Name: 肝大肠癌转移的高级动物模型:成像技术和转移性克隆性质 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 了解结直肠癌肝转移克隆的动物模型构建方法，通过双标记单克隆细胞系实现体内外定量可视化，用于识别寡转移与多转移相关基因并改善早期诊断和治疗策略。

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我们感谢芝加哥大学的 Geoffrey L. Greene 博士提供 Luc2-tdTomato 质粒和 HCT116 细胞系，感谢动物资源中心的 Ani Solanki 先生在小鼠管理方面的协助，以及 Lara Leoni 博士在DLIT实验中的帮助。荧光和生物发光强度的定量分析在芝加哥大学的综合小型动物影像研究资源中心使用 IVIS Spectrum 系统（PerkinElmer，美国马萨诸塞州霍普金顿）完成。本研究得到 Ludwig 癌症研究基金会（Virginia 和 D.K. Ludwig 基金）、肺癌研究基金会（LCRF）、前列腺癌基金会（PCF）以及癌症中心支持基金（P30CA014599）的资助。资助机构在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未参与。

所有动物实验均经芝加哥大学机构动物护理和使用委员会批准（方案编号 # 72213-09），并在无菌条件下进行。
1. 准备工作
<ol>
	<li>配制500 mL HCT116肿瘤细胞培养用培养基：Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM），添加10%胎牛血清（FBS）、100 U/mL青霉素和100 mg/mL链霉素。</li>
	<li>将用于脾脏注射模型的器械进行高压灭菌，包括3至4块手术巾、纱布、两把小型Adson镊子、持针器、两把剪刀、一个小夹钳和3个微型夹，于251 °F下灭菌20分钟。</li>
	<li>为小鼠准备术后麻醉药物，脾脏注射后经皮下给予。每只小鼠使用500 µL 0.9%生理盐水稀释2 - 4 µg的丁丙诺啡。</li>
	<li>准备150 µg/150 µL的萤火虫荧光素分装液，用于生物发光检测期间的腹腔注射。于-20 °C保存并避光&#160;避光。</li>
</ol>
2. 萤光素酶/tdTomato标记的单克隆细胞系的建立 10,11
<ol>
	<li>解冻并维持 HCT116 人结直肠癌细胞和 293FT 人胚胎肾细胞，使用含 10% 胎牛血清（FBS）、100 U/mL 青霉素和 100 mg/mL 链霉素的 DMEM 培养基，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养。</li>
	<li>制备高滴度慢病毒。
	<ol>
		<li>第 1 天（D 1），将传代次数在 3 至 10 之间的 10 - 12 × 106 个 293FT 细胞接种于 15&#160;cm 细胞培养皿中，每皿加入 18 mL 含 10% FBS、1% 青霉素/链霉素和 1% 非必需氨基酸的完全 DMEM（cDMEM）。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育&#160;。</li>
		<li>第 2 天（D&#160;2），使用以下转染液进行细胞转染：
		<ol>
			<li>每皿使用以下混合物：将 37.5 µg 插入荧光素酶（Luc2）和 tdTomato 构建体的 pFUG 慢病毒载体11（由芝加哥大学 Geoffrey Greene 博士惠赠）、25 µg pCMVΔ8.74 和 12.5 µg pMD2.G 溶于总共 1,062 µL 无菌 H2O 中，再加入 188 µL 的 2 M CaCl2。</li>
			<li>将 1,250 µL 的 2× HEPES 缓冲盐溶液（HBS，含 50 mM HEPES、1.5 mM Na2HPO4 和 180 mM NaCl，pH 7.12）逐滴加入 DNA/CaCl2 溶液中，同时用移液器向溶液中吹入气泡以混匀。</li>
