Name: 荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: 学习使用荧光各向异性技术定量分析SBDS与EFL1蛋白质相互作用的方法。该技术为研究蛋白质生物化学和生物物理学提供重要的定量与定性数据，有助于深入理解细胞功能相关的蛋白质相互作用机制。

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作者感谢来自CONACyT项目167359和177138以及DGAPA-UNAM项目IN201615的经费支持。

1. SBDS-FlAsH 标签蛋白的表达与纯化
注意：在各向异性实验中，通过 PCR 将对应于 Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys 序列的 FlAsH 标签添加至人源 SBDS 编码序列的 C 末端。将该构建体亚克隆至表达载体 pRSET-A 中，并转化入 Escherichia coli C41 细胞，以表达包含 N 末端六聚组氨酸标签（His 标签）、人源 SBDS 编码序列及 C 末端 FlAsH 标签的蛋白10。
<ol>
	<li>SBDS-FlAsH 蛋白表达
	<ol>
		<li>使用标准热激法将质粒 pRSET-HisSBDS-FlAsH 转化至感受态 E. coli C41 细胞中19。将细胞接种于添加了 100 µg/ml 氨苄青霉素的固体 Luria-Bertani (LB) 培养基上。LB 固体培养基的成分为每升含 10 g NaCl、5 g 酵母提取物、10 g 胰蛋白胨和 20 g 琼脂。</li>
		<li>在添加了 100 µg/ml 氨苄青霉素的 1 L 液体 LB 培养基中，于 37 °C 培养转化后的细菌，直至 600 nm 波长处的吸光度（A600）达到 0.5–0.7。</li>
		<li>加入 0.5 mM 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside）诱导蛋白表达，并继续孵育 5 小时。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 3,800 × g 离心 10 分钟收集菌体悬浮液，弃去上清液。此时可将菌体沉淀在 -20 °C 保存，或立即用于蛋白纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>SBDS-FlAsH 蛋白纯化 
	注意：所有层析步骤均使用快速蛋白液相色谱（FPLC）系统或蠕动泵进行。Ni2+-亲和层析使用 5 ml 快流速柱，阴离子交换层析使用 5 ml 强磺丙基阳离子交换柱。所有层析步骤的流速均为 3 ml/min。
	<ol>
		<li>将菌体重悬于 35 ml SBDS 裂解缓冲液（50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.5，300 mM NaCl，20 mM 咪唑）中，加入 1 mM 苯甲基磺酰氟（PMSF），并在 4 °C 条件下进行超声破碎，总时长 4 分钟，采用 10 秒开启、30 秒关闭的循环模式。</li>
		<li>在 4 °C 条件下以 9,000 × g 离心 50 分钟。</li>
		<li>保留上清液，弃去沉淀，以去除细胞碎片。</li>
		<li>用 3 个柱体积（CV）的 SBDS 裂解缓冲液平衡 Ni2+ 亲和柱，并将全部澄清后的上清液上样至柱中。</li>
		<li>用 3 CV 的 SBDS 裂解缓冲液洗涤未结合的蛋白，然后用 3 CV 的 SBDS 洗脱缓冲液（50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 7.5，300 mM NaCl，250 mM 咪唑）洗脱目标蛋白。</li>
		<li>将洗脱的蛋白用 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.5）稀释 6 倍，并通过 0.22 µm 纤维素膜过滤，以去除可能存在的聚集体。</li>
		<li>用 3 CV 的低盐 S 柱缓冲液（50 mM 磷酸盐缓冲液 pH 6.5，50 mM NaCl）平衡磺丙基阳离子交换柱，并将上一步获得的蛋白样品上样。</li>
		<li>用 3 CV 的低盐 S 柱缓冲液洗涤未结合物质，并用含 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.5）和 1 M NaCl 的洗脱液一步洗脱蛋白。</li>
		<li>将洗脱的蛋白用 50 mM 磷酸盐缓冲液（pH 6.5）稀释 3.3 倍。使用超滤装置在 3,800 × g 离心 15 分钟进行浓缩。将蛋白在液氮中速冻，并保存于 -80 °C 以备后续使用。</li>
		<li>通过 SDS-PAGE 分析及考马斯亮蓝染色验证蛋白纯度20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. EFL1 蛋白的表达与纯化
注意：EFL1 在质粒 pRS426 中由 Gal 1/10 双向启动子21和Saccharomyces cerevisiae MATA 3'非翻译区（3'UTR）调控表达。该重组蛋白编码人源 EFL1 亚型 1，其C末端融合了烟草蚀刻病毒蛋白酶（TEV）识别位点和六组氨酸标签。
<ol>
	<li>EFL1 蛋白表达
	<ol>
		<li>使用标准的乙酸锂方法将质粒 pRS426-EFL1TevHis 转化至 S. cerevisiae BCY123 细胞中22。将所有转化后的细胞接种于不含尿嘧啶的合成缺陷型培养基（SD-URA）中，该培养基添加 2%（w/v）葡萄糖。SD-URA 培养基的组成为：每升含 8 g 无氨基酸酵母氮源基础培养基、11 g 酪蛋白氨基酸、55 mg 硫酸腺嘌呤、55 mg 酪氨酸、60 mg 亮氨酸和 60 mg 色氨酸。</li>
		<li>在 30 °C 下培养转化酵母，直至在添加 0.5%（w/v）葡萄糖的 1 L SD-URA 培养基中 A600 达到 1.8。</li>
		<li>通过向培养物中加入 2.8%（w/v）半乳糖诱导蛋白表达，并在 30 °C 下继续孵育 18 小时。</li>
		<li>在 4 °C 下以 3,800 × g 离心 10 分钟收集酵母悬液，弃去上清液。此时可将细胞沉淀在 -20 °C 保存，或立即用于蛋白纯化。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>EFL1 蛋白纯化 
