肝大肠癌转移的高级动物模型:成像技术和转移性克隆性质
November 30th, 2016
转移性克隆在远处位点定植的能力取决于它们的增殖能力和/或它们在宿主微环境中存活而不显著增殖的能力。在这里，我们提出了一个动物模型，该模型允许通过转移性克隆对两种类型的肝脏定植进行定量可视化。
这种方法的总体目标是模拟结直肠癌产生的转移性肿瘤克隆的肝脏定植，并使用该模型来改进肝转移的诊断和治疗。临床观察表明转移性疾病的异质性。我们的模型提供了捕获这种异质性以检测与寡转移性和多转移性疾病相关的基因的能力。
并利用这些知识来改进转移的早期检测和治疗。我们技术的主要优点是我们使用来自结直肠癌患者的双标记单克隆细胞系，并且可以在体内和体外观察肝转移的发展。该技术的意义延伸到转移性疾病的治疗。
它使我们能够通过定量估计转移病灶的数量和每个病灶的生长动力学来测试任何潜在的药物。在生成荧光素酶 tdTomato 标记的 HCT116 细胞并制备培养基、试剂和仪器后，根据文本方案，以以下密度每孔一式三份将转录的细胞接种在 96 孔板中。在细胞孵育 5 小时后，通过在桌面上启动图像软件，使用 IVIS 系统量化 tdTomato 荧光强度。
单击初始化按钮可初始化成像时间、中等合并、F/Stop 为 2、激发滤光片 535 和发射滤光片 580。将 96 孔板放在成像站上，然后单击 Acquire 开始成像。获取图像后，在工具调色板中，单击 ROI 工具，然后从狭缝图标中选择 12x8。
创建 12x8 狭缝以覆盖 96 孔板图像上的信号区域，然后单击 Measurements 选项卡。观察一个窗口，其中包含 ROI 测量表，其中的单位为每秒光子数、每个球面度、每平方厘米。一旦细胞达到 70% 至 80% 的汇合度，大约在脾脏注射前一小时，向细胞中添加 0.05% 的 tripsin 和 0.53 毫摩尔的 EDTA 以解离它们。
孵育细胞 3 至 5 分钟后，使用等体积的 C-DMEM 中和三叉戟蛋白。彻底移液培养物以避免结块，然后使用自动细胞计数仪对细胞进行计数。将浓度为 1.2 至 2 x 10 的 1x DBPS 中的悬浮细胞冷冻至每 100 μL 6 个细胞，彻底移液以避免结块。
然后，将细胞保持在冰上直至注射，偶尔将它们重新悬浮在试管中。根据文本方案对 6 至 8 周龄的雌性无胸腺裸鼠施用镇痛药和麻醉后，将脾脏识别为通过左侧皮肤从外部看到的紫色区域，并在器官上方的皮肤上做一个 8 毫米的左侧切口。接下来，抬起腹壁并做一个小切口。
让空气进入腹腔，使内脏器官远离切口部位。然后将腹壁切口扩大到大约 5 毫米。演示的注射步骤对于该程序至关重要。
注射过程中肿瘤细胞渗漏可导致肝外转移。注射应缓慢进行，持续 30 至 60 秒，注射细胞不超过 150 万个，以防止门静脉血栓形成。用棉签在切口周围轻轻按压，露出脾脏。
如果需要，可以轻柔地处理胰脂肪以帮助暴露，以免损伤脾脏。使用带有 27 号针头的 1 毫升注射器，在 30 到 60 秒内，将 100 微升细胞注射到暴露的脾脏尖端。注射结束时，在取出针头之前，在脾脏上放置一个微夹，以防止注射的细胞悬液泄漏，并将其留在原位 5 分钟。
注射后 5 分钟，使用手持式烧灼装置进行脾切除术以止血。从前侧的脾门开始，用相邻的脂肪组织预凝血管的近端。脾出血可能发生在注射部位。
将微夹应用于脾脏以防止肿瘤细胞渗漏并控制脾出血。止血方法包括烧灼、保持压力 3 到 5 分钟，必要时进行缝合结扎。使用 5.0 可吸收编织缝合线和单次水平缝合闭合腹壁。
然后，使用 4.0 不可吸收的单丝缝合线闭合皮肤，也用单针水平缝合。根据文本协议，术后监测动物。为了进行生物发光成像，根据文本方案麻醉小鼠后，腹膜内注射 150 微升先前制备的萤火虫荧光素。
将小鼠置于仰卧位的 IVIS 中，动物之间有垫片，以尽量减少对相邻小鼠的信号。荧光素注射后 3 分钟，初始化 IVIS 后，选择发光、1 秒曝光时间和中等分档。单击 Acquire 按钮开始成像，确保在荧光素注射后 3 分钟始终进行成像。
获取图像并显示图像窗口和工具调色板后，单击 ROI 工具并从与成像的小鼠数量相对应的圆圈图标中从 1 到 5 中选择一个数字。要定义 ROI，请在鼠标腹腔上圈出发光信号的信号区域，然后单击 ROI 的测量值作为任意辐射单位。在背景中包括一个额外的 ROI 圆圈。
注射后 4 周，要进行漫射发光成像断层扫描或 DLIT，初始化 IVIS 后，选择 Imaging Wizard（成像向导）、Bioluminescence（生物发光），然后单击 Next（下一步）。选择 DLIT 并单击 Next。选择 Firefly Probes，然后单击 Next。
为图像主体选择鼠标，为曝光参数 C-13 厘米选择自动作为视野，为 0.5 厘米作为主体类型，然后单击下一步。然后单击 Acquire 按钮开始成像。获取图像后，在 Analyze 选项卡中选择 DLIT 3D Reconstruction 选项卡，然后单击 Reconstruct 生成 3D 重建图像。
单击 Tools and 3D Animation。然后，在 3D Animation 窗口中，选择 Spin CCW on Y-Axis。点击 Record and Save 将文件保存为 mov 格式文件。
为了进行离体荧光成像，在根据文本方案从小鼠中收集和解剖肝脏后，使用 IVIS 测量每个肿瘤集落的荧光强度。通过选择荧光、4 秒曝光时间、中等像素合并、F/Stop 为 2、激发滤光片为 535，发射滤光片为 580。单击 Acquire 按钮开始成像。
获取图像后，找到 图像 工具调色板中的窗口。单击 ROI 工具，然后从圆圈图标中选择 1。要定义 ROI，请在图像上圈出单个肿瘤集落的信号区域。
获取背景的附加 ROI 圆圈，然后单击 ROI 的测量作为任意辐射单位。获取背景的额外 ROI 圈。最后，根据文本协议进行计算。