			<li>室温孵育 20 分钟，然后加入 15.5 mL 室温 cDMEM 和氯喹，使氯喹终浓度为 25 µM。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>吸除各皿中 293FT 细胞的培养基，替换为转染液。缓慢加入 16 mL 转染液，避免贴壁细胞脱落。</li>
		<li>第 3 天（D 3），转染后 8 - 16 小时，吸除转染液，用杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）洗涤细胞一次，注意避免细胞脱落。更换为含 10 mM HEPES 的 18 mL 新鲜 cDMEM。 
		注意：操作过程中应轻柔移动培养皿，吸除转染液及添加培养基时应沿皿壁缓慢加入，避免冲击细胞。</li>
		<li>第 4 天（D 4），即转染后 48 小时，用移液器缓慢吸出各皿中的培养基，避免细胞脱落。将收集的培养基在 300 × g 条件下离心 5 分钟，以沉淀大颗粒细胞碎片。</li>
		<li>使用 0.45 µm 低蛋白结合滤器过滤病毒上清液，然后使用 SW-28 转子在 4 °C 条件下以 50,000 × g 离心 2 小时。离心&#160;结束后立即倾去上清液，并用吸水纸擦干管内壁。</li>
		<li>用 50 µL 含 1% FBS 的低血清培养基（RSM）重悬病毒沉淀。分装后可于 -80 °C 保存以备后续使用（病毒原液）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将慢病毒感染 HCT116 细胞，并建立一组 tdTomato 阳性克隆。
	<ol>
		<li>在病毒感染前一天，以 1 × 105 个细胞/孔的密度将 HCT116 细胞接种于 24&#160;孔板中。</li>
		<li>将 40 µL 重悬的病毒液（来自步骤 2.2.7）加入含 1% 青霉素/链霉素和 8 µg/mL 多聚素（polybrene）的 4 mL RSM 中（1:100 稀释），配制成 cRSM 病毒稀释液。</li>
		<li>感染当天，用 DPBS 洗涤细胞一次，然后每孔加入 250 µL 步骤 2.3.2 所得的稀释病毒液。在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 4 小时后，每孔加入 1 mL cDMEM；继续在 37 °C 和 5% CO2 条件下孵育 48 - 72 小时。</li>
		<li>用 1 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA 的溶液重悬细胞，再加入 1 mL cDMEM 以中和胰蛋白酶活性。将细胞转移至微量离心管中，在 300 × g 条件下离心 4 分钟形成细胞沉淀。用含 2% FBS 的 Hank's 平衡盐溶液（HBSS）洗涤沉淀 3 次&#160;。</li>
		<li>将步骤 2.3.4 所得细胞沉淀用 FACS 缓冲液（含 2% FBCS 和 2 mM EDTA 的 PBS）重悬，制备成浓度为 1 × 106 个细胞/mL 的单细胞悬液。</li>
		<li>使用流式细胞分选仪分选 tdTomato 阳性 HCT116 细胞，设门选择 PE 阳性细胞（激发/发射波长：556/585 nm）。将分选出的细胞接种于 10 cm 培养皿中，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养，获得亲代 tdTomato 阳性 HCT116 细胞（图 1A）。</li>
		<li>将步骤 2.3.6 获得的亲代 tdTomato 阳性 HCT116 细胞用 8 mL 含 0.05% 胰蛋白酶和 0.53 mM EDTA 的溶液消化 3 - 5 分钟，然后加入 8 mL cDMEM 中和胰蛋白酶。
		<ol>
			<li>将细胞转移至 50&#160;mL 离心管中，在 300 × g 条件下离心 4 分钟。弃上清，用 cDMEM 将亲代 tdTomato 阳性 HCT116 细胞稀释至每 200 µL 含 1 个细胞（图 1B）。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>将单个细胞（200 µL 稀释液）接种至 96 孔板中，每孔一个细胞，在 5% CO2 和 37 °C 条件下培养（图 1C）。</li>