	注意：所有层析步骤均使用 FPLC 系统或蠕动泵进行。Ni2+-亲和层析采用 5 ml 快流速柱，流速为 3 ml/min。尺寸排阻层析采用预装 Superdex 200 树脂的 125 ml 柱，流速为 1 ml/min。
	<ol>
		<li>将细胞重悬于 50 ml EFL1 裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8，300 mM NaCl，20 mM 咪唑，5 mM MgCl2，10% 甘油）中，添加 1 mM PMSF 和 1 mM 苄脒，在 4 °C 下使用玻璃珠（直径 = 0.5 mm）通过珠磨破碎仪进行细胞破碎，总时间为 6 分钟，采用 2 分钟开启、15 分钟关闭的循环模式。</li>
		<li>在 4 °C 下以 9,000 × g 离心 50 分钟。</li>
		<li>保留上清液，弃去沉淀以去除细胞碎片。</li>
		<li>用 3 个柱体积（CV）的 EFL1 裂解缓冲液平衡 Ni2+ 亲和柱，并将所有澄清后的上清液上样至柱中。</li>
		<li>用 3 个柱体积的 EFL1 裂解缓冲液洗涤以去除未结合蛋白，然后用 3 个柱体积的 EFL1 洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 8，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，5 mM MgCl2，10% 甘油）进行洗脱。</li>
		<li>用 1.5 个柱体积的各向异性缓冲液（50 mM Tris-HCl pH 7.5，300 mM NaCl，5 mM MgCl2，10% 甘油，5 mM β-巯基乙醇）平衡尺寸排阻柱。</li>
		<li>使用超滤装置将 Ni2+ 亲和柱洗脱得到的 EFL1 蛋白浓缩至 1 ml，在 3,800 × g 离心至目标体积后，将样品上样至尺寸排阻柱。</li>
		<li>收集洗脱的蛋白，并通过超滤浓缩至最终浓度约为 30 µM。将蛋白在液氮中速冻后于 -80 °C 保存备用。通过 SDS-PAGE 分析及考马斯亮蓝染色验证蛋白纯度20。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 使用FlAsH荧光染料4',5'-双(1,3,2-二硫砷烷-2-基)荧光素标记SBDS-FlAsH
<ol>
	<li>在5 µl各向异性缓冲液中，将3 nmol SBDS-FlAsH蛋白与3 nmol 4',5'-双(1,3,2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素染料混合。</li>
	<li>在4 °C下反应8小时。将样品在各向异性缓冲液中透析过夜，以去除游离染料。</li>
	<li>使用朗伯-比尔定律定量标记蛋白的百分比。使用适当体积的石英比色皿，在分光光度计中测定280 nm和508 nm处的吸光度。注意：考虑以下摩尔吸光系数（M-1 cm-1）： 
	<img alt="公式中的吸光系数，光谱学背景，光学研究，染料分析。" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1B.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1B"></li>
	<li>使用公式2计算标记的SBDS-FlAsH蛋白浓度。 
	<img alt="吸光度方程 A₅₀₈=Cₛᵦdₛ₋fₗₐₛₕ·l·ε₅₀₈，用于染料浓度，光谱分析。" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq2.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation2"></li>
	<li>通过代入上一步计算得到的CSBDS-FlAsH，使用公式3计算总SBDS蛋白浓度。 
	<img alt="蛋白-染料吸光度的光谱方程公式，A=ε·c·l；教学参考。" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq3.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation3"></li>
	<li>使用公式4计算标记蛋白的百分比。 
	<img alt="标记百分比公式，C_SBDS-FLASH除以C_SBDS，用于化学分析计算，公式4。" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq4.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation4"></li>
</ol>
4. 荧光各向异性实验
注意：各向异性实验在配备偏振附件的荧光分光光度计上进行，数据采集使用仪器配套软件中的各向异性程序。激发波长设置为494 nm，光谱带宽为8 nm，发射光通过530±25 nm的带通滤光片记录。所有测量均在25 °C下进行，使用体积为200 µl、光程为5 mm的比色皿10。
<ol>
	<li>在荧光比色皿中，加入 200 µl 含 30 nM SBDS-FlAsH 的各向异性缓冲液，并逐次滴加 2 µl 30 µM 的 EFL1。充分混匀后，静置反应 3 分钟，然后测定各向异性值。</li>
	<li>重复步骤 4.1，直至累计加入 40 µl 的 EFL1。</li>
</ol>
5. 数据分析
<ol>
	<li>使用非线性最小二乘回归算法将数据拟合到适当的结合模型。最常见的结合模型方程见表1。</li>
	<li>通过检查拟合残差23来评估描述蛋白质间相互作用的最佳模型，并通过额外实验验证所选模型。</li>
</ol>
表1. 常见的蛋白质-蛋白质相互作用结合模型及其对应的数学方程。 <a href="http://cloudfront.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640table1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看此表格的放大版本。</a> 
<img alt="结合平衡方程表；模型：单结合位点、两个相同位点、两个不同位点。" src="/files/ftp_upload/54640/54640table1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="表1">

