荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用

蛋白质相互作用是在一个细胞的功能的心脏。量热和光谱技术通常用于表征它们。这里我们介绍荧光各向异性作为一种工具来研究在Shwachman-Diamond综合征（SBDS）突变蛋白质和延伸因子样1 GTP酶（EFL1）之间的相互作用。

本实验的总体目标是使用荧光各向异性评估和量化两种目标蛋白质之间的相互作用。这些措施可以帮助回答关键问题。蛋白质生物化学和蛋白质生物物理学领域，例如其相互作用对细胞功能很重要的蛋白质。

这种技术的主要优点是我们可以获得有关蛋白质-蛋白质相互作用的定量和定性信息。要制备纯化的 SBDS-FlAsH 蛋白，首先制备 1 升 LB 液体培养基，每毫升补充 100 微克氨苄青霉素。在其中，培养物在 37 摄氏度下转化细菌，直到 600 纳米的光密度达到 0.5 至 0.7。

通过向培养物中加入 0.5 毫摩尔 IPTG 诱导 SBDS-FlAsH 蛋白表达，并继续孵育 5 小时。接下来，在 4 摄氏度下以 3800 倍 G 离心 10 分钟，收集细菌悬浮液。去除上清液。

细胞重悬于 35 毫升补充有 1 毫摩尔 PMSF 的 SBDS 裂解液中。在 4 摄氏度下，使用 10 秒开 30 秒的循环，通过超声裂解总时间为 4 分钟。然后，将样品在 4 摄氏度下以 9， 000 倍 G 离心 50 分钟。

保留上清液并丢弃调色板以去除细胞碎片。用三个柱体积的 SBDS 裂解缓冲液平衡镍亲和柱后，将整个澄清的上清液引入柱上。用 3 柱体积的 SBDS 裂解缓冲液洗涤，去除未结合的蛋白质。

柱洗涤后，用 3 倍柱体积的 SBDS 洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。为了进一步纯化蛋白质，用三种柱体积的低盐 S 柱缓冲液平衡磺丙基阳离子交换柱。用 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液 PH 6.5 将蛋白质稀释六倍，然后将其引入色谱柱中。

用三个柱体积的低盐 S 柱缓冲液洗涤未结合的材料。然后，通过在色谱柱上加入 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液 PH 6.5、1 摩尔氯化钠，一步洗脱蛋白质。用 50 毫摩尔磷酸盐缓冲液 PH 6.5 将洗脱液稀释三倍。

然后，使用超滤装置以 3800 倍 G 离心 15 分钟，浓缩蛋白质。此类实验中使用的蛋白质质量非常有效。如果使用的蛋白质样品纯度不高，则数据的解释会变得复杂。

通过 SDS-PAGE 分析和考马斯染色验证 SBDS-FlAsH 蛋白的纯度。将蛋白质在液氮中快速冷冻，并在零下 80 摄氏度下储存直至进一步使用。为了制备纯化的 EFL1 蛋白，首先将转化酵母在 30 摄氏度下培养在一升不含尿嘧啶的合成辍学培养基中，补充 0.5% 葡萄糖，直到 600 纳米的光密度达到 1.8。

通过向培养物中添加 2.8% 的半乳糖来诱导蛋白质表达，并在 30 摄氏度下继续孵育 18 小时。通过在 4 摄氏度下以 3800 倍 G 离心 10 分钟来收集酵母悬浮液。离心后去除上清液。

将细胞重悬于 50 mL EFL1 裂解缓冲液中，该缓冲液补充有 1 毫摩尔 PMSF 和 1 毫摩尔苯扎脒。使用玻璃珠在打珠器上摩擦，破坏细胞，总时间为 6 分钟，在 4 摄氏度下使用 2 分钟关闭 15 分钟的循环。然后，将样品在 4 摄氏度下以 9， 000 倍 G 离心 50 分钟。

保留上清液并丢弃上颚以去除细胞碎片。接下来，用三个柱体积的 EFL1 裂解缓冲液平衡镍亲和柱。将所有澄清的上清液引入平衡柱上。

用 3 倍柱体积的 EFL1 裂解缓冲液洗涤色谱柱去除未结合的蛋白质后，用 3 倍柱体积的 EFL1 洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质。为了进一步纯化 EFL1 蛋白，用 1.5 柱体积的各向异性缓冲液平衡体积排阻柱。用超滤装置以 3800 倍 G 离心，将从镍亲和柱中逃脱的 EFL1 蛋白浓缩至 1 毫升，然后将浓缩的样品引入体积排阻柱。

收集逃避的蛋白质并通过超滤浓缩至最终浓度约为 30 微摩尔。通过 SDS-PAGE 分析和考马斯染色验证 EFL1 蛋白的纯度。将蛋白质在液氮中快速冷冻，并在零下 80 摄氏度下储存直至进一步使用。

将 3 纳摩尔的 SBDS-FlAsH 蛋白与 3 纳摩尔的 lumio green 染料混合在 5 微米体积的各向异性缓冲液中。让反应在 4 摄氏度下进行 8 小时。8 小时后，用各向异性缓冲液透析样品过夜，以去除游离染料。

使用石英比色皿在分光光度计中测量 280 纳米和 508 纳米的吸收剂。然后，使用 Lambert-Beer 定律量化文本方案中所述的标记蛋白质的百分比。在测量各向异性值之前，应仔细完成蛋白质军团的每个过滤步骤，确保整个样品分配到溶液中并变得均匀。

在荧光比色皿中，将 200 微升 30 纳摩尔 SBDS-FlAsH 置于各向异形缓冲液中，滴定 2 微升 30 微摩尔 EFL1。充分混合，让反应静置 3 分钟，然后测量各向异型和荧光值。重复此过程，直到添加总体积为 40 μL 的 EFL1。

最后一步，将数据拟合到假定的绑定模型，如 text 协议中所述。要进行任何各向异性实验，重要的是要排除荧光强度的较大变化。如图所示，SBDS-FlAsH 的荧光在与 EFL1 结合后没有明显变化。

将 EFL1 滴定到含有 SBDS-FlAsH 的石英比色皿中，导致最初观察到的各向异形增加。EFL1 的几个添加描述了相应的结合曲线，可以使用非线性最小二乘回归拟合到假定的结合模型。在这种情况下，一个结合位点模型不能适当地描述实验数据。

相反，两个不相同的结合位点模型确实适当地描述了实验数据。一旦掌握，如果作得当，荧光各向异型结合实验可以在三个小时内完成。在尝试此过程时，大量纯化的蛋白质很重要。

与该程序并行，可以执行其他方法，例如过去基于片段的互补测定，或对研究蛋白质的不同结构域进行荧光各向异性分析，以支持适当的结合模型。看完这个视频后，您应该对如何进行结合实验和荧光各向异性实验有很好的了解。