		<li>将单克隆细胞在培养瓶中继续培养，维持于 5% CO2 和 37 °C 条件下（图 1D）。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. 荧光信号强度随细胞数量的校准
<ol>
	<li>将转染后的 HCT116 细胞（现称为 HCT116-L2T）以每孔 0、103、2 × 104、3 × 105、5 × 104、7 × 104、9 × 104 和 105 个细胞的密度，每种密度设三个复孔，接种于 96&#160;孔板中。</li>
	<li>孵育 5 小时后，使用 IVIS10 定量检测 tdTomato 荧光强度。
	<ol>
		<li>点击桌面上的图像软件图标以启动程序。点击 &#34;Initialize&#34; 按钮初始化成像系统。初始化完成后（约需数分钟），选择 &#34;Fluorescence&#34; 模式，设置曝光时间为 &#34;4 second&#34;， binning 为 &#34;Medium&#34;，F/stop 为 &#34;2&#34;，激发滤光片为 &#34;535&#34;，发射滤光片为 &#34;580&#34;。</li>
		<li>将 96&#160;孔板放置于成像仪载物台上，点击 &#34;Acquire&#34; 开始成像。成像完成后，点击工具栏中的 &#34;ROI Tools&#34;，并从狭缝图标中选择 12 × 8 模式。</li>
		<li>创建 12 × 8 个狭缝区域以覆盖 96&#160;孔板图像上的信号区域，然后点击“测量”标签。此时将弹出一个表格窗口，显示各 ROI 的测量值，单位为光子每秒每球面度每平方厘米（photons/s/sr/cm2）。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>绘制散点图，横坐标（X&#160;轴）为细胞数量，纵坐标（Y&#160;轴）为信号强度。使用数据分析软件拟合回归曲线，计算对应单位荧光强度的细胞数量（图 2）10。</li>
</ol>
4. 肝转移动物模型
<ol>
	<li>当 HCT116-L2T 细胞达到 70 - 80% 汇合度时，于脾脏注射前约 1 小时进行准备。使用含 0.53 mM EDTA 的 0.05% 胰蛋白酶消化 3 - 5 分钟，随后加入等体积的完全 DMEM（cDMEM）中和。务必充分吹打以避免细胞结团。</li>
	<li>使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。</li>
	<li>将细胞重悬于 1× DPBS 中，调整浓度至 1.2 - 2 × 106 个细胞/100 µL。务必充分吹打并彻底重悬细胞，以防止结团。</li>
	<li>将细胞置于冰上直至注射，期间偶尔轻柔吹打混匀。</li>
	<li>在麻醉小鼠前，通过皮下注射 500 µL 步骤 1.3 中所述的布托啡诺混合液，给予术前镇痛和液体负荷。术后每天两次追加相同剂量的布托啡诺混合液，直至疼痛症状消失（如活动减少、蜷缩姿态、不梳理毛发、触碰时发声）。</li>
	<li>在麻醉舱中使用含 2% 异氟烷的氧气对 6 至 8 周龄雌性裸鼠进行麻醉。通过夹捏尾巴确认小鼠已完全进入麻醉状态。使用兽用眼膏涂抹眼睛，防止麻醉期间角膜干燥。&#160;将每只麻醉后的小鼠转移至独立的鼻罩进行脾脏注射。在切口前，每只小鼠均应覆盖无菌手术巾。</li>
	<li>在裸鼠左侧腹侧，通过皮肤外部观察可识别出脾脏为一紫色区域。使用显微手术剪在脾脏正上方的左侧腹壁皮肤做一 8&#160;mm 的切口。
	<ol>
		<li>随后提起腹壁，做一小切口，使空气进入腹腔，促使内脏远离切口部位。将腹壁切口扩大至约 5 mm。</li>
		<li>用棉签轻轻按压切口周围，暴露脾脏。如有需要，可轻柔移动胰腺脂肪组织以辅助暴露，注意避免损伤脾脏。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>使用带 27&#160;G 针头的 1&#160;mL 注射器，缓慢将 100 µL 细胞悬液注入暴露的脾脏尖端。注射过程应持续至少 30 - 60 秒，以避免肝外肿瘤形成。</li>
