Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

该协议的总体目标是描述使用原子力显微镜测量小鼠主动脉离体弹性模量的程序。这种方法有助于回答血管生物力学和疾病领域的关键问题，例如心血管疾病和衰老。该技术的主要优点是 AFM 表征了软生物样品（如动脉和细胞）的生物力学特性，在达诺尺度水平上具有很高的准确性。

我将介绍 AFM 程序，我们实验室的助理研究员 Shu-lin Liu 博士将展示如何分离小鼠主动脉。首先，对小鼠实施安乐死并将其解剖至主动脉，如随附的文本协议中所述。使用一把小镊子抓住主动脉周围的脂肪，然后用一把小剪刀小心地剪掉主动脉周围的脂肪。

接下来，用镊子轻轻抓住主动脉，在升主动脉的起点切开血管，在腹主动脉上方的降主动脉末端切开另一道。将解剖的主动脉转移到含有不含钙或镁的 PBS 的 60 毫米培养皿中。在培养皿中，继续从主动脉中解剖掉任何残留的脂肪组织，然后纵向打开主动脉。

接下来，从降主动脉切下一块 2 毫米 x 4 毫米的块，从主动脉弓切下一块相同大小的块，以便使用原子力显微镜进行分析。将这些组织片放入新鲜的 60 毫米塑料培养皿中，并在一滴 PBS 中保持湿润。使用实验室湿巾小心地去除组织周围的 PBS，不要接触主动脉。

确保组织的管腔侧朝上，并使用 5 到 10 微升的氰基丙烯酸酯粘合剂轻轻地将打开的主动脉的每一端粘在板上。在此过程中，主动脉不能被拉伸，这一点至关重要。完成后，检查胶合的主动脉是否未折叠或漂浮。

将主动脉上的胶水风干 30 至 60 秒后，轻轻加入 PBS 并浸入样品中。使用镊子将带有球形尖端的硅硝酸盐 AFM 探针滑到探针支架上。然后，将探针支架牢固地固定在 AFM 头的 ZScanner 支架上。

接下来，打开 AFM 软件。通过转到 Experiment Category 并选择 Contact Mode 来选择实验类型。然后，转到 Experiment Group 并选择 Contact Mode in Fluid，最后转到 Experiment 并选择 Contact Mode in Fluid。

选择这些后，单击 Load Experiment 。这将打开激光。接下来，按照随附的文本协议中的说明准备用于对准激光器的样品。

将样品放在 AFM 上。通过调整激光定位旋钮，将激光点定位到 AFM 探针的尖端。然后，使用探测器定位旋钮调整光电二极管的位置，直到 Vertical Deflection 的值介于 0 和负 1 伏之间，并且 Horizontal Deflection 接近零伏。

接下来，检查激光 Sum 信号是否最大化。如有必要，重新调整激光束在 AFM 针尖上的位置和光电二极管的位置，以获得最大的和信号。要开始校准，请选择 check parameters（检查参数），然后将 Scan Size （扫描大小） 的参数设置为零。

将 Scan Rate 设置为 1 赫兹。将 Sample/Line 设置为 256，将 Deflection 设定点设置为 20 纳米。然后选择 Engage （参与）。

探针与板表面接触后，单击 Ramp。接下来，在扫描工具栏菜单中选择 expanded mode，并设置参数，如下所示。在斜坡工具栏中，选择 ramp continuus，然后在板上获得力曲线。

在此力曲线中，将通道 1 设置为 Deflection Error，以允许软件将结果绘制为垂直偏转与 Z 位置的关系。单击力曲线的左端或右端，然后拖动光标以包含将与直线拟合的力曲线的线性区域。然后，在工具栏中选择 Ramp 并单击 Update Sensitivity。

记录当前值。接下来，选择 Calibrate（校准），然后单击 Detector（检测器）。Deflection Sensitivity （偏转灵敏度） 框中 5 次测量的输入值和平均值。

单击 Withdraw 两到三次，以抬起 AFM 头并防止在热调谐过程中 AFM 针尖和板之间的相互作用。然后，单击工具栏中的 Thermal Tune。将 Thermal Tune 范围设置为 1 到 100 kHz 之间，并将 V 形悬臂的 Deflection Sensitivity Correction 设置为 1.144，矩形悬臂的 Deflection Sensitivity Correction 设置为 1.166。

在 Thermal Tune 菜单中，单击 Acquire Data 以获取热调谐曲线。接下来，将红色虚线放在曲线两侧的线上，然后选择洛伦兹模型或简单谐振子模型，具体取决于哪个模型更适合数据。然后，单击 拟合数据 并选择 计算弹簧 K 以保存此值。

将含有主动脉组织的 60 毫米培养皿放在显微镜载物台上，并用磁性板支架固定板。主动脉与悬臂啮合后，确保压电中心稳定，然后单击 Ramp。将 Ramp size 设置为 3 微米，将 Trigger 模式设置为 Relative，并将 Trigger threshold 设置为 100 纳米。

然后选择 ramp continuous （斜坡连续）。观察探针和样品之间的接触点大约出现在 Z 斜坡循环的下四分之三的中心。如果未观察到这种情况，请与样品分离，根据需要调整 ramp 大小，然后重新接合样品。

接下来，单击菜单栏中的 Microscope，然后选择 Engage Settings。将 SPM 抽出量更改为 30 微米，然后单击 OK（确定）。观察力曲线后，单击菜单栏中的 Capture，然后选择 Capture Filename。输入以 OOO 结尾的所需文件名，选择指定的文件夹，然后保存数据。

要开始分析，请打开力曲线分析软件，加载要分析的文件，然后按照随附的文本协议中的说明修改和平滑数据。接下来，在菜单栏中选择 Baseline Correction，并设置输入，如下所示。然后，调整图表上的蓝色垂直虚线以包含力曲线的平坦部分，然后单击 Execute。

接下来，单击工具栏菜单中的 Indentation，并设置输入，如下所示。保存这些值，并通过测量每个区域在彼此较小距离内拍摄的 5 条力曲线来分析每个感兴趣区域的杨氏模量。为了确定组织样品的整体刚度，应在组织内样品区域的 5 个不同区域进行多达 25 次测量。

这些区域可用于比较不同位置的组织，例如主动脉弓和降主动脉。在这些图表中，降主动脉和主动脉弓的代表性力曲线来自同一小鼠主动脉样本。根据这些数据，可以计算每组的弹性模量，并用于比较不同区域或条件之间的弹性模量。

观看此视频后，您将对如何正确隔离小鼠主动脉并通过原子力显微镜测量弹性模量有很好的了解。尝试此程序后，请务必记住在组织分离后立即进行 AFM 测量。一旦掌握，每只小鼠可以在大约 45 分钟内完成主动脉的分离，如果执行得当，AFM 测量和分析可以在一个半小时内完成。

在此程序之后，可以进行其他方法，如免疫荧光或增殖测定，以回答与血管重塑或血管平滑肌细胞增殖相关的其他问题。