Name: 小胶质细胞作为替代生物传感器确定纳米颗粒神经毒性 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 了解利用小胶质细胞作为替代生物传感器检测纳米颗粒神经毒性的体外实验方法。该技术通过激活小胶质细胞并收集条件培养基，评估其对下丘脑神经元的影响，为神经毒理学研究提供经济高效的动物实验替代方案。

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本工作由美国退伍军人事务部生物医学实验室研究与开发项目（BLR&amp;D）IK2 BX001686（授予TAB）、明尼苏达大学健康食品与健康生活研究所（授予CMD、JPN和TAB）以及明尼苏达州退伍军人医学研究与教育基金会（授予TAB）的资助支持。我们感谢Philippe Marambaud博士（纽约州曼哈塞特Feinstein医学研究所）和Weihua Zhao博士（德克萨斯州休斯顿卫理公会医院）提供BV2细胞系。

1. 小胶质细胞培养的维持
<ol>
	<li>将细胞培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基；DMEM）置于 37 °C 预热，培养基中添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素/新霉素（PSN）。</li>
	<li>从 -80 °C 保存处取出第 18 至 25 代的冻存 BV2 小胶质细胞，迅速放入 37 °C 水浴中解冻。</li>
	<li>轻柔地将细胞转移至含有 10 ml 细胞培养基的 75 cm2 透气培养瓶中。</li>
	<li>将培养瓶置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育。24 小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至约 70–80% 汇合度。</li>
</ol>
2. 细胞计数与接种
<ol>
	<li>在37 °C水浴中预热DMEM和1x胰蛋白酶-EDTA溶液。</li>
	<li>吸除细胞培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液，在37 °C孵育2–5分钟。</li>
	<li>使用细胞刮将细胞从培养瓶中刮下，并重悬于5 ml DMEM中。将细胞悬液通过70 µm细胞筛网，转入50 ml离心管，重复吹打三次。</li>
	<li>使用血细胞计数板计数细胞，并将8,000个细胞/孔接种至黑色壁透明底培养板中，每孔终体积为200 µl，含10% FBS和1% PSN的DMEM。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24小时。</li>
	<li>移除旧的DMEM，更换为200 µl含1% PSN的预温DMEM，以对小胶质细胞进行血清饥饿处理。将培养板置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24小时。</li>
</ol>
3. 激活小胶质细胞
<ol>
	<li>在不同的离心管中，将AgNPs（0.01、0.05或0.1 µg/ml）和载体/中性对照（柠檬酸钠，0.04 mM）用含1% PSN的无血清DMEM稀释至最终工作浓度。</li>
	<li>从每个孔中移除100 µl培养基，并加入100 µl相应的处理化合物。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
</ol>
4. 过滤条件培养基
<ol>
	<li>从每个孔中收集 200 µl 培养基上清液，转移至带有收集管（容量为 1.5 至 2 ml）的滤膜装置中（分子量截留值为 10 kDa）。</li>
	<li>在室温下以 14,000 × g 离心 15 分钟。</li>
	<li>弃去穿滤液（含颗粒的上清液），将滤膜倒置放入新的收集管中。</li>
	<li>在室温下以 1,000 × g 离心 2 分钟。 
	注意：所得滤过培养基（含分泌的细胞因子）浓度被浓缩了六倍。</li>
	<li>用新鲜的 DMEM（补充 10% FBS 和 1% PSN）将浓缩液体积补至 400 µl，并置于冰上保存。 
	注意：为确保滤过培养基中的残留 AgNPs 已被去除，需根据约 390 - 420 nm 处的特征吸收峰建立 AgNP 浓度标准曲线10。简而言之，准备未过滤的 AgNPs 等分试样（0、0.01、0.025、0.05、0.1 和 0.2 µg/ml，如步骤 3.1 所述）以及过滤后的溶剂对照（柠檬酸钠，0.04 mM），均溶于无血清 DMEM 中。将 50 µl 过滤后的样品和标准品加入黑色壁透明底板中。使用分光光度计在 390 - 410 nm 处测定吸光度，并与 AgNP 浓度曲线进行比较。若过滤样品的吸光度值与溶剂对照样品相同，则可认为残留 AgNPs 已被完全去除。</li>
	<li>取一半滤过培养基，按照市售试剂盒说明书检测 TNF-α 的分泌水平。</li>
</ol>
5. 下丘脑细胞培养的维持
<ol>
	<li>将添加了10% FBS和1% PSN的DMEM细胞培养基预热至37 °C。</li>
	<li>取第18至25代冻存的下丘脑（mHypo-A1/2）细胞（储存于80 °C），在37 °C水浴中快速解冻。</li>
	<li>轻柔地将细胞转移至含有10 ml细胞培养基的75 cm2透气培养瓶中。</li>
	<li>将培养瓶置于5% CO2、37 °C条件下培养。24小时后吸除培养基，更换新鲜培养基。培养细胞至融合度约为70–80%。</li>
</ol>
6. 确定下丘脑细胞毒性
<ol>
	<li>将DMEM和1×胰蛋白酶-EDTA溶液在37 °C水浴中预热。</li>
	<li>吸去下丘脑细胞的培养基，加入500 µl胰蛋白酶溶液。在37 °C孵育2–5分钟。按照上述第2步所述，使用细胞刮刀从培养瓶中收集细胞。</li>
	<li>使用血细胞计数板对细胞进行计数，并将下丘脑细胞以每孔5,000个细胞的密度接种于黑色壁透明底板中，每孔终体积为200 µl DMEM，补充10% FBS和1% PSN，于37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。</li>
	<li>使用多通道移液器吸去100 µl旧培养基，加入100 µl过滤后的浓缩条件培养基，使其终浓度为1×。</li>
	<li>将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。</li>
	<li>加入22 µl刃天青试剂，于37 °C、5% CO2条件下孵育20分钟。</li>
	<li>使用多功能酶标仪记录荧光值（激发波长560 nm，发射波长590 nm），以检测细胞活力。结果以相对荧光单位（RFU）表示。</li>
</ol>