	<li>注射结束、拔针前，在脾脏注射部位放置一个微型夹，防止细胞悬液泄漏。</li>
	<li>微型夹保留 5 分钟。</li>
	<li>注射后 5 分钟，使用手持电凝设备行脾切除术以实现止血。从腹前侧开始解剖脾门。在处理较大血管时，应先用电凝对血管近端及其邻近脂肪组织进行预凝固，以防止大量出血。 
	注：止血方法包括：直接用电凝凝固出血点、对出血点压迫 3 - 5 分钟，或使用 5-0 丝线缝扎止血。</li>
	<li>以两层缝合方式关闭每只小鼠的腹壁切口。首先使用 5-0 可吸收编织缝线（例如，vicryl）行单个水平缝合关闭腹壁；随后使用 4-0 不可吸收单丝缝线（例如，prolene）行单个水平缝合关闭皮肤。</li>
	<li>每次操作之间，通过喷洒 70% 异丙醇清洁所有器械，以维持无菌条件。 
	注：确保动物在苏醒过程中保持温暖。术后密切观察所有小鼠，直至其能够自主活动并恢复常规行为。通常恢复时间为 3 - 5 分钟。在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看管。接受手术的动物在完全恢复前不得与其他动物合笼饲养。</li>
</ol>
5. 在体实验 生物发光成像
<ol>
	<li>每周进行成像，以测量和量化生物发光随时间的变化。</li>
	<li>将小鼠放入麻醉舱中，使用2%异氟烷与氧气混合气体进行麻醉。通过轻捏小鼠尾巴确认其是否完全进入麻醉状态。在麻醉期间，于眼睛表面涂抹兽用眼膏以防止角膜干燥。</li>
	<li>接着，向每只小鼠腹腔注射150 µL步骤1.4中预先配制好的萤火虫荧光素。</li>
	<li>将小鼠放入IVIS成像仪中，通过独立的鼻罩给予异氟烷麻醉。将小鼠仰卧放置，并使用间隔物分隔，以尽量减少对相邻小鼠信号的干扰。每次最多可同时成像五只小鼠。</li>
	<li>在荧光素注射后3分钟测量并分析生物发光强度。
	<ol>
		<li>在按照步骤 3.2.1 初始化 IVIS 后，选择 &#34;发光的&#34;, &#34;1 秒&#34; 曝光时间，以及 &#34;培养基&#34; 分箱</li>
		<li>点击 &#34;获取&#34; 点击按钮开始成像。确保每次成像均在注射荧光素后相同时间（3 分钟）进行。</li>
		<li>图像采集完成后，将出现图像窗口和工具面板。点击 &#34;ROI 工具&#34; 并选择 &#34;1&#34;, &#34;2&#34;, &#34;3&#34;, &#34;4&#34;，或 &#34;5&#34; 从圆圈图标，对应成像小鼠的数量。</li>
		<li>为定义感兴趣区域（ROIs），在小鼠腹腔内发光信号的信号区域周围绘制圆形，然后点击 &#34;测量&#34; ROI的辐射效率任意单位（光子/秒/平方厘米2/球面度)/(µW/cm2)). 确保另设一个背景区域的ROI圆圈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>注射后四周，在动物处死前，使用IVIS进行漫透射发光成像断层扫描（DLIT），通过个体肿瘤克隆生物发光强度的实时三维重建，评估肿瘤负荷及分布情况。
	<ol>
		<li>将小鼠麻醉并注射荧光素，具体操作如步骤 5.2.4 所述。每次对一只小鼠进行 DLIT 成像。</li>
		<li>在初始化IVIS后，按照3.2.1步骤所述，选择 &#34;成像向导&#34;, &#34;生物发光&#34;，然后单击 &#34;下一步&#34;选择 &#34;DLIT&#34; 并点击 &#34;下一步&#34;选择 &#34;萤火虫&#34; 探针与点击反应 &#34;下一步&#34;选择 &#34;小鼠&#34; 图像主体， &#34;自动&#34; 曝光参数， &#34;C-13 cm&#34; 视野，以及 &#34;0.5 cm&#34; 受试者身高，然后点击 &#34;下一步&#34;. 点击 &#34;获取&#34; 开始成像按钮。</li>
		<li>图像采集完成后，选择 &#34;DLIT 三维重建&#34; 标签和该 &#34;分析&#34; 标签并单击 &#34;重建&#34; 生成三维重建图像。</li>
