出骨髓增殖性肿瘤（MPN）表型，血小板增多、骨髓中巨核细胞增多以及骨髓纤维化。若操作得当，掌握该技术后可在八天内完成。在进行该操作时，遵循方案的每一步骤至关重要。该技术建立后，为研究人员探索特定基因在造血过程中的作用开辟了道路。观看本视频后，您应能够充分掌握如何构建在造血细胞中表达目标基因的小鼠模型。

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骨髓增殖性疾病的转导移植小鼠模型

本视频展示了如何利用同种异体造血干细胞和可诱导移植物抗宿主病（GvHD）的脾源性异反应性T淋巴细胞，在经致死剂量照射的受体小鼠中诱导肠道移植物抗宿主病。该实验方案有助于建立严重的急性肠道GvHD模型，以深入理解该疾病的发病机制，并开发创新的治疗策略。...

通过同种异体骨髓与脾细胞移植在小鼠模型中诱导移植物抗宿主病

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逆转录病毒感染骨髓前体细胞以生成T细胞受体逆转录转基因小鼠

在此，我们采用生物发光、X射线以及正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像技术，研究抑制mTOR活性对异种移植模型中骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的影响。该方法可对靶向骨髓植入性骨髓瘤肿瘤的治疗手段的抗骨髓瘤效应进行符合生理条件的、无创的和多模态的分析 体内.

NOG小鼠中多发性骨髓瘤骨髓异种移植的多模态生物发光与正电子发射断层扫描/计算机断层扫描成像

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利用造血干细胞移植评估骨髓增生异常综合征的起源

移植物抗宿主病是异基因骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植物抗宿主病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病发生以及移植物抗白血病效应中的作用。...

用于研究树突状细胞在移植物抗宿主病中作用的骨髓移植平台

我们描述了将经携带双报告基因载体（表达荧光素酶-绿色荧光蛋白（GFP））转导的人类神经前体细胞移植至小鼠脑实质内的方法。移植后，利用活体成像系统反复检测荧光素酶信号。 体内 利用荧光显微镜在脑组织切片中鉴定表达生物发光和GFP的移植细胞。...

颅内移植与 体内 小鼠大脑中人神经前体细胞的生物发光示踪

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在表达Delta样4的基质细胞上共培养和转导小鼠胸腺细胞以研究T细胞白血病中的癌基因

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腹腔内移植法建立小鼠急性髓系白血病模型

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小鼠脊髓内肿瘤细胞的手术移植

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急性淋巴细胞白血病诱导化疗后白血病复发的小鼠模型

学习转导移植技术建立小鼠模型，利用高滴度病毒转导造血细胞并移植，研究基因在血液恶性肿瘤和正常造血中的作用。该方法可加速治疗策略开发与血液疾病研究。

骨髓增殖性肿瘤的转导-移植小鼠模型

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