如生物发光所示，脾脏注射后 3 周，与克隆 O1 和 O2 相比，HCT116 L2T 克隆 P1 和 P2 具有更大的肿瘤负荷。这些数据表明，克隆 O1 和 O2 可以模拟寡转移性疾病，而 P1 和 P2 代表肝脏侵袭性广泛转移定植。截至脾脏注射后 4 周肝脏离体荧光的定量证实，与 O1 和 O2 肝脏相比，P1 和 P2 具有更高的荧光强度。肿瘤克隆的荧光标记确定了肝脏中单个转移集落的数量和大小。
总体而言，离体荧光图像与宏观结果一致，但隐藏在表面下的小菌落通过荧光成像可以更好地检测到。如此处所示，对每个肝脏中转移集落的数量和大小进行计数和测量，并对每个单克隆的每个转移集落进行离体荧光成像。如这些图表所示，与 P2、O1 和 O2 相比，P1 中的转移总数更高，而 P2 中单个集落的平均大小大于 P1、O1 和 O2。我们的模型提供了一种识别与转移分子异质性相关的新说服基因的方法。
这些基因可用作转移治疗新方法的靶标。我们的模型还可用于验证不同的蛋白质编码和非编码基因，这些基因来自当前大型临床数据库，但尚未在转移性疾病的背景下进行功能定义。一般来说，由于动物手术的精细性，刚接触这种方法的人会很挣扎。
然而，通过练习，可以在短时间内获得良好的结果。在尝试此程序时，重要的是要记住遵循动物手术指南，小心控制出血，并防止肿瘤细胞悬液泄漏。
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概述
本研究提出了一个动物模型，旨在定量可视化来自结直肠癌的转移性肿瘤克隆在肝脏中的定植。该模型捕捉了转移性疾病的异质性，有助于检测与不同转移模式相关的基因。
关键研究组成部分
科学领域
- 肿瘤学
- 转移
- 结直肠癌
背景
- 转移性疾病表现出显著的异质性。
- 了解肝脏定植对改进诊断至关重要。
- 现有模型缺乏可视化转移克隆的增殖和存活能力。
- 临床观察突出了更好检测方法的需求。
研究目的
- 建立转移性肿瘤克隆在肝脏中定植的模型。
- 改进肝转移的早期检测和治疗。
- 识别与少转移和多转移疾病相关的基因。
使用的方法
- 利用来自结直肠癌患者的双标记单克隆细胞系。
- 观察体内和体外肝转移的发展。
- 定量可视化技术用于评估定植。
- 分析与转移行为相关的基因表达。
主要结果
- 该模型成功捕捉了转移克隆的异质性。
- 识别了与不同转移模式相关的关键基因。
- 实现了对肝转移动态的加深理解。
- 该技术显示出改进治疗策略的潜力。
结论
- 该模型为转移性肝脏定植提供了宝贵的见解。
- 它对转移的诊断和治疗有潜在影响。
- 进一步的研究可能根据研究结果改进治疗方法。
常见问题
Executive Industry Relevance
This model addresses the critical need in oncology R&D to capture metastatic heterogeneity for improved target validation and therapeutic screening. By enabling quantitative visualization of individual tumor clones in vivo and ex vivo, it supports mechanistic de-risking of liver metastasis mechanisms. The approach provides predictive value for prioritizing genes and compounds in colorectal cancer metastasis programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing differential colonization efficiency of monoclonal tumor clones.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantification of metastasis frequency and growth kinetics across clonal variants.
- Predictive Value: Facilitates portfolio triage by identifying clones that mimic oligometastatic versus polymetastatic disease phenotypes.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, luciferase- and tdTomato-labeled cell lines suitable for reproducible in vivo imaging workflows.
- Quantitative Output: Provides luminescent and fluorescent readouts to measure tumor burden and individual colony size over time.
- Screening Enablement: Allows testing of potential drugs with quantitative estimation of lesion numbers and growth kinetics per metastatic clone.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models clinically observed liver metastasis heterogeneity to bridge discovery and preclinical validation.
- Translational Continuity: Supports evaluation of ablative or adjuvant treatments using quantifiable metastatic colonization endpoints.