		<li>点击 &#34;工具&#34; 和 &#34;3D动画&#34;选择 &#34;沿 Y 轴逆时针旋转&#34; 在3D动画窗口中，单击 &#34;记录&#34; 和 &#34;保存&#34; .mov 格式的文件</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
6. 离体 荧光成像
<ol>
	<li>在麻醉状态下通过颈椎脱位处死小鼠，或根据机构指南&#160;在脾脏注射后4至6周进行处死。</li>
	<li>取出肝脏。从左侧至右侧肋腹部做一横向切口。用镊子夹住剑突，分离镰状韧带、肝静脉和下腔静脉。
	<ol>
		<li>分离右侧肝肾韧带、肝十二指肠韧带和左侧肝肾韧带，在分离肝十二指肠韧带时注意避免损伤尾状叶。肝脏取出后，移除胆囊，因其会产生自发荧光。记录是否存在其他肝外肿瘤。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>肉眼观察并记录肝脏肿瘤的数量和大小，并将取出的肝脏置于DPBS中。 
	注：肿瘤在肉眼下可见为白色病灶（代表性示例见图4）。</li>
	<li>在将肝脏放置于成像板之前，用纸巾轻轻吸去表面多余液体。</li>
	<li>使用IVIS测量每个肿瘤克隆的荧光强度。
	<ol>
		<li>选择&#34;荧光&#34;模式，曝光时间为&#34;4秒&#34;，binning设为&#34;中等&#34;，F/stop设为&#34;2&#34;，激发滤光片设为&#34;535&#34;，发射滤光片设为&#34;580&#34;。点击&#34;采集&#34;按钮开始成像。</li>
		<li>图像采集完成后，定位图像窗口和工具面板。点击&#34;ROI工具&#34;，从圆形图标中选择&#34;1&#34;。定义感兴趣区域（ROI）时，在图像上圈选各个肿瘤克隆的信号区域，然后点击&#34;测量&#34;以获得辐射效率的任意单位值（(光子数/s/cm2/球面度)/(µW/cm2)）。确保额外设置一个背景区域的ROI圆圈。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>假设肿瘤为球形，计算总肿瘤体积。肿瘤体积 = 4 × π × r3 / 3（r = 半径）。计算肿瘤克隆形成细胞的比例（Fc），即肝脏中肿瘤数量除以脾脏注射的细胞数量。</li>
	<li>根据步骤3.3的线性近似计算每个克隆的总细胞数（=X）。计算细胞分裂次数（=Y），Y = log2X，倍增时间Td计算为Td（天）= 28 / Y。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

本报告中所介绍的动物模型基于两种主要方法。首先，为了能够观察具有不同肝定植和增殖倾向的转移性克隆，我们建立了一组高度异质性的单克隆细胞系，而非使用未经分选的已建立癌细胞系12,13。这种以单克隆方式研究转移发展的策略得到了近期基因组数据的支持14，并已被成功用于模拟转移过程10,15,16。其次，通过将荧光素酶和tdTomato标记物对亲本细胞系进行双标记，以增强对转移性生长在体内（in vivo）和离体（ex vivo）条件下的分析能力。发光和荧光标记使得能够详细进行解剖学观察，并可对转移性肿瘤的数量（视为肝定植的频率或效率）以及各个克隆的大小进行定量评估。后者可通过步骤2中描述的简单校准程序，轻松转换为实际的细胞数量，相关方法见图210和图410。利用这些数据，可以估算肝脏中每个转移灶的倍增时间（Td），并评估每种初始注射单克隆所形成的肝转移灶的生长动力学（图5）10...

原发性结直肠癌（CRC）伴肝转移患者的预后较差。原发性非转移性结直肠癌（I - III期）患者的5年生存率估计为75 - 88%3,4，而伴有肝转移（IV期）的患者5年生存率仅为8 - 12%5,6。然而，转移性患者属于异质性群体，其转移灶数量和复发时间各不相同。临床观察表明，转移灶的数量（可能与定植能力或定植频率成正比）以及单个转移灶的大小（与局部生长速率成正比）是两个独立的预后因素1,7。换句话说，转移性克隆在肝脏中成功定植依赖于两个主要特性：其在肝脏微环境中生长的能力，以及播散和存活的能力。
成功临床模型的设计若具备捕获和量化转移性克隆特性的能力，将极大促进我们对肝转移生物学的理解，并为潜在治疗策略的开发提供有效工具。实验性肝转移模型此前已有报道8,9，但两者均无法对单个转移性克隆的特性进行定量捕获和描述 体内 和 离体.
