Vitronectin 在细菌黏附和血清耐药性中作用的实验研究

这种方法可以帮助回答宿主-病原体相互作用领域的关键问题，例如细菌病原体如何利用人类蛋白质在人类中引起疾病。这种技术的主要优点是它可以回答是否有任何病原体可以利用维特龙素建立宿主的感染。我们将重点介绍 Vitronectin，一种参与细胞外基质的宿主蛋白，但也作为补充激活决定途径的补充抑制剂。

这些事实对于引起人类疾病的病原体非常重要和极具吸引力。为准备流动细胞学，用含有250纳米摩尔维特龙素的50微升阻断缓冲液重新填充细菌颗粒。然后，在室温下孵育样品一小时，不摇晃。

孵育后，在3，500g的离心下对细菌进行5分钟的造粒。然后，使用 PBS 和类似的离心步骤清洗颗粒三次。洗涤后，在PBS BSA中，在1至100稀释时，在细菌颗粒中加入50微升原发性绵羊抗人维特龙素多克隆抗体。

在室温下孵育悬浮液一小时。然后，用PBS清洗细菌三次，以去除未结合的抗体。接下来，加入50微升PBS BSA含有荧光素同位素的驴抗羊多克隆抗体。

在黑暗中在室温下孵育一小时。最后，经过三个洗涤步骤，用300微升PBS重新暂停细菌颗粒，并通过流式细胞仪进行分析。为了准备ELISA，将100微升的蛋白质溶液分配到聚索普微刺激板的每个孔中。

用盖子合上板，在四摄氏度下储存过夜，以方便蛋白质固定在微刺激板井上。通过倒置在水槽上，丢弃微刺激板中的溶液。然后，用每口300微升PBS洗井三次。

在室温下用 PBS 将涂层孔阻塞一小时，其重量体积为 2.5 百分比 BSA。去除阻塞溶液后，用每口300微升PBST洗井三次。现在，在每个样品中加入100个50纳米摩尔重组的微升，将他标记的PH。

在控制井中，仅添加 100 微升 PBS BSA。在室温下孵育板一小时。孵育后，丢弃蛋白质溶液，用每井300微升PBST洗涤三次，去除未绑定的蛋白质。

然后，加入100微升PBS BSA含有马萝卜过氧化物酶结合抗他的多克隆抗体。在室温下孵育一小时后，用每井300微升PBST洗井三次。通过向每一井添加 100 微升 ELISA 检测试剂来检测抗原-抗体复合物。

然后，每井加入50微升一个摩尔硫酸，以停止反应。使用微孔板读卡器测量 450 纳米的孔的光学密度。根据制造商的指南，使用胺耦合方法在胺反应传感器上固定人 Vitronectin。

使用 PBS，连续稀释重组 PH 配体从零到四微摩尔，并将生成的溶液转移到 96 孔黑色平底微蒂板。使用生物层干涉测量仪器在30摄氏度下运行实验。PBS 中每毫升 Vitronectin 溶液的 10 微升，作为一滴，放在玻璃显微镜幻灯片上。

在室温下，让落差在幻灯片上干燥 30 分钟。将蛋白质涂层的玻璃幻灯片浸入含有 PBS 的烧杯中浸两秒钟，以去除多余的未涂覆蛋白质，将其洗涤三次。现在，将 10 毫升的新鲜 Hif 培养剂加入无菌塑料培养皿中，并将涂层玻璃幻灯片淹没在培养基中。

在37摄氏度下孵育一小时，在20 RPM时摇晃。孵育后，将幻灯片三次淹没在装满PBS的烧杯中，然后像文本协议中描述的语法染色使受约束细菌目对目，以去除任何未绑定的细菌。培养 A549 上皮细胞，如文本协议中所述。

在37摄氏度下对细胞进行一次洗涤和三辛化后，使用每毫升根霉素含有5微克的完整介质将细胞悬浮液稀释至5000个细胞。在细菌感染之前，用F12介质代替井中的介质，并在37摄氏度下孵育过夜。在室温下用一毫升PBS清洗细胞单层三次。

然后，将板放在冰和200微升预冷F12介质上，每毫升维特罗内丁含有10微克。在四摄氏度下孵育一小时后，通过移液丢弃溶液，并在室温下用一毫升PBS清洗细胞层两次。在每个井中加入100个新鲜生长的Hif野生型的微升。

在37摄氏度下孵育板两小时。然后，用移液器吸气介质，用PBS清洗 A549 上皮细胞三次。每井的细胞分离溶液添加50微升，并在37摄氏度下进行5分钟的孵育。

接下来，每井添加50微升F12完整介质，以停止酶反应。将上皮细胞从每一个井转移到一个六毫升的玻璃管，里面装着四个玻璃珠。通过涡旋两分钟，在室温下使细胞保持。

稀释细胞 100 倍后，将稀释样品的 10 微升板盘放到巧克力加糖板上。在37摄氏度下过夜孵育后，计算菌落。为了分析维特龙素依赖性对人体血清杀菌活性的耐药性，首先培养和颗粒菌，如文本协议所述。

离心后，用一卷葡萄糖-胶质-维龙缓冲液重新填充细菌颗粒。现在，在 100 微升 DGVB 加加含有 5% 血清的 100 微升中加入 1，500 CFU 细菌。在37摄氏度下孵育样品15分钟，在300 RPM下摇动。

在零分钟和15分钟内从反应混合物中去除10微升等分。将等分放在巧克力加糖上，在37摄氏度下孵育。在巧克力加糖板孵育后，计算板上出现的菌落，并计算文本协议中描述的细菌的百分比。

本研究中测试的所有Hif临床分离物都将维特龙素招募到细胞表面，由流式细胞学测定。野生型Hif菌株对维特龙素的结合导致种群的转移，而突变体没有结合维特龙素。ELISA估计了主要维特龙素结合蛋白PH和维特龙素之间的蛋白质-蛋白质相互作用。

结果表明PH与维特龙素和正控相对于负对的显著相互作用。使用生物层干涉测量技术实时估计PH和维特龙素之间的相互作用，具有2.2微摩尔的亲和力。此外，与野生型细胞相比，细胞表面缺乏PH表达的细菌减少了对维特龙素涂层玻璃表面的依从性。

此外，上皮细胞表面的维特龙素的存在显著增强了Hif的粘附性。为了估计维特龙素的补性抑制活性，对血清中位杀戮进行了检查。野生型Hif细胞表现出比突变细胞更高的血清耐药性。

没有细菌在热灭活血清的存在下死亡。有趣的是，野生型Hif在维特罗内辛贫化血清中表现出的存活率降低，而补充维特罗内辛增加了细菌存活率。然而，突变菌株没有对维特龙素的耗竭作出反应，因为它不能将维特龙素招募到细胞表面。

一旦掌握，这种技术可以在三到四天内完成任何病原体，并记住使用细菌病原体的新鲜培养。看完这段视频后，您应该对如何分析与病原体结合的 Vitronectin 有很好的了解。除了这种技术，可以使用蛋白质组学和西印迹来识别细菌的维特龙素结合表面蛋白。

该技术对于宿主-病原体相互作用领域的研究人员以及探讨细菌毒性机制十分重要。