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露，且不存在竞争性经济利益。

大多数涉及蛋白质的生化实验不仅需要高纯度的蛋白质，还需要大量的蛋白样品，无论使用何种技术均是如此。因此，此类实验所用的蛋白质通常通过异源表达获得，本文所述案例即采用此方法。荧光光谱分析要求被研究分子中存在荧光团。芳香族氨基酸残基是蛋白质的内源性荧光团，然而，利用其信号研究蛋白质-蛋白质相互作用会使分析复杂化，因为这些残基在大多数蛋白质中普遍存在，受体蛋白和配体中都会含有。此外，色氨酸的荧光寿命太短，不适用于荧光各向异性实验。因此，通常需要向其中一个被研究的蛋白质添加外源性荧光团。为此，通过基因工程在蛋白质中引入四半胱氨酸基序，并利用染料4',5'-双(1,3,2-二硫砷环-2-基)荧光素与其形成配位键，从而将荧光团连接至SBDS的C末端。选择哪一个蛋白质携带荧光团并非随意决定。由于本研究中蛋白质的大小不同（SBDS为29 kDa，EFL1为127 kDa），我们预期标记后的SBDS在游离状态与和EFL1形成复合物之间的各向异性变化，会大于标记后的EFL1在游离状态与结合SBDS之间的变化。基于此考虑，将FlAsH标签引入SBDS而非EFL1。在建立荧光各向异性实验时，另一个需要考虑的重要参数是溶液的吸光度。样品在比色皿中的溶液在激发波长...