本文介绍了一种新型且先进的肝转移模型，该模型包含生成具有不同肝脏定植效率和生长特性的肿瘤克隆。我们采用双标记方法，将荧光素酶与tdTomato荧光蛋白共同标记癌细胞，并建立具有内在转移能力差异的单克隆细胞系。在此实验模型中，数据表明肝转移瘤的发展可通过定植频率和倍增时间（Td）来描述，这与临床观察结果一致。该模型的定量特性使其易于应用于药物发现和诊断研究。

<table><tbody><tr><td>IVIS Spectrum &lt;em&gt;活体&lt;/em&gt;成像系统</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>124262</td><td>&lt;em&gt;活体&lt;/em&gt;成像系统</td></tr><tr><td>LivingImage 4.0 软件</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>128165</td><td>成像软件</td></tr><tr><td>VAD-MGX 研究用麻醉机</td><td>Vetamac</td><td>VAD-MGX</td><td>吸入式麻醉机</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-118</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>青霉素/链霉素溶液（10,000 单位青霉素；10,000 &amp;mu;g 链霉素）</td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>ThermoFisher</td><td>24020117</td><td>细胞培养试剂</td></tr><tr><td>布托啡诺注射液（0.3 mg/mL）</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare Ltd.</td><td>12496-0757-5</td><td>盐酸布托啡诺</td></tr><tr><td>Gemini 电凝系统</td><td>Braintree Scientific</td><td>GEM 5917</td><td>脾切除用手持式电凝设备</td></tr><tr><td>微型夹；直型；70 克压力；1.5 mm 夹宽；10 mm 钳口长度</td><td>Roboz 外科器械公司</td><td>RS-5426</td><td>止血夹：脾脏注射后止血器械</td></tr><tr><td>D-荧光素钾盐</td><td>Goldbio Technology</td><td>LUCK-1G</td><td>荧光素钾盐</td></tr><tr><td>Opti-MEM I 低血清培养基</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td>低血清培养基</td></tr><tr><td>TC20 自动细胞计数仪</td><td>BIO-RAD</td><td>1450102</td><td>自动细胞计数仪</td></tr><tr><td>JMP10 软件&amp;nbsp;</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>数据分析软件</td></tr><tr><td>BD FACSAria II 细胞分选仪</td><td>BD Biocsiences</td><td></td><td>细胞分选仪</td></tr></tbody></table>

肝内结直肠转移的高级动物模型：成像技术与转移克隆特性

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

肝转移灶数量有限且进展速度较慢的患者可通过局部治疗手段获得有效治疗1,2然而，关于肝转移的异质性目前所知甚少，亟需能够评估单个转移灶发育过程的动物模型。本文介绍了一种先进的肝转移模型，可实现对肝脏中单个肿瘤克隆发育过程的定量可视化，并能够估算其生长动力学参数和定植效率。我们构建了一系列单克隆来源的HCT116人结直肠癌细胞系，这些细胞稳定表达荧光素酶和tdTomato，并具有不同的生长特性。通过脾脏注射后行脾切除术，这些克隆中的大多数能够在肝脏形成转移灶，但其定植频率和生长速率各不相同。利用该模型 在体 内&#160;成像系统（IVIS），可以可视化并定量分析转移灶的发育过程 体内 发光的和 离体 荧光成像。此外，漫透射发光成像断层扫描（DLIT）可提供肝转移灶的三维分布 体内. 离体 收获肝脏的荧光成像可对单个肝转移灶进行定量测量，从而评估肝脏定植频率及转移灶的生长动力学。由于该模型与临床观察到的肝转移相似，可作为筛选与肝转移相关基因以及测试潜在消融性或辅助治疗手段的平台，用于肝转移性疾病的研究。

本实验的目的是建立一种稳定且易于重复的动物模型，具有对目标指标进行连续定量检测的潜力 体内 转移性肿瘤负荷，以及肝转移灶定植频率和生长动力学的评估。 图2-6，图注来自我们此前在知识共享CC-BY许可下的出版物10.