<ol><li>Block, M. L., Calderon-Garciduenas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution%3A+mechanisms+of+neuroinflammation+and+CNS+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Air pollution: mechanisms of neuroinflammation and CNS disease.</a> Trends Neurosci. 32, 506-516 (2009).</li>
<li>Brochu, P., Bouchard, M., Haddad, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+daily+inhalation+rates+for+health+risk+assessment+in+overweight%2Fobese+children%2C+adults%2C+and+elderly%5BTitle%5D)+AND+%22Risk+Anal%22%5BJournal%5D)">Physiological daily inhalation rates for health risk assessment in overweight/obese children, adults, and elderly.</a> Risk Anal. 34, 567-582 (2014).</li>
<li>Jerrett, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traffic-related+air+pollution+and+obesity+formation+in+children%3A+a+longitudinal%2C+multilevel+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health%22%5BJournal%5D)">Traffic-related air pollution and obesity formation in children: a longitudinal, multilevel analysis.</a> Environ Health. 13, 49(2014).</li>
<li>Kraft, A. D., Harry, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+microglia+and+neuroinflammation+relevant+to+environmental+exposure+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Environ+Res+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Features of microglia and neuroinflammation relevant to environmental exposure and neurotoxicity.</a> Int J Environ Res Public Health. 8, 2980-3018 (2011).</li>
<li>Duffy, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+orexin+A+signaling+in+dietary+palmitic+acid-activated+microglial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of orexin A signaling in dietary palmitic acid-activated microglial cells.</a> Neurosci Lett. 606, 140-144 (2015).</li>
<li>Butterick, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+caspase+multiplexing+assay+to+determine+apoptosis+in+a+hypothalamic+cell+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a caspase multiplexing assay to determine apoptosis in a hypothalamic cell model.</a> J Vis Exp. , (2014).</li>
<li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+cell+viability+and+proliferation+in+hydrogel-encapsulated+system+by+resazurin+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay.</a> Appl Biochem Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).</li>
<li>Blasi, E., Barluzzi, R., Bocchini, V., Mazzolla, R., Bistoni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immortalization+of+murine+microglial+cells+by+a+v-raf%2Fv-myc+carrying+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">Immortalization of murine microglial cells by a v-raf/v-myc carrying retrovirus.</a> J Neuroimmunol. 27, 229-237 (1990).</li>
<li>Belsham, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+neurotrophic+factor+recruitment+of+glucagon-like+peptide-1+mediates+neurogenesis%2C+allowing+immortalization+of+adult+murine+hypothalamic+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Ciliary neurotrophic factor recruitment of glucagon-like peptide-1 mediates neurogenesis, allowing immortalization of adult murine hypothalamic neurons.</a> FASEB J. 23, 4256-4265 (2009).</li>
<li>Paramelle, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+to+estimate+the+concentration+of+citrate+capped+silver+nanoparticles+from+UV-visible+light+spectra%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">A rapid method to estimate the concentration of citrate capped silver nanoparticles from UV-visible light spectra.</a> Analyst. 139, 4855-4861 (2014).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+exposure+to+air+pollution+particles+increases+the+risk+of+obesity+and+metabolic+syndrome%3A+findings+from+a+natural+experiment+in+Beijing%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Chronic exposure to air pollution particles increases the risk of obesity and metabolic syndrome: findings from a natural experiment in Beijing.</a> FASEB J. , (2016).</li>
<li>Levesque, S., Surace, M. J., McDonald, J., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+pollution+%26+the+brain%3A+Subchronic+diesel+exhaust+exposure+causes+neuroinflammation+and+elevates+early+markers+of+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Air pollution & the brain: Subchronic diesel exhaust exposure causes neuroinflammation and elevates early markers of neurodegenerative disease.</a> J Neuroinflammation. 8, 105(2011).</li>
<li>Block, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+outdoor+air+pollution+and+brain+health+workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">The outdoor air pollution and brain health workshop.</a> Neurotoxicology. 33, 972-984 (2012).</li>
<li>Carson, M. J., Crane, J., Xie, A. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+CNS+microglia%3A+the+quest+to+identify+predictive+models%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today+Dis+Models%22%5BJournal%5D)">Modeling CNS microglia: the quest to identify predictive models.</a> Drug Discov Today Dis Models. 5, 19-25 (2008).</li>