细胞含有多种生物大分子，这些分子之间不断发生相互作用。这种相互作用形成了参与细胞信号转导、基因表达调控、细胞迁移等多种功能相关通路的复合物。细胞内发生的所有蛋白质-蛋白质相互作用构成了一个被称为相互作用组（interactome）的网络。 Saccharomyces cerevisiae 其超过70%的蛋白质已被证实具有相互作用伙伴 1理解细胞相互作用组及其功能可为生物体的复杂性和多样性提供重要信息。已有多种方法被用于鉴定和表征蛋白质-蛋白质相互作用。不同的高通量方法，如酵母双杂交系统 2，蛋白质片段互补分析 3，亲和纯化 4 与质谱联用及蛋白质微阵列用于鉴定相互作用 5,6一旦确定，必须对其进行验证，而验证方法可能因具体情况而异。通常，这些实验涉及在相互作用配对成员的个体层面上破坏该相互作用本身， 例如， 通过基因敲除或过表达其中一种蛋白质，随后在细胞水平上观察另一种组分性质或功能的变化。随后，采用生物物理技术 7 用于在分子水平上表征蛋白质-蛋白质相互作用。为此，通过X-ray crystallography、核磁共振和冷冻电子显微镜确定蛋白质复合物的结构，而通过量热法和荧光光谱法对这些相互作用进行定量和机制性描述。
在本研究中，采用荧光各向异性技术来表征GTP酶EFL1与SBDS蛋白之间的相互作用。这些蛋白通过促进真核起始因子6从60S核糖体亚基表面释放，参与核糖体的合成过程8。SBDS蛋白在一种称为施瓦赫曼-戴蒙德综合征（Shwachman-Diamond Syndrome）的疾病中发生突变9，其作为EFL1的鸟嘌呤核苷酸交换因子，可降低EFL1对二磷酸鸟苷的亲和力10,11。SBDS蛋白的致病性突变会破坏其与EFL1的相互作用，从而阻止EFL1的激活。
荧光各向异性常用于生物学研究蛋白质-肽或蛋白质-核酸相互作用。其原理基于：当荧光团被偏振光激发时，会产生部分偏振的发射光。荧光各向异性由公式1定义：
<img alt="各向异性方程，用于分析分子取向的公式，静态平衡" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation1">
其中 IVV 和 IVH 分别表示在垂直偏振光激发下，样品发射的垂直偏振（VV）和水平偏振（VH）荧光强度12。荧光各向异性对影响荧光团旋转扩散速率的因素敏感，因此依赖于温度、溶液黏度以及荧光团的表观分子大小。当含有荧光团的蛋白质与其他蛋白质相互作用时，其表观尺寸增大，这种变化可通过各向异性的改变进行评估。更具体而言，若荧光团在溶液中的旋转速度相对于其荧光寿命较慢，则其 IVV 值较大而 IVH 值较小，因而表现出较高的各向异性。而对于相对于其荧光寿命快速翻滚的荧光团，IVV 与 IVH 值相近，其各向异性值则较小12（图1）。此外，为了获得良好的各向异性信噪比测量结果，需要选择荧光寿命与目标分子旋转相关时间相近的荧光团。否则，将无法准确记录游离蛋白与其复合物之间各向异性的差异。例如，将荧光寿命接近 4 纳秒的荧光探针（如荧光素或罗丹明）标记到分子量为 100 Da 的小分子化合物上时，其各向异性为 0.05；当其结合至 160 kDa 的分子时，各向异性值将升高至 0.29，该差异可被精确测量。相比之下，若同一荧光探针参与的结合反应导致分子量从 65 kDa 增加至 1,000 kDa，其各向异性仅从 0.28 变化至 0.3，变化幅度过小而难以准确检测。在此情况下，选择荧光寿命为 400 纳秒的探针将更为合适12。
<img alt="显示激发光、单色器和用于蛋白质尺寸分析的检测器的偏振测量示意图。" src="/files/ftp_upload/54640/54640fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
图1. 用于测量荧光各向异性的设备及其实验流程示意图。 用于进行蛋白质-蛋白质相互作用实验并测量荧光各向异性的设备示意图。快速翻滚的荧光团表现出较小的各向异性，而在与相互作用伙伴结合后，其各向异性增加。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54640/54640fig1large.jpg" target="_blank">请点击此处查看该图的放大版本。</a>
荧光应用要求在所研究的任何分子中存在荧光基团。为了研究蛋白质-蛋白质相互作用，有三类荧光基团：1）蛋白质中天然存在的色氨酸残基，2）化学连接的荧光基团，以及3）如绿色荧光蛋白（GFP）及其衍生物等荧光融合伴侣。大多数蛋白质在其结构中均含有色氨酸残基，因此最简便的检测相互作用的方法是监测相应荧光光谱的变化，或监测色氨酸残基荧光强度的变化。然而，若两个蛋白质均含有色氨酸残基，则会增加分析的复杂性。另一方面，若荧光基团需因相互作用而改变其荧光特性，则其必须位于结合位点处或附近，而这可能干扰相互作用本身。在使用GFP等体积较大的荧光基团时需特别注意。如果上述三类荧光基团均不适用于结合研究，则有必要向参与相互作用的蛋白质之一引入外源性荧光基团。目前已存在多种化学合成的荧光基团，可通过其反应性基团（如氨基（赖氨酸侧链或N端）和半胱氨酸中的巯基）共价连接至蛋白质。异硫氰酸酯和琥珀酰亚胺酯类荧光衍生物可与氨基发生反应，而碘乙酰胺和马来酰亚胺则为巯基反应性基团。 13最常用的荧光染料包括荧光素和罗丹明绿染料衍生物、香豆素、BODIPY 荧光染料以及 Alexa Fluor 染料。 commercially available fluorophores, coumarins, BODIPY fluorophores, Alexa Fluor dyes 14,15为了实现成功的标记，反应基团必须暴露在蛋白质表面，但由于多肽通常含有大量反应性功能基团，因此很难实现位点特异性的修饰。本研究中的目标蛋白SBDS含有5个游离的半胱氨酸和33个赖氨酸，可能导致多位点标记。非均一性标记可能影响结合特性，并使数据分析复杂化，因为不同的荧光分子在结合后可能产生不同的荧光强度信号。为克服这一问题，我们采用了FlAsH荧光染料——4',5'-双(1,3,2-二硫砷杂环戊烷-2-基)荧光素，对SBDS蛋白进行位点定向标记。该染料是一种砷氧化物染料，可高亲和力地结合由CCXXCC序列组成的FlAsH标签中的四个特定间距的半胱氨酸，其中X为除半胱氨酸以外的任何氨基酸 16,17该四半胱氨酸基序通过基因工程添加至蛋白质的N端或C端，并配有适当的连接子，以防止破坏蛋白质的整体折叠结构。FlAsH染料与FlAsH标签组合最初设计用于在活细胞中对蛋白质进行位点特异性标记 17 但也可用于标记纯化的蛋白质 体外 正如本示例所示。此外，还已开发出酶法策略，以实现蛋白质的位点特异性功能化 18.
在本文中，我们阐述了荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用工具的实用性。通过简单观察结合曲线的形状即可评估结合情况，而通过拟合实验数据可获得定量信息。