双标记肿瘤细胞单克隆的制备
首先，构建了一组具有不同转移能力的、带有发光和荧光标记的单克隆细胞系。在成功将发光蛋白（Luc2）和荧光蛋白（tdTomato）转染至亲本HCT116结直肠癌细胞后，通过将亲本HCT116-L2T细胞稀释至1个细胞/孔，获得了16个双标记的单克隆细胞系。200 &#181;L 在 96&#160;孔板（图1)10. 体外 使用逐渐增加的细胞数量对HCT...

转移性克隆定植于远端部位的能力取决于其增殖能力，和/或在宿主微环境中不发生显著增殖而存活的能力。本文介绍了一种动物模型，可对转移性克隆的这两种肝脏定植方式进行定量可视化观察。

肝转移灶数量有限且进展速度较慢的患者可通过局部治疗手段获得良好疗效1,2。

该方法的总体目标是建立由结直肠癌产生的转移性肿瘤克隆在肝脏定植的模型，并利用该模型改进肝转移的诊断与治疗。临床观察表明转移性疾病具有异质性。我们的模型能够捕捉这种异质性，从而识别与寡转移和多转移疾病相关的基因。并将这些知识用于改进转移灶的早期检测和治疗。本技术的主要优势在于，我们使用源自结直肠癌患者的双标记单克隆细胞系，能够在体内和离体条件下观察肝转移灶的发育过程。该技术的应用前景可拓展至转移性疾病的治疗领域。这使我们能够通过定量评估每个转移病灶的数量及其生长动力学，来检验任何潜在药物的效果。根据文本方案，在制备表达荧光素酶和tdTomato标记的HCT116细胞，并准备好培养基、试剂和仪器后，将转染后的细胞以如下密度每孔接种于96孔板中，每个条件设三个复孔。细胞孵育5小时后，启动桌面上的成像软件，使用IVIS系统定量检测tdTomato的荧光强度。单击“初始化”按钮，以设置成像时间、介质二值化、F/Stop值为2、激发滤光片为535、发射滤光片为580。将96孔板放置在成像仪上，然后单击“采集”以开始成像。图像采集完成后，在工具面板中单击“ROI工具”，然后从狭缝图标中选择12×8。在96孔板图像的信号区域创建12×8个狭缝，然后单击“测量”选项卡。观察显示ROI测量值的窗口，其单位为光子数每秒每球面度每平方厘米。当细胞融合度达到70%至80%时，在脾脏注射前约一小时，向细胞中加入0.05%胰蛋白酶和0.53毫摩尔EDTA，以解离细胞。孵育细胞三到五分钟之后，加入等体积的C-DMEM以中和胰蛋白酶。用移液器充分吹打细胞悬液以避免细胞结团，然后使用自动细胞计数仪进行细胞计数。将悬浮细胞以每100 µL含1.2至2 × 10⁶个细胞的浓度，用1× DBPS重悬后冻存，移液过程中需充分吹打以防止细胞聚集。然后将细胞置于冰上直至注射，期间偶尔在管中重新悬浮细胞。根据文本方案，对一只6至8周龄的雌性裸鼠给予镇痛剂并进行麻醉后，通过皮肤在左侧腹侧观察到的紫色区域确定脾脏位置，并在该器官上方的左侧腹侧皮肤做一道8毫米的切口。接着，提起腹壁并做一个小切口。让空气进入腹腔，使内脏远离切口位置。随后将腹壁切口扩大至约五毫米。注射操作的演示步骤对该手术至关重要。注射过程中肿瘤细胞外漏可能导致肝外转移。注射应缓慢进行，持续时间为30至60秒，注射细胞数量不超过150万个，以防止门静脉血栓形成。使用棉签轻轻按压切口周围，暴露脾脏。如有需要，可轻柔移动胰腺脂肪以充分暴露脾脏，避免损伤脾脏。使用装有27号针头的1毫升注射器，在30至60秒内将100微升细胞悬液注入暴露的脾脏尖端。注射结束后，在拔出针头前于脾脏穿刺处放置一个微型夹，以防止细胞悬液外漏，并保持夹子原位5分钟。注射后5分钟，使用手持电凝设备行脾切除术以止血。从脾门的前侧开始，预先凝固血管近端及其邻近的脂肪组织。注射部位可能出现脾脏出血。使用微型夹夹闭脾脏，以防止肿瘤细胞泄漏并控制脾脏出血。