<li>Valdearcos, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+dictate+the+impact+of+saturated+fat+consumption+on+hypothalamic+inflammation+and+neuronal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Microglia dictate the impact of saturated fat consumption on hypothalamic inflammation and neuronal function.</a> Cell Rep. 9, 2124-2138 (2014).</li>
<li>Perry, V. H., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+priming+in+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Microglial priming in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurol. 10, 217-224 (2014).</li>
<li>Block, M. L., Hong, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+microglial+activation+and+progressive+dopaminergic+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Chronic microglial activation and progressive dopaminergic neurotoxicity.</a> Biochem Soc Trans. 35, 1127-1132 (2007).</li>
<li>Vincenti, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+Microglia+Response+during+the+Time+Course+of+Chronic+Neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Defining the Microglia Response during the Time Course of Chronic Neurodegeneration.</a> J Virol. 90, 3003-3017 (2015).</li>
<li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+brain+region-dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial brain region-dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19, 504-516 (2016).</li>
<li>Lull, M. E., Block, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+activation+and+chronic+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Microglial activation and chronic neurodegeneration.</a> Neurotherapeutics. 7, 354-365 (2010).</li>
<li>Oeckinghaus, A., Hayden, M. S., Ghosh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosstalk+in+NF-kappaB+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Crosstalk in NF-kappaB signaling pathways.</a> Nat Immunol. 12, 695-708 (2011).</li>
<li>Gifford, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-modified+gold+nanoparticles+for+the+inhibition+of+Mycobacterium+smegmatis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">Thiol-modified gold nanoparticles for the inhibition of Mycobacterium smegmatis.</a> Chem Commun (Camb). 50, 15860-15863 (2014).</li>
<li>Colella, M., Lobasso, S., Babudri, F., Corcelli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palmitic+acid+is+associated+with+halorhodopsin+as+a+free+fatty+acid.+Radiolabeling+of+halorhodopsin+with+3H-palmitic+acid+and+chemical+analysis+of+the+reaction+products+of+purified+halorhodopsin+with+thiols+and+NaBH4%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Palmitic acid is associated with halorhodopsin as a free fatty acid. Radiolabeling of halorhodopsin with 3H-palmitic acid and chemical analysis of the reaction products of purified halorhodopsin with thiols and NaBH4.</a> Biochim Biophys Acta. 1370, 273-279 (1998).</li>
<li>Sherry, B., Jue, D. M., Zentella, A., Cerami, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+high+molecular+weight+glycosylated+forms+of+murine+tumor+necrosis+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Characterization of high molecular weight glycosylated forms of murine tumor necrosis factor.</a> Biochem Biophys Res Commun. 173, 1072-1078 (1990).</li>
<li>PubChem Compound Database. , National Center for Biotechnology Information. 
 <a target="_blank" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755">https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/104755</a> (2004).</li>
<li>Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+phagocytosis+induced+by+fibrillar+beta-amyloid+and+IgGs+are+differentially+regulated+by+proinflammatory+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines.</a> J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).</li>
<li>McCarthy, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+adult+murine+immortalized+microglial+cell+line+and+its+activation+by+amyloid-beta%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel adult murine immortalized microglial cell line and its activation by amyloid-beta.</a> J Neuroinflammation. 13, (2016).</li>
<li>Schauer, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+airborne+particulate+matter+using+organic+compounds+as+tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Atmos+Environ%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of airborne particulate matter using organic compounds as tracers.</a> Atmos Environ. 30, 3837-3855 (1996).</li>
<li>Kleeman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Source+apportionment+of+fine+%28PM1.8%29+and+ultrafine+%28PM0.1%29+airborne+particulate+matter+during+a+severe+winter+pollution+episode%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Source apportionment of fine (PM1.8) and ultrafine (PM0.1) airborne particulate matter during a severe winter pollution episode.</a> Environ Sci Technol. 43, 272-279 (2009).</li>
<li>Borm, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+risks+of+nanomaterials%3A+a+review+carried+out+for+ECETOC%5BTitle%5D)+AND+%22Part+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The potential risks of nanomaterials: a review carried out for ECETOC.</a> Part Fibre Toxicol. 3, (2006).</li>
</ol>