<table><tbody><tr><td>0.5 mm 玻璃珠</td><td>Biospec Products</td><td>11079105</td><td></td></tr><tr><td>Tris 碱</td><td>Formedium</td><td>TRIS01</td><td>超纯</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>染料 4&amp;rsquo;,5&amp;rsquo;-双(1,3,2 二硫砷杂环丙烷-2-基)荧光素</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>LC6090</td><td>该试剂盒包含用于标记 FlAsH 标签的染料</td></tr><tr><td>氨苄青霉素</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB02040</td><td></td></tr><tr><td>无水 D(+)-葡萄糖</td><td>Formedium</td><td>GLU03</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-半乳糖</td><td>Formedium</td><td>GAL03</td><td></td></tr><tr><td>L-亮氨酸</td><td>Formedium</td><td>DOC0157</td><td></td></tr><tr><td>L-色氨酸&amp;nbsp;</td><td>Formedium</td><td>DOC0189</td><td></td></tr><tr><td>盐酸苄脒</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6506-5G</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Gold Biotechnology, Inc</td><td>P-470-25</td><td>苯甲基磺酰氟</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Formedium</td><td>NAC02</td><td>氯化钠&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>甘油</td><td>Tecsiquim, S.A. de C.V.</td><td>GT1980-6</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>1725711000</td><td>氯化镁</td></tr><tr><td>咪唑</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399-500G</td><td></td></tr><tr><td>2-巯基乙醇</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-100ML</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3786-500G</td><td>磷酸氢二钾</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3139-500G</td><td>磷酸二氢钠</td></tr><tr><td>不含氨基酸的酵母氮源基础培养基</td><td>Formedium</td><td>CYN0410</td><td></td></tr><tr><td>酵母提取物</td><td>Formedium</td><td>YEM03</td><td>微粒状</td></tr><tr><td>L-酪氨酸</td><td>Formedium</td><td>DOC0193</td><td></td></tr><tr><td>硫酸腺嘌呤</td><td>Formedium</td><td>DOC0230</td><td></td></tr><tr><td>酪蛋白氨基酸</td><td>Formedium</td><td>CAS03</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白胨</td><td>IBI Shelton Scientific, Inc</td><td>IB49182</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Formedium</td><td>IPTG025</td><td></td></tr><tr><td>过滤装置</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>UFC901096</td><td>Amicon Ultra-15，PLGC Ultracel-PL 膜，10&amp;nbsp;kDa</td></tr><tr><td>膜滤器</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>GSWP04700</td><td>混合纤维素酯膜滤器，亲水性，0.22&amp;nbsp;&amp;micro;m，47&amp;nbsp;mm，白色，无网格</td></tr><tr><td>Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; 亲和柱</td><td>QIAGEN</td><td>30760</td><td>预装 5&amp;nbsp;ml Ni-NTA Superflow 的柱芯</td></tr><tr><td>强磺丙基阳离子交换柱</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>17-5157-01</td><td>HiTrap SP Sepharose FF 5 ml</td></tr><tr><td>尺寸排阻柱</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28989335</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 200 PG</td></tr><tr><td>荧光比色皿</td><td>Hellma Analytics</td><td>111-057-40</td><td></td></tr><tr><td>分光光度计</td><td>Agilent Technologies</td><td>G6860AA</td><td>Cary 60 UV-Vis</td></tr><tr><td>摇床</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>SHKA4000-7</td><td>MaxQ 4000 台式，温度范围 室温-15&amp;deg; 至 60&amp;deg;C</td></tr><tr><td>离心机</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004271</td><td>Heraeus Megafuge 16R</td></tr><tr><td>FPLC</td><td>Pharmacia Biotech</td><td>Discontinued</td><td>FPLC 系统，电导率 UV-MM II 监测器，P500 泵，组分收集器</td></tr><tr><td>荧光分光光度计</td><td>Olis</td><td>No applicable</td><td>配备偏振工具箱的 Olis DM 45</td></tr></tbody></table>

