荧光激活细胞分选从小鼠骨髓浆树突状细胞的分离纯化
2016年11月4日
我们使用荧光激活细胞分选来分离浆细胞样树突细胞（PDC）与来自狼疮易感小鼠的骨髓供的pDC的功能研究的高纯度报告的协议。
本实验的总体目标是从狼疮易感小鼠的骨髓中分离出高纯度的浆细胞样树突状细胞 （PDC），用于研究其功能。这种方法可以帮助回答与特定免疫细胞群的特征相关的关键问题，例如，在狼疮发展的后期产生干扰素 α 的 PDC。该技术的主要优点是，与磁珠分选相比，可以将一到几个目标群体富集到更高的纯度。
收获后，将后肢骨和 4 毫升完全培养基转移到研钵中。加入 6 毫升新鲜完全培养基，使总体积达到 10 毫升。然后用杵轻轻敲碎骨头。
轻轻搅拌杵以释放骨髓。然后，将所有培养基通过 70 微米过滤器转移到冰上的 50 毫升锥形管中。向研钵中加入 10 毫升新鲜的完全培养基。
并将上清液再过滤两次，直到骨头呈白色。然后，离心骨髓细胞，并将沉淀重悬于 10 mL新鲜完全培养基中。接下来，将细胞分层到 15 mL 锥形管中新鲜制备的 5 mL 密度梯度培养基上，注意不要破坏各层。
并通过离心分离细胞。然后，小心地去除最上面的 8 毫升溶液，并在中间阶段收集 2 毫升的血沉棕黄层。向分离的单核细胞中加入 12 毫升冰冷的完全培养基，并盖上试管以倒置混合。
然后，通过离心沉淀细胞。要对细胞进行 FACS 染色，请将它们在 4 摄氏度下重悬于 100 微升 CD1632FC 封闭抗体中。10 分钟后，在 4 mL 冰冷的分选缓冲液中洗涤细胞，并用 100 μL 适当的细胞表面染色抗体混合物标记细胞。
在4 摄氏度的黑暗中 15 分钟。在 4 mL 冰冷的分选缓冲液中洗涤细胞，以去除任何未结合的荧光偶联抗体。然后，将沉淀重悬于 500 微升 FACS 加载溶液中，并将样品转移到冰上的 FACS 管中。
为了对补偿对照进行染色，每管 10 至 6 个脾细胞分装一次。用 4 毫升分选缓冲液洗涤细胞，并将沉淀重悬于 100 微升分选缓冲液中。然后，将来自主细胞表面抗体混合物的适当荧光偶联抗体添加到每个相应的补偿管中，并摇动试管以混合。
在 4 摄氏度的黑暗中放置 15 分钟后，用分选缓冲液洗涤所有样品，并将沉淀物重新悬浮在 500 微升冰冷的分选缓冲液中。除了 DAPI 管，它被重新悬浮在 500 微升 FACS 加载溶液中。为了通过荧光激活细胞分选纯化目标细胞群，在分选阀下方加载含有 500 微升补充有抗生素的 FBS 的收集管。
接下来，加载未染色的试管并收集 10， 000 个事件，以设置每种荧光强度的负门。在单个染色补偿管中具有 10， 000 个事件，用于设置每种荧光强度的阳性门控。从实验样品中收集 3， 000 个事件，以设置分选细胞群的门控。
使用荧光强度作为 X 和 Y 访问图的参数，手动设门目标细胞群。然后，将目标细胞群分选到收集管中。分选结束时，向细胞中加入最多 4 mL 的 ice cole 完全培养基。
然后，盖上试管并通过倒置混合细胞。通过离心沉淀纯化的细胞，吸出除最后 200 微升上清液外的所有细胞。然后，将沉淀重悬于 1 mL 冰冷的完全培养基中，并将细胞转移至 1.5 mL 微量离心管中进行第二次离心。
最后，吸出除最后 100 微升上清液之外的所有上清液，并将分选的细胞群储存在冰上直至使用。对来自狼疮易感小鼠的骨髓浆细胞样树突状细胞进行磁性激活细胞分选，富集后纯度仅为 7.75%。然而，FACS 富集的浆细胞样树突状细胞在分选后表现出高达 96.4% 的纯度。
为了确保高纯度，首先通过前向和侧向散射参数对单核骨髓细胞进行门控并与碎片分离。使用前向散射宽度与前向散射高度和侧向散射宽度与侧向散射高度，对单个细胞进行进一步门控，以避免聚集体产生的假阳性信号。然后，通过其 CD11c 阳性、CD11B 阴性细胞表面表达对活的单个 DAPI 阴性细胞进行门控，从而允许进一步设门 B220 阳性、PDCA-1 阳性靶骨髓浆细胞样树突状细胞群。
分选的 PDC 群体不仅纯度高，而且功能正常，能够在体外 CPG 刺激后产生 IFNα。在尝试此程序时，重要的是要记住要敲碎骨头并轻轻搅拌释放的骨髓，以保持细胞活力。在此程序之后，可以执行其他方法，如 RNA 测序或体外培养和刺激，以回答有关富集细胞群的基因表达或功能的其他问题。
开发后，这项技术为 PDC 研究人员探索这种强大细胞在狼疮和狼疮易感小鼠模型发育中的作用铺平了道路。看完这个视频，你应该对如何从狼疮易感小鼠的骨髓中分离出高度纯化的 PDC 群体有一个很好的了解。
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概述
本研究提出了一种使用荧光激活细胞分选的协议，从狼疮易感小鼠的骨髓中分离浆细胞样树突状细胞（pDC）。该方法旨在为随后的pDC功能研究实现高纯度。
关键研究组成部分
科学领域
- 免疫学
- 细胞生物学
- 自身免疫
背景
- 浆细胞样树突状细胞对免疫反应至关重要。
- 它们产生干扰素α，尤其是在狼疮进展过程中。
- 高纯度的分离对于准确的功能分析至关重要。
- 荧光激活细胞分选相比传统方法具有优势。
研究目的
- 从狼疮易感小鼠中分离pDC。
- 研究pDC的功能特性。
- 加深对狼疮中免疫细胞行为的理解。
所用方法
- 从狼疮易感小鼠中收集骨髓。
- 使用荧光激活细胞分选进行分离。
- 准备完整的培养基以进行细胞处理。
- 破碎骨骼以释放用于分选的细胞。
主要结果
- 成功以高纯度分离出pDC。
- 加深了对狼疮中pDC功能的理解。
- 展示了荧光激活细胞分选的优势。
- 为未来的研究提供了可靠的协议。
结论
- 该协议有效地分离出pDC以进行功能研究。
- 研究结果有助于理解狼疮的病理。
- 未来的研究可以在这一方法论基础上进行。
常见问题
Executive Industry Relevance
Isolating rare immune cell populations with high purity is critical for mechanistic de-risking in target validation and preclinical model development. Fluorescence-activated cell sorting (FACS) enables precise phenotypic separation of plasmacytoid dendritic cells from lupus-prone mouse bone marrow, supporting reliable functional assays and translational biomarker discovery. This approach reduces biological noise in early discovery, improving predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of plasmacytoid dendritic cell function in lupus pathogenesis by isolating a pure population for interferon alpha production studies.
- Operational Value: Achieves up to 96.4% purity post-sorting, significantly exceeding magnetic-activated cell sorting alternatives.