作者声明无利益冲突。

近期研究表明，环境暴露与肥胖及其他神经退行性疾病相关11,12。然而，以往研究中使用的技术耗时且昂贵。经济成本、生理相关性递送系统的缺乏、大量使用in vivo动物模型所涉及的伦理问题，以及将研究结果转化为有意义的健康建议的困难，是阻碍纳米颗粒诱导神经毒性研究进展的主要挑战之一13。因此，使用in vitro小胶质细胞替代生物传感器已成为研究环境暴露下神经毒素影响的重要工具14。在上述方法中，我们提供了一种直接评估纳米颗粒（如AgNPs）如何激活小胶质细胞并诱导神经毒性的方法。需要注意的是，由于细胞未被固定或裂解，因此可对小胶质细胞或神经元进行包括基因表达分析和Western blot在内的其他下游应用。除了进行TNF-α ELISA检测外，还可利用上清液分析经刺激后小胶质细胞释放的多种细胞因子和分泌因子。
小胶质细胞的活化可由多种不同因素引起，包括环境暴露、感染、缺血和损伤，从而导致其形态学和生理学的改变。持续性的M1型小胶质细胞活化与多种神经退行性疾病相关，例如肥胖、阿尔茨海默...

环境污染物，特别是纳米颗粒（NP）范围（1 - 20 nm 直径）的污染物，由于能够穿过血脑屏障，已被关联到肥胖症及其他神经退行性疾病 1-3暴露于高水平的污染物可能引发中枢神经系统（包括下丘脑）的炎症反应 1一种可能的机制是纳米颗粒激活小胶质细胞（脑内免疫细胞）所致 4. 先前的研究已使用 体内 用于研究纳米颗粒对脑健康影响的模型耗时长、成本高，且无法直接回答纳米颗粒如何影响小胶质细胞的问题。小胶质细胞在中枢神经系统中具有多种功能，包括维持脑微环境稳态，并通过释放分泌因子和细胞因子与周围神经元进行通讯。根据不同的刺激信号，小胶质细胞可被激活为M1型促炎状态或M2型抗炎状态。例如，M1型活化的小胶质细胞会释放肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎细胞因子，而M2型活化的小胶质细胞则释放白细胞介素-4（IL-4）等抗炎细胞因子。为验证我们的替代模型 体外 用于测定空气污染物神经毒性的生物传感器，我们测量了小胶质细胞对20 nm银纳米颗粒（AgNPs）的反应。本文旨在描述如何实现这一目标 体外 小胶质细胞系可作为替代性生物传感器标志物，用于检测小鼠小胶质细胞对纳米颗粒的反应，以及小胶质细胞活化对下丘脑细胞的影响。该经验证模型的长期应用目标是评估真实环境污染物对脑健康及神经退行性疾病的影响。本文提供了详细的描述 体外 用于检测小胶质细胞活化及下丘脑细胞存活率的96孔板检测方法，基于小胶质细胞条件培养基处理后的分析。
采用肿瘤坏死因子-α（TNF-α）酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测经银纳米颗粒（AgNP）暴露后的小胶质细胞活化情况。为确定活化的小胶质细胞对下丘脑细胞的影响，使用过滤装置从小胶质细胞的上清液（条件培养基）中去除AgNPs。该过滤装置可根据粒径大小保留细胞因子，同时排除AgNPs。简言之，收集经AgNPs处理或未处理的小胶质细胞上清液，加入滤器中，并在14,000 × g条件下离心15分钟。随后，我们能够评估小胶质细胞分泌的细胞因子对下丘脑细胞存活率的影响。通过基于刃天青的检测方法测定细胞暴露于含细胞因子的条件培养基后的细胞毒性，具体方法如前所述5,6。代谢活跃的细胞可将刃天青还原，产生与活细胞数量成正比的荧光信号7。
与其它方法（如共培养、Transwell 培养系统或体内实验）相比，该技术具有多项优势。本模型能够直接激活小胶质细胞，并判断其分泌因子是否对神经元具有毒性作用8。当前方案采用经20 nm直径纳米颗粒刺激的永生化BV2小胶质细胞，以及永生化的小鼠下丘脑细胞（命名为mHypo-A1/2）9，以测定后续反应。尽管本方案已针对上述特定条件进行了优化，但相关方法可进行调整，用于其它小胶质细胞诱导的细胞死亡模型，或与其他细胞类型（包括原代小胶质细胞和神经元）联合使用。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;细胞/试剂&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>小鼠小胶质细胞系（BV2）</td><td>Interlab细胞系保藏中心（意大利热那亚）</td><td>ATL03001</td><td></td></tr><tr><td>成年小鼠下丘脑细胞系 mHypoA-1/2&amp;nbsp;</td><td>Cellutions Biosystems Inc.