磷脂Scramblase活动的基于荧光的测定法

我们描述了一种基于荧光的测定法，用于测量用视蛋白重构的大单层脂质体中的磷脂加扰。

该程序的总体目标是将典型的 G 蛋白偶联受体重构为大的单层囊泡，并使用基于荧光的测定法测量其在脂质双层上进行磷脂 80p 独立易位的能力。这种方法可以帮助回答细胞间脂质运输领域的关键问题，例如可以扰乱脂质的蛋白质的分子身份是什么，它们的机制是什么。这种技术的主要优点是它非常可靠和健壮。

一旦为给定的脂质成分和首选洗涤剂建立了重构程序。要开始此过程，请使用玻璃注射器将 1435 微升每毫升 25 毫克的 POPC 和氯仿溶液添加到圆底烧瓶中。加入 160 微升每毫升 25 毫克的 POPG 和氯仿溶液，以 9：1 的 POPC 与 POPG 摩尔比获得 52.5 微脂肪。

接下来，使用设置为 145 RPM 的旋转蒸发器将脂质干燥 30 分钟。干燥完成后，将培养瓶移至真空干燥器中，在室温下放置 3 小时。然后，加入 10 毫升缓冲液 A 以水合死亡的脂质膜。

轻轻旋转培养瓶，直到形成均匀浑浊的悬浮液。在室温水浴中以 40 kHz 的频率对悬浮液进行超声处理 10 分钟。然后，使用挤出机将样品穿过孔径为 400 纳米的膜 10 倍。

然后进行第二个挤出循环，将样品穿过孔径为 200 纳米的膜四次。将得到的明显更清晰的悬浮液放在一边，其中包含直径约 175 纳米的 phospolipids 的大单层囊泡。挤出完成后，按照文本方案中的说明，在 13 x 100 毫米的玻璃管中制备标准品。

然后，将 10 微升每种 LUV 和蛋白脂质体样品添加到独特的玻璃管中，并用 40 微升去离子蒸馏水稀释。向每管中加入 300 微升高氯酸，并在加热块中以 145 摄氏度加热 1 小时。在每个试管上放置一个弹珠以防止蒸发。

然后让试管冷却至室温，并向每个试管中加入 1 毫升去离子蒸馏水。向每种溶液中加入 400 微升新鲜制备的溶液，每升含有 12 克钼酸铵和 50 克抗坏血酸钠，涡旋混合。使用弹珠在 100 摄氏度下加热试管 10 分钟，以防止蒸发。

然后从加热块中取出管子，让它们冷却至室温。使用设置为 797 纳米的光谱仪，使用标准液获得校准曲线。然后，测量样品对空白物的吸光度，并确定磷酸盐含量。

首先将 800 μL 每种挤出的 LUV 悬液移液到独特的 2 mL 微量熔注管中。向每个试管中加入 5.3 微升缓冲液 A 和 34.7 微升 10% 质量/体积 DDM，溶于缓冲液 A 中。接下来，将样品在室温下孵育 3 小时，并进行端到端混合。

样品孵育时，在玻璃烧杯中称取每个样品的微珠 400 毫克。每份甲醇样品含 5 mL，洗涤微珠，缓慢搅拌 10 分钟。对甲醇重复一次洗涤，用水重复 3 次，用缓冲液重复洗涤一次 A.在样品孵育的最后 30 分钟内，在氮气流下，在螺旋盖玻璃管中干燥每样品 9.5 μL 的 NBD 标记磷脂。

然后，在缓冲液 A 中加入每样品 45 微升 0.1% 质量/体积的 DDM，以溶解干燥的磷脂。孵育完成后，向每个样品中加入溶解的 MBD 标记的磷脂溶液。然后，按顺序添加所需量的 0.1%DDM、缓冲液 A 和 DDM 溶解的视蛋白，以获得 1 毫升的最终体积，浓度为 7 毫摩尔 DDM。

蛋白的重建是通过用足够的洗涤剂处理囊泡来实现的，这样膨胀就不会溶解。而且这些条件必须根据经验找到每种脂质成分和洗涤剂，蛋白质将整合到脂质体中。在室温下混合样品 1 小时。

然后，向每个试管中加入 80 毫克制备好的聚苯乙烯珠子，并在室温下再次孵育 1 小时，并进行端到端混合。向每个样品中额外添加 160 毫克聚苯乙烯珠子，并在室温下孵育 2 小时，并进行端到端混合。孵育完成后，将样品转移到干净的玻璃管中，留下珠子，每个玻璃管含有 160 毫克新鲜珠子。

4 摄氏度下首尾混合过夜，避光。接下来，将样品（不含磁珠）转移到独特的微熔丝管中。将试管放在冰上，为加扰酶活性测定做准备。

首先将 1950 微升缓冲液 A 添加到包含塑料搅拌棒的塑料小隔间中。然后，加入 50 微升制备的蛋白酶脂质体样品。让样品在荧光光谱仪中平衡，不断搅拌 5 秒钟。

当样品平衡时，制备 1 摩尔连二亚硫酸盐在 0.5 摩尔无缓冲 tris 中的溶液。以 470 纳米的激发波长、530 纳米的发射波长和 0.5 纳米的狭缝宽度开始荧光监测。录制 50 秒以获得稳定的信号。

然后，向小方间中加入 40 微升 1 摩尔连二亚硫酸盐溶液。记录荧光至少 500 秒。最后，按照文本协议中的概述分析数据。

为了对荧光数据进行完整分析，当需要确定无法重构的囊泡的比例时。重组囊泡中蛋白质和脂质的回收率以及囊泡的大小分布。在这项研究中，视蛋白被重构成大的单层囊泡，以使用基于荧光的测定来表征其扰乱酶活性。

囊泡用 NBD-PC 重构，NBD-PC 在外小叶和内小叶之间均匀分布。连二亚硫酸盐将囊泡外部的 NBD 硝基还原为非荧光氨基，导致无蛋白脂质体中的荧光减少 50%。然而，当视蛋白促进 NBD 在内小叶和外小叶之间移动时，会发生荧光完全丧失。

这种方法在不同蛋白质与磷脂比率下的代表性结果可以在这里看到。荧光减少的扩展范围随着重构成囊泡的视蛋白量的增加而增加，范围从 0 到 4.95 μg。在指定时间加入连二亚硫酸盐，并监测 NBD 荧光 400 秒。

在较高的蛋白质与磷脂比率下，荧光减少更显着，最大减少为 85%然后使用终点荧光减少来确定扰酶活性的概率，即使用 Polson 统计的囊泡至少有一个扰酶的可能性。红色曲线表示视蛋白的单指数拟合。而灰色虚线表示视蛋白重组为囊泡的单指数拟合，如单体、预形成的二聚体或预形成的四聚体。

我们描述的方法可以很容易地适应不同的需求。这些程序用途广泛，将来可用于鉴定和表征其他膜蛋白的磷脂加扰酶活性。重构程序可应用于任何膜蛋白。

这项技术使我们能够将视蛋白确定为第一个经过生化验证的磷脂加扰酶，然后使我们能够表征蛋白质不同确认状态的活性，以及它运输不同脂质的能力。