使用仙台病毒和离心法从血细胞生成诱导性多能干细胞

本研究的总体目标是利用离心连续传代技术，将外周血单个核细胞重编程为诱导性多能干细胞。最初，诱导性多能干细胞（iPSCs）是通过重编程成纤维细胞获得的。如今，已有多种细胞类型被用于重编程。

然而，由于血液的易获取性，外周血单个核细胞（PBMCs）可能并非药物筛选、疾病建模及再生医学开发中诱导性多能干细胞（iPSCs）应用的理想细胞来源。本研究将分享一种通过施加离心力利用PBMCs重编程诱导性多能干细胞的实验方案。该方案为悬浮细胞的重编程提供了另一种选择。

演示该操作时，我们将使用来自我实验室的研究生 Nam。为了分离单核细胞，首先从细胞制备管中的采血获取至少十毫升的新鲜血液。接着，将血液转移至一个新的 50 毫升锥形管中，并以 1:4 的比例用无菌 PBS 稀释。

随后，向一个新的50毫升锥形管中加入10毫升密度梯度介质，并小心地将稀释后的血液叠加在密度梯度介质上方。然后，在室温下以750 × g离心30分钟，离心过程中不启用刹车。30分钟后，小心地将白膜层转移至一个新的50毫升锥形管中。

加入 30 毫升 PBS，洗涤细胞。然后在室温下以 515 ×g 离心 5 分钟。随后弃去 PBS，将细胞重悬于 0.5 毫升血液细胞培养基中。

随后，对细胞进行计数，并将其接种至24孔板中。在周围孔中加入PBS，以防止蒸发。之后，在37摄氏度下将细胞稳定培养五天，再进行转导。

在第3至第4天，额外加入0.5毫升新鲜的血细胞培养基，注意不要扰动细胞。在此步骤中，将血细胞转移至15毫升锥形管中，并使用血细胞计数板进行计数。接着，准备3×10⁵个细胞用于转导，并在室温下以515×g离心5分钟。

随后，用吸液法弃去上清液，并将细胞重悬于 0.5 毫升血液细胞培养基中。然后，将细胞转移至未经包被的 24 孔板的一个孔中。在冰上融化仙台病毒混合物，并将其加入悬浮细胞中。

用封板膜密封培养板，在30摄氏度下以1,150 ×g离心30分钟。离心后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。第二天，为用玻连蛋白包被24孔板，需用PBS稀释玻连蛋白溶液，使其终浓度为5微克/毫升。

接着，向一个孔中加入1毫升的玻璃粘连蛋白，在室温下孵育至少1小时。孵育结束后，移除包被液，并将含有细胞和病毒的所有培养基转移至已包被的孔中。然后，用额外的0.5毫升新鲜血细胞培养基收集残留的细胞，并将其加入含有细胞的孔中。

随后，在35摄氏度下以1,150 × g离心平板10分钟，然后将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下培养过夜。对于第二次细胞转染，按照先前所述方法，用5微克/毫升的玻璃粘连蛋白包被孔板。每次转导使用平板中的一个孔，并将细胞悬液从第一块平板转移至新包被的玻璃粘连蛋白平板中。

同时，向第一块培养板的孔中加入1毫升iPSC培养基以进行维持培养，并在37°C、5%二氧化碳条件下孵育，每天更换新鲜的iPSC培养基。转导后第14至21天将出现细胞集落。将含有悬浮细胞的新包被培养板在35°C下以1,150 × g离心10分钟。

离心后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育过夜。次日，移除上清液，并更换为新鲜的诱导多能干细胞培养基。每天更换培养基，持续培养贴壁细胞，直至细胞融合度达到80%。

在挑取克隆前一周，将一乘以十的四次方个细胞接种至经玻连蛋白包被的100毫米培养皿中。接着，通过加入两毫升玻连蛋白溶液，制备经玻连蛋白包被的60毫米培养皿，并在室温下孵育至少一小时。在显微镜下观察，用记号笔在培养皿底部标记边界清晰的克隆集落。

从新培养板中移除玻连蛋白溶液，并加入六毫升添加了10毫摩尔RHO激酶抑制剂的诱导多能干细胞培养基。随后，移除细胞的培养基，用三毫升PBS洗涤细胞。然后，加入一毫升诱导多能干细胞集落解离溶液，在室温下孵育30秒。

随后，从培养板中移除溶液，在室温下额外孵育30秒。30分钟后，从培养板中吸取200微升培养基，通过移液吹打使目标菌落脱离。然后，将分散的菌落转移至新的60毫米培养皿中。

将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育并培养，直至传代至第十代。在重编程的早期阶段，诱导多能干细胞（iPSCs）与贴壁的未重编程分化细胞混合存在。在扩增前，诱导多能干细胞与其他细胞难以区分。

通过以低密度接种细胞，获得了足够大可用于挑选的克隆。分离克隆后，将细胞团解离为单细胞并进行培养。随后观察到纯的iPSC克隆。

在纯化的诱导性多能干细胞扩增后，对细胞质量进行了检测。通过碱性磷酸酶染色来确认诱导性多能干细胞的未分化状态。由分离得到的诱导性多能干细胞所形成的克隆均呈现阳性染色。

通过免疫荧光染色确认了多能性标志物。重编程细胞高表达多能性标志物，如 SSEA4、Oct4、Sox2、TRA-1-81、Klf4，尤其是 TRA-1-60；多能性标志物的表达也通过逆转录 PCR（RTPCR）得以确认。通过离心进行连续传代培养，使过渡期使用的外周血单个核细胞（PBMC）贴附于包被基质的培养板上。

细胞附着情况如预设，iPSC 克隆进行重复纯化。采用本方案，可在一个月内从外周血单个核细胞（PBMCs）诱导生成 iPSC。该方案缩短了转导细胞附着所需时间，并防止了因无法自行附着而导致的重编程细胞丢失。

然而，在进行此操作时，完全重编程的克隆形成型iPSC的纯化可能至关重要。此前，我们已成功利用该方案对PBMC和单个核细胞进行了重编程。所获得的血液细胞来源的iPSC可在多种研究领域中广泛应用。

该方案可有助于其他类型悬浮细胞的重编程过程，为进一步的应用和研究提供支持。