测量刚度 离体 利用原子力显微镜检测小鼠主动脉

本实验方案的总体目标是描述利用原子力显微镜测量小鼠主动脉离体弹性模量的操作步骤。该方法有助于回答血管生物力学及疾病领域中的关键问题，例如心血管疾病和衰老相关的研究。该技术的主要优势在于，原子力显微镜能够在纳米尺度上以高度精确度表征动脉和细胞等软性生物样品的生物力学特性。

我将介绍原子力显微镜（AFM）的操作流程，由本实验室的研究助理刘书林博士演示如何分离小鼠主动脉。首先，按照随附的文字版实验方案，处死一只小鼠并解剖至暴露主动脉。使用一对小镊子夹住主动脉周围脂肪组织，再用小型剪刀小心剪除主动脉周围的脂肪。

接下来，用镊子轻轻夹住主动脉，在升主动脉起始处沿血管剪开一个切口，再在降主动脉末端、腹主动脉上方剪第二个切口。将分离出的主动脉转移至一个含有不含钙和镁的磷酸盐缓冲液（PBS）的60毫米培养皿中。在培养皿中，继续清除主动脉上残留的脂肪组织，然后沿纵轴方向剪开主动脉。

接下来，从降主动脉和主动脉弓分别切取一块 2 毫米 × 4 毫米的组织，用于原子力显微镜分析。将这些组织样本放入一个新的 60 毫米塑料培养皿中，并用一滴 PBS 保持其湿润。使用实验室擦拭纸小心吸除组织周围的 PBS，注意不要触碰主动脉组织。

确保组织的管腔面朝上，使用5到10微升的氰基丙烯酸酯粘合剂，轻轻将打开的主动脉两端粘附于板上。此过程中必须避免拉伸主动脉。操作完成后，检查粘附的主动脉是否无折叠、无漂浮。

将胶水在主动脉上晾干 30 至 60 秒后，轻轻加入 PBS 并浸没样本。使用镊子将带有球形尖端的硅硝酸盐原子力显微镜探针滑入探针支架中。然后，将探针支架牢固地固定在原子力显微镜探头的 ZScanner 安装座上。

接下来，打开原子力显微镜（AFM）软件。通过进入实验类别并选择接触模式来确定实验类型。然后，进入实验组并选择液体中的接触模式，最后进入实验并选择液体中的接触模式。

选择完成后，单击“加载实验”。这将启动激光器。接下来，按照随附的文字实验方案制备用于校准激光器的样品。

将样品放置到原子力显微镜（AFM）上。通过调节激光定位旋钮，将激光光斑对准AFM探针的尖端。然后，使用探测器定位旋钮调节光电二极管的位置，直至垂直偏转的数值介于0至-1伏特之间，水平偏转接近0伏特。

接下来，检查激光总和信号是否达到最大。如有必要，重新调整激光束在原子力显微镜（AFM）针尖上的位置以及光电二极管的位置，以获得最大的总和信号。开始校准前，选择检查参数，并将扫描尺寸（Scan Size）参数设置为零。

将扫描速率设置为1赫兹。将每行采样点数设置为256，设定偏转设定点为20纳米。然后选择“Engage”。

当探针与培养板表面接触后，点击“Ramp”。接着，在扫描工具栏菜单中选择扩展模式，并按此处所示设置参数。在 ramp 工具栏中选择 ramp continuus，然后在培养板上获取力曲线。

在此力曲线中，将通道1设置为偏转误差，以便软件将结果绘制成垂直偏转与Z位置的关系图。单击力曲线的左端或右端，并拖动光标以框选力曲线中将用直线拟合的线性区域。然后，在工具栏中选择 Ramp，并单击更新灵敏度。

记录当前数值。接着，选择校准，然后点击探测器。将五次测量结果的平均值输入至“偏转灵敏度”框中。

点击“撤回”两到三次，以抬升原子力显微镜（AFM）探头，防止在热调谐过程中AFM针尖与样品台发生相互作用。然后，在工具栏中点击“热调谐”。将热调谐范围设置为1至100千赫兹，并将V型悬臂梁的挠度灵敏度校正设为1.144，矩形悬臂梁的设为1.166。

在“热调谐”菜单中，点击“采集数据”以获取热调谐曲线。接着，在曲线两侧放置红色虚线，并根据数据拟合效果选择洛伦兹模型或简谐振子模型。然后，点击“拟合数据”，并选择“计算弹簧常数 K”以保存该数值。

将含有主动脉组织的60毫米培养皿放置在显微镜载物台上，并用磁性培养皿固定器固定培养皿。当主动脉与悬臂梁接触后，确保压电陶瓷中心位置稳定，然后点击“Ramp”。将 Ramp 大小设置为3微米，触发模式设置为相对（Relative），触发阈值设置为100纳米。

然后选择连续斜坡模式。观察探针与样品接触的点是否出现在Z轴斜坡周期的下半部分约中心至四分之三位置处。如果未观察到此现象，请先退出样品，根据需要调整斜坡大小，然后重新接近样品。

接下来，单击菜单栏中的 Microscope，然后选择 Engage Settings。将 SPM withdraw 改为 30 微米，然后单击 OK。观察力曲线后，单击菜单栏中的 Capture，然后选择 Capture Filename。输入以 OOO 结尾的所需文件名，选择指定文件夹，然后保存数据。

开始分析时，打开力曲线分析软件，加载待分析的文件，并按照随附的文字实验方案所述对数据进行修改和 smoothing 处理。接下来，在菜单栏中选择基线校正（Baseline Correction），并按此处所示设置输入参数。然后，调整图中垂直的蓝色虚线，使其包含力曲线的平坦部分，再点击执行（Execute）。

接下来，在工具栏菜单中点击“缩进”（Indentation），并按此处所示设置输入参数。保存这些数值后，通过在每个区域内相邻位置采集五条力曲线，来分析各个目标区域的杨氏模量。为确定组织样本的整体刚度，应在组织样本区域内的五个不同位置进行测量，每个位置最多采集25个测量值。

这些区域可用于比较不同位置的组织，例如主动脉弓和降主动脉。在这些图中，显示了来自同一个小鼠主动脉样本的降主动脉和主动脉弓的代表性力-位移曲线。根据这些数据，可以计算出每组的弹性模量，并用于比较不同区域或条件之间的差异。

观看本视频后，您将能够充分掌握如何正确分离小鼠主动脉，并通过原子力显微镜测量其弹性模量。在尝试该操作时，需注意在组织分离完成后立即进行原子力显微镜（AFM）测量。一旦熟练掌握，每只小鼠的主动脉分离过程约需45分钟，若操作得当，AFM测量及分析可在一个半小时内完成。

采用此方案后，可进一步开展免疫荧光或增殖检测等其他方法，以回答与血管重塑或血管平滑肌细胞增殖相关的其他问题。