荧光各向异性作为研究蛋白质-蛋白质相互作用的工具

Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

蛋白质-蛋白质相互作用在生物体功能中起着至关重要的作用。一旦发现并验证了某种相互作用，就有必要在结构和机制层面对其进行表征。目前已有多种生物化学和生物物理方法可用于实现这一目的。其中，荧光各向异性是一种强大的技术，特别适用于荧光标记蛋白在发生蛋白质-蛋白质相互作用时其荧光强度保持不变的情况。在该技术中，使用适当波长的垂直偏振光激发荧光标记的蛋白质，这种偏振光会根据荧光基团相对于入射光束的方向选择性地激发其中一部分荧光基团。所产生的发射光也具有方向性，其在垂直和水平平面上的强度关系定义为各向异性（r），计算公式如下：r = (IVV - IVH) / (IVV + 2IVH)，其中 IVV 和 IVH 分别代表垂直和水平方向上的荧光强度。荧光各向异性对荧光基团的旋转扩散敏感，即与蛋白质相连的荧光基团所表现出的表观分子大小，而该参数在蛋白质-蛋白质相互作用发生时会发生改变。本文以荧光各向异性技术为例，研究了Shwachman-Diamond综合征相关蛋白（SBDS）与类延伸因子1 GTP酶（EFL1）之间的结合。传统上，蛋白质的荧光标记通常发生在蛋白的巯基（半胱氨酸）或氨基（N端氨基或赖氨酸）上。然而，SBDS蛋白含有多个半胱氨酸和赖氨酸，无法实现定点特异性标记。作为替代方法，采用染料4',5'-双(1,3,2-二硫砷烷-2-基)荧光素（4',5'-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein），对在重组SBDS蛋白C末端通过基因工程引入的四半胱氨酸基序（Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys）进行特异性标记。对实验数据的拟合分析提供了关于这两种蛋白质之间结合模式的定量和机制信息。

进行任何各向异性实验时，必须排除荧光团荧光强度发生大幅变化的可能性，因为所观测到的混合物的各向异性由公式5表示：
<img alt="静力平衡方程：r=ΣiFi*ri。工程分析的数学原理。" src="/files/ftp_upload/54640/54640eq5.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Equation5">
其中 Fi 表示各组分的分数荧光强度 ri 各向异性对应值。每个组分的分数荧光取决于其浓度及其相对荧光强度，后者由公式6定义：
<img alt="静...