- Risk-Adjusted Decisions: Enables assessment of gene candidates from clinical databases for functional validation in metastasis context.
Pipeline & Workflow Integration
The model fits within the discovery-to-preclinical continuum, supporting target identification through phenotypic screening and lead optimization via quantitative metastasis readouts.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of metastasis-associated genes by correlating clonal labeling with in vivo colonization patterns.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative bioluminescent and fluorescent outputs for evaluating compound effects on metastatic burden.
- Analytics: Provides ex vivo fluorescent measurements of individual colonies to assess size, number, and growth kinetics for structure-activity relationships.
- Translational Research: Connects in vivo imaging findings to ex vivo validation, supporting biomarker-aligned advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for testing multiple gene targets or therapeutic agents across colorectal cancer metastasis studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metastasis models by resolving clonal heterogeneity in liver colonization.
- Operational Value: Standardizes metastasis assessment through dual-modality imaging (IVIS bioluminescence and fluorescence) and 3D tomographic reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing quantitative metrics on metastatic efficiency and growth rates prior to lead investment.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their influence on oligometastatic versus widespread metastatic phenotypes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal surgery, particularly splenic injection and splenectomy in athymic nude mice.
- Dependent on IVIS imaging systems capable of bioluminescent, fluorescent, and diffuse luminescent imaging tomography (DLIT) modalities.
- Necessitates standardized cell preparation, including luciferase/tdTomato labeling, clonal expansion, and viability verification prior to injection.
- Involves cross-team coordination between oncology, imaging, and animal care units for longitudinal metastasis monitoring.
- Limited by the technical demands of preventing tumor cell leakage during injection, which can confound extra-hepatic metastasis readings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:14
Calibration of Fluorescent Signal Intensity as a Function of Cell Number
2:29
Animal Model of Liver Metastases
5:44
In Vivo Bioluminescent Imaging
7:58
Ex Vivo Fluorescent Imaging
9:05
Results: Metastases and Differential Liver Colonization of Colorectal Cancer Cells
10:34
Conclusion
