研究玻璃粘连蛋白在细菌黏附和血清抗性中作用的实验方法

该方法有助于解答宿主-病原体相互作用领域中的关键问题，例如细菌病原体如何利用人类蛋白质在人体内引发疾病。该技术的主要优势在于，能够判断任何病原体是否可利用玻璃粘连蛋白（Vitronectin）建立对宿主的感染。我们将重点关注玻璃粘连蛋白，这是一种参与细胞外基质的宿主蛋白，同时在补体激活的经典途径中发挥补体抑制剂的作用。

这些事实对于引起人类疾病的病原体而言极为重要且极具吸引力。进行流式细胞术前，用含有250纳摩尔Vitronectin的50微升封闭缓冲液重悬细菌沉淀。然后在室温下孵育样品一小时，期间不进行振荡。

孵育后，将细菌在3,500 g离心5分钟，沉淀菌体。然后用PBS缓冲液以相同的离心步骤洗涤沉淀物3次。洗涤后，在PBS BSA中按1:100稀释度向细菌沉淀物中加入50 µL一抗——羊抗人连丝蛋白（Vitronectin）多克隆抗体。

将悬液在室温下孵育1小时。然后用PBS洗涤细菌3次，以去除未结合的抗体。接着，向沉淀中加入50 µL含异硫氰酸荧光素标记的驴抗绵羊多克隆抗体的PBS BSA溶液。

在避光条件下室温孵育一小时。最后，经过三次洗涤步骤后，用 300 µL PBS 重悬菌体沉淀，并通过流式细胞术进行分析。为准备 ELISA，将 100 µL 蛋白溶液加入 PolySorp 微孔板的每个孔中。

将酶标板盖上盖子，于4 °C过夜孵育，以促进蛋白质固定到酶标板孔中。将酶标板倒置于水槽上方，弃去孔内溶液。随后，每孔加入300 µL PBS，洗涤3次。

用含2.5%（质量体积比）BSA的PBS在室温下封闭包被好的孔，封闭1小时。移除封闭液后，每孔加入300 µL PBST，洗涤3次。然后，向每个样品孔中加入100 µL 50 nmol/L的重组His标签PH蛋白。

在对照孔中，仅加入 100 微升 PBS BSA。将培养板在室温下孵育 1 小时。孵育结束后，弃去孔中的蛋白溶液，并用 300 微升 PBST 每孔清洗 3 次，以去除未结合的蛋白质。

然后，每孔加入 100 µL 含辣根过氧化物酶标记的抗 His 多克隆抗体的 PBS BSA 溶液。室温孵育 1 小时后，每孔加入 300 µL PBST 洗涤 3 次。每孔加入 100 µL ELISA 检测试剂，以检测抗原-抗体复合物。

然后，每孔加入50 µL 1摩尔的硫酸以终止反应。使用酶标仪在450 nm处测定各孔的光密度。根据制造商的说明，采用胺偶联法将人源玻璃粘连蛋白固定在胺反应性传感器上。

使用 PBS 将重组 PH 配体从零到四微摩尔进行连续稀释，并将所得溶液转移至 96 孔黑色平底微孔板中。使用生物膜干涉仪在 30 摄氏度条件下进行实验。将 10 微升浓度为每毫升 2 微克的玻连蛋白 PBS 溶液用移液器滴加到玻璃显微镜载片上，形成单个液滴。

将液滴置于载玻片上，在室温下静置干燥30分钟。将包被有蛋白的玻片浸入盛有PBS的烧杯中，每次2秒，重复洗涤3次，以去除未结合的过量蛋白。随后，取10毫升新鲜的Hif培养基加入无菌塑料培养皿中，并将包被后的玻片完全浸入培养基中。

将培养皿置于37摄氏度下振荡孵育一小时，转速为20 RPM。孵育结束后，将载玻片浸入盛有PBS的烧杯中三次，以去除未结合的细菌，随后按照文本方案中所述的革兰染色法对结合的细菌进行显微观察。按照文本方案中所述方法培养A549上皮细胞。