止血方法可包括电凝、压迫止血3至5分钟，必要时可采用缝合结扎。使用5.0可吸收编织缝线行单个水平缝合关闭腹壁。然后，使用4.0号不可吸收单股缝线以单个水平缝合方式缝合皮肤。根据文本方案对动物进行术后监测。进行生物发光成像时，按照文本方案麻醉小鼠后，经腹腔注射150微升预先配制的萤火虫荧光素酶底物（firefly luciferin）。将小鼠仰卧置于IVIS中，小鼠之间放置间隔物，以尽量减少对相邻小鼠信号的干扰。在注射荧光素酶底物（luciferin）3分钟后，启动IVIS，选择生物发光模式，曝光时间为1秒，中等binning模式。点击“Acquire”按钮开始成像，确保每次成像均在注射luciferin后3分钟进行。图像采集完成后，图像窗口和工具面板将出现，点击 ROI 工具，并从圆形图标中选择 1 至 5 的编号，该编号对应成像的小鼠数量。定义 ROI 时，围绕小鼠腹腔内发光信号的区域画出圆形，然后点击 ROI 的测量值，以光子通量的任意单位表示辐射强度。另需为背景区域添加一个 ROI 圆形。注射后四周，为进行弥散性发光成像断层扫描（DLIT），在启动IVIS后，选择成像向导、生物发光，然后单击下一步。选择DLIT，单击下一步。选择萤火虫探针，然后单击下一步。选择小鼠作为图像对象，曝光参数选择自动，视野选择13厘米，对象类型选择0.5厘米，然后单击“下一步”。接着单击“采集”按钮以开始成像。采集图像后，在“分析”选项卡中选择“DLIT 3D重建”选项卡，然后单击“重建”以生成3D重建图像。点击工具和3D动画。然后在3D动画窗口中，选择绕Y轴逆时针旋转。点击录制并保存，将文件保存为mov格式。根据文本方案，从小鼠体内取出并解剖肝脏后，使用 IVIS 对每个肿瘤克隆的荧光强度进行离体荧光成像。选择荧光模式，曝光时间为 4 秒，中等 binning，F/Stop 设为 2，激发滤光片设为 535，发射滤光片设为 580。点击采集按钮开始成像。获取图像后，在工具面板中找到图像窗口。单击 ROI 工具，然后从圆形图标中选择 1。要定义感兴趣区域（ROI），请在图像上圈出单个肿瘤克隆的信号区域。获取背景的另一个感兴趣区域（ROI）圆，并点击ROI的测量值作为辐射强度的任意单位。再获取一个背景的感兴趣区域（ROI）圆。最后，根据文本方案进行计算。如生物发光图像所示，在脾脏注射三周后，与O1和O2克隆相比，HCT116 L2T克隆P1和P2的肿瘤负荷更大。这些数据表明，克隆O1和O2可模拟寡转移性疾病，而P1和P2则代表肝脏中侵袭性强且广泛播散的转移性定植。在脾脏注射四周后对肝脏进行离体荧光定量分析，进一步证实P1和P2的荧光强度高于O1和O2的肝脏。通过荧光标记肿瘤克隆，可识别肝脏中各个转移灶的数量和大小。总体而言，离体荧光成像结果与肉眼观察结果一致，但荧光成像能更有效地检测到隐藏在组织表面下的微小病灶。如图所示，对每例肝脏中的转移性病灶数量和大小进行计数与测量，并对各单克隆来源的每个转移性病灶进行离体荧光成像。如图中所示，P1组的转移灶总数高于P2、O1和O2组，而P2组单个病灶的平均尺寸则大于P1、O1和O2组。本模型为鉴定与转移分子异质性相关的新“劝导”基因提供了一种研究方法。这些基因可作为治疗转移性疾病新策略的靶点。我们的模型还可用于验证当前大型临床数据库中发现的、但在转移性疾病背景下尚未明确其功能的蛋白质编码基因和非编码基因。通常，初次使用该方法的研究人员会因动物手术操作的精细性而面临困难。然而，经过练习，可在较短时间内获得良好结果。在进行该操作时，需牢记遵循动物手术指南，严格控制出血，并防止肿瘤细胞悬液泄漏。

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