</td><td>CLU172</td><td></td></tr><tr><td>杜尔贝科&amp;rsquo;s 改良伊格尔&amp;rsquo;s 培养基</td><td>Invitrogen</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>胎牛血清&amp;nbsp;</td><td>PAA Labs</td><td>A15-751</td><td></td></tr><tr><td>青霉素/链霉素/新霉素</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15640-055</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶-EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>银纳米颗粒（20 nm）</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>730793</td><td></td></tr><tr><td>&lt;br/&gt; PrestoBlue 细胞活力检测试剂</td><td>Invitrogen</td><td>A13262</td><td></td></tr><tr><td>小鼠 TNF-&amp;alpha; ELISA Max Delux</td><td>Biolegend</td><td>430904</td><td></td></tr><tr><td>脂多糖</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4391</td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;名称&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;公司&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;目录编号&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;评论&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;设备&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96孔光学底板，黑色聚苯乙烯，细胞培养处理，带盖，无菌</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>165305</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-0.5 离心滤过装置（含 Ultracel-10 膜）</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC501008</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax M5 多功能微孔板读板仪</td><td>Molecular Devices</td><td>M5</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 ml 圆锥形离心管</td><td>康宁公司</td><td>&lt;br/&gt; 14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 细胞筛 70 &amp;mu;m</td><td>康宁股份有限公司</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>台式离心机 5430</td><td>Eppendorf</td><td>22620560</td><td></td></tr></tbody></table>

小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

空气污染物中的纳米颗粒可改变神经递质谱型，加剧神经炎症，并影响大脑功能。因此，本文所述的检测方法将有助于阐明小胶质细胞在神经炎症及神经退行性疾病中的作用。利用作为大脑常驻免疫细胞的小胶质细胞作为替代性生物传感器，可为炎症反应如何介导神经元损伤提供新的见解。本文中，我们采用一种永生化的小鼠小胶质细胞系（BV2），并描述了一种以银纳米颗粒（AgNPs）为标准的纳米颗粒暴露方法。我们阐述了如何使小胶质细胞暴露于纳米颗粒，如何从上清液中去除纳米颗粒，以及如何利用活化后小胶质细胞的上清液，通过下丘脑细胞存活率来评估其毒性。在AgNP暴露后，采用肿瘤坏死因子α（TNF-α）酶联免疫吸附试验（ELISA）验证BV2小胶质细胞的活化状态。上清液经过滤以去除AgNP，同时保留细胞因子及其他分泌因子于条件培养基中。随后将下丘脑细胞暴露于经AgNP活化的小胶质细胞上清液中，并采用基于刃天青的荧光检测法测定神经元的存活情况。该技术适用于将小胶质细胞作为神经炎症的替代性生物标志物，并用于评估神经炎症对其他细胞类型的影响。