在37摄氏度下对细胞进行一次洗涤和胰蛋白酶消化后，用含有每毫升5微克庆大霉素的完全培养基将细胞悬液稀释至每毫升5,000个细胞。在细菌感染前，将孔板中的培养基更换为F12培养基，并在37摄氏度下孵育过夜。用1毫升磷酸盐缓冲液（PBS）在室温下洗涤细胞单层三次。

然后，将培养板置于冰上，并加入200微升含有10微克/毫升纤连蛋白的预冷F12培养基。在4摄氏度孵育培养板一小时后，用移液器吸弃溶液，并在室温下用1毫升PBS洗涤细胞层两次。每孔加入100微升在F12培养基中新培养的Hif野生型细胞。

将培养板在37摄氏度下孵育两小时。然后用移液器吸去培养基，并用PBS洗涤A549上皮细胞三次。每孔加入50 µL细胞解离溶液，随后在37摄氏度下孵育五分钟。

接着，每孔加入 50 微升 F12 完全培养基以终止酶促反应。将每孔中的上皮细胞转移至含有四颗玻璃珠的 6 毫升玻璃管中。在室温下涡旋振荡 2 分钟以裂解细胞。

将细胞裂解液稀释100倍后，取10微升稀释后的样品接种于巧克力琼脂平板上。在37摄氏度下过夜培养后计数菌落。为进行维甲素依赖性抵抗人血清杀菌活性的分析，首先按照文本方案中所述方法培养并收集细菌菌体。

离心后，用一体积的葡萄糖-明胶-维罗纳缓冲液重悬细菌沉淀。然后，将1,500 CFU的细菌加入含5%血清的100微升DGVB++缓冲液中。将样品在37摄氏度下孵育15分钟，同时以300 RPM振荡。

分别在反应混合物的0分钟和15分钟时取出10微升等分试样。将试样接种至巧克力琼脂平板上，在37摄氏度下过夜培养。巧克力琼脂平板培养后，计数平板上出现的菌落，并按照文本方案中所述计算被杀灭细菌的百分比。

本研究中测试的所有Hif临床分离株均通过流式细胞术确定可在细胞表面招募玻璃粘连蛋白。野生型Hif菌株对玻璃粘连蛋白的结合导致细胞群体发生偏移，而突变株则不能结合玻璃粘连蛋白。主要玻璃粘连蛋白结合蛋白PH与玻璃粘连蛋白之间的蛋白质-蛋白质相互作用通过ELISA进行评估。

结果表明，PH 与玻璃连接蛋白以及阳性对照相比阴性对照均存在显著的相互作用。通过生物膜干涉技术实时估测，PH 与玻璃连接蛋白的相互作用亲和力为 2.2 微摩尔。此外，与野生型细胞相比，细胞表面缺乏 PH 表达的细菌在玻璃连接蛋白包被的玻璃表面表现出黏附能力下降。

此外，上皮细胞表面存在玻连蛋白（Vitronectin）显著增强了Hif的黏附能力。为评估玻连蛋白的补体抑制活性，检测了血清介导的杀伤作用。野生型Hif细胞表现出比突变型细胞更高的血清抗性。

在热灭活血清存在下，未观察到细菌被杀灭。有趣的是，野生型 Hif 在纤连蛋白耗竭血清中的存活率降低，而补充纤连蛋白可提高细菌的存活率。然而，突变菌株对纤连蛋白的耗竭无反应，因其无法将纤连蛋白招募至细胞表面。

掌握该技术后，针对任何病原体均可在三到四天内完成操作，且需注意使用细菌病原体的新鲜培养物。观看本视频后，您应能够充分理解如何分析玻璃粘连蛋白（Vitronectin）与病原体的结合。除本技术外，还可通过蛋白质组学和蛋白质印迹法（western blotting）鉴定细菌表面与玻璃粘连蛋白结合的蛋白质。

该技术对于宿主-病原体相互作用领域的研究人员以及探索细菌毒力机制具有重要意义。