- Strategic Value: Supports target confidence by reducing cellular heterogeneity in functional readouts, aiding go/no-go decisions in immunomodulator screening.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates purified plasmacytoid dendritic cells suitable for in vitro stimulation assays, such as CpG-induced interferon alpha measurement.
- Operational Value: Permits simultaneous separation of multiple cell populations, increasing experimental throughput and assay standardization.
- Strategic Value: Creates a reproducible input for screening workflows, enabling reliable compound evaluation against defined immune phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides a disease-relevant system using lupus-prone mouse models to study plasmacytoid dendritic cell contributions to autoimmunity.
- Operational Value: Isolated cells remain functionally normal, capable of interferon alpha production upon stimulation, validating assay readiness.
- Strategic Value: Facilitates translational continuity from discovery to preclinical validation by supplying well-characterized primary cells for mechanism-of-action studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum, supporting early target validation through phenotypic screening and enabling lead identification via functional readouts in purified immune cells.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating plasmacytoid dendritic cells to clarify their role in interferon-driven lupus pathology.
- Screening: Delivers standardized, high-purity cell populations for reproducible functional assays and compound screening.
- Analytics: Enables quantitative dependent variable measurements such as cytokine production, flow cytometry readouts, and purity assessment via forward/side scatter gating.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity through use of lupus-prone mice, aligning with mechanistic de-risking in autoimmune disease models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for isolating rare immune cells across multiple immunology and autoimmunity projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence through reduction of mechanistic ambiguity in immune cell function studies.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via defined gating strategies and compensation controls.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions and reduced late-stage biological risk in immunomodulator development.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization based on reliable preclinical data from purified cell populations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, cell staining, and compensation controls for accurate fluorescence-activated cell sorting.
- Dependent on instrumentation including flow cytometers, sorting equipment, and centrifugation systems for bone marrow processing.
- Necessitates cross-team standardization of antibody panels, gating strategies, and sorting protocols across immunology and assay development groups.
- Involves adaptation considerations when applying the protocol to other model systems or tissue sources beyond mouse bone marrow.
- Includes practical limitations such as the need for gentle bone marrow disruption to preserve cell viability and the time-intensive nature of multi-step purification.