蛋白质相互作用是细胞功能的核心。通常使用量热法和光谱技术来表征这些相互作用。本文中，我们描述了荧光各向异性作为一种研究Shwachman-Diamond综合征相关突变蛋白（SBDS）与延伸因子样1 GTP酶（EFL1）之间相互作用的工具。

蛋白质-蛋白质相互作用在生物体功能中起着至关重要的作用。一旦某种相互作用被鉴定并验证，它就可以……

本实验的总体目标是利用荧光各向异性评估并量化两种目标蛋白之间的相互作用。这些测量手段有助于回答蛋白质生物化学与蛋白质生物物理领域中的关键问题，例如哪些蛋白相互作用对细胞功能至关重要。该技术的主要优势在于，我们能够获得有关蛋白质-蛋白质相互作用的定性和定量信息。为制备纯化的SBDS-FlAsH蛋白，首先配制一升LB液体培养基，其中添加100微克/毫升氨苄青霉素。然后在37摄氏度下培养转化后的细菌，直至600纳米处的光密度达到0.5至0.7。通过向培养物中加入 0.5 毫摩尔 IPTG 诱导 SBDS-FlAsH 蛋白表达，并继续在 4 摄氏度下以 3800 ×g 离心 10 分钟收集菌体悬浮液。弃去上清液。将细胞重悬于 35 毫升含有 1 毫摩尔 PMSF 的 SBDS 裂解缓冲液中。在 4 摄氏度下，使用超声波破碎仪以每次 10 秒开启、30 秒关闭的循环模式，总超声时间为 4 分钟，进行细胞裂解。然后，在 4 摄氏度下，以 9,000 × g 离心 50 分钟。保留上清液并弃去沉淀，以去除细胞碎片。用三倍柱体积的SBDS裂解缓冲液平衡镍亲和柱后，将全部澄清的上清液上样至柱中。用三倍柱体积的SBDS裂解缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白。柱洗涤后，用三倍柱体积的SBDS洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。为进一步纯化蛋白质，用三倍柱体积的低盐S柱缓冲液平衡磺丙基阳离子交换柱。用50毫摩尔磷酸缓冲液（pH 6.5）将蛋白质稀释六倍后上样至柱中。用三倍柱体积的低盐S柱缓冲液洗涤未结合的物质。然后，通过向柱中加入50毫摩尔磷酸缓冲液（pH 6.5）和1摩尔氯化钠，一步洗脱蛋白。用50毫摩尔磷酸缓冲液（pH 6.5）将洗脱液稀释三倍。然后，使用超滤装置，在3800 × g 条件下离心15分钟，浓缩蛋白质。此类实验所用蛋白质的质量要求非常高。如果蛋白质样品纯度不高，数据的解读将变得复杂。通过 SDS-PAGE 分析和考马斯亮蓝染色验证 SBDS-FlAsH 蛋白的纯度。将蛋白在液氮中速冻，并于 -80 °C 保存以备后续使用。为制备纯化的 EFL1 蛋白，首先在 30 °C 下，将转化的酵母接种于 1 升不含尿嘧啶的合成缺陷型培养基中，添加 0.5% 葡萄糖，培养至 600 nm 处的光密度达到 1.8。通过向培养物中加入2.8%半乳糖以诱导蛋白表达，并在30°C下继续孵育18小时。在4°C条件下，以3800 × g离心10分钟收集酵母悬液。离心后弃去上清液。将细胞重悬于50毫升EFL1裂解缓冲液中，缓冲液中添加1毫摩尔PMSF和1毫摩尔苯甲脒。使用玻璃珠在珠磨机中通过摩擦作用裂解细胞，总时间为6分钟，程序为4℃下运行2分钟，暂停15分钟，循环进行。然后在4℃下以9,000 × g离心50分钟。保留上清液，弃去沉淀以去除细胞碎片。接着，用三倍柱体积的EFL1裂解缓冲液平衡镍亲和柱。

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科研

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Biochemistry

生物化学

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