我们通过上述方案表明，小胶质细胞可作为纳米颗粒对脑部反应的替代性生物传感器。我们的结果包括测量小胶质细胞活化对下游神经元细胞死亡的毒性效应。图1展示了激活小胶质细胞并确定其分泌的细胞因子是否降低下丘脑神经元存活率的实验流程。暴露于AgNP后，TNF-α的分泌显著增加（图2）。当下丘脑神经元暴露于AgNP活化的小胶质细胞的条件培养基时，细胞存活率显著降低（图3）。图4概述了AgNP激活小胶质细胞并导致下丘脑细胞死亡的潜在机制。
<img alt="使用离心机进行蛋白质纯化的步骤：上样、离心、倒置、冲洗。操作流程示意图。" src="/files/ftp_upload/54662/54662fig1.jpg" data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="图1"> 
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小胶质细胞（大脑的免疫细胞）可作为替代性生物传感器，用于确定纳米颗粒对神经毒性的影 响。我们描述了一系列实验设计，旨在检测小胶质细胞对纳米颗粒的反应，以及下丘脑神经元暴露于活化小胶质细胞上清液后的神经毒性效应。

空气污染物中的纳米颗粒可改变神经递质谱型、加剧神经炎症并影响脑功能。因此，该检测方法……

本实验方案的总体目标是描述一种用于检测小胶质细胞对纳米颗粒反应的体外替代生物传感器。随后，我们将测定神经元在暴露于经纳米颗粒刺激的小胶质细胞所分泌的条件培养基后的神经毒性。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如如何主动筛选具有神经毒性的纳米颗粒。该技术的主要优势在于，我们的模型能够直接激活小胶质细胞，并确定其分泌因子是否为神经毒素，而无需依赖昂贵的长期啮齿类动物实验。尽管该方法可揭示微粒暴露后小胶质细胞诱导的细胞死亡机制，但它也可应用于其他神经退行性疾病模型，用于检测潜在的神经毒性环境污染物。通常，初次使用该方法的研究人员在条件培养基过滤步骤中会遇到困难，因为过滤效率可能因纳米颗粒的大小、形状和浓度不同而有所差异。在操作前，将添加了10% FBS和1% PSN的DMEM预热至37°C。然后取第18至25代的冻存BV2小胶质细胞，在37摄氏度下快速解冻。接着，将解冻后的细胞轻柔转移至含有10毫升培养基的75平方厘米通气培养瓶中，并进行培养。24小时后更换培养基，继续培养细胞，直至细胞融合度达到70–80%。此时吸除培养基，加入500微升预热的1×胰蛋白酶-EDTA溶液。将培养瓶再孵育数分钟后，使用刮刀将细胞收集至5毫升预热的DMEM培养基中。随后使用70微米细胞筛将细胞从培养瓶中过滤。使用同一细胞筛重复过滤三次，并将细胞收集至50毫升离心管中。过滤后，对细胞进行计数，然后在200微升含补充物的DMEM培养基中，以每孔8000个细胞的密度接种至黑色壁透明底板中。培养24小时后，将各孔中的培养基更换为无血清DMEM，以饥饿小胶质细胞。再继续培养24小时后，开始激活小胶质细胞。为此，首先将银纳米颗粒用无血清的 DMEM 培养基稀释至所需的工作浓度。然后将 100 µL 培养基更换为含处理化合物的溶液。务必设置不含纳米颗粒的稀释溶剂作为阴性对照。继续孵育24小时后，进行分析。首先，从每个孔板中收集200微升上清液，加载到滤膜上，以去除位于微型离心管上方的纳米颗粒。需要注意的是，在过滤纳米颗粒时，其尺寸、形状和浓度均会影响融合效率。因此，建议预先测试过滤效果。现在将离心管在室温下以14000g离心15分钟。随后弃去含有纳米颗粒的滤过液，将滤膜倒置放入新的收集管中。将滤膜倒置，在1000g条件下离心2分钟，以收集含有细胞因子的浓缩条件培养基。随后，加入新配制的补充型DMEM，将收集液体积调整至400微升，并将试管置于冰上保存。为确保滤过培养基中残留的硫纳米颗粒被完全去除，需在无血清DMEM中配制一系列浓度梯度的未滤过纳米颗粒标准品，浓度范围从空白至0.2微克/毫升。然后将过滤后的样品及各标准品分别取 50 毫升加入至黑色壁透明底板中，测定 390 至 410 纳米波长处的吸光度。为测定样品中 TNF-α 的浓度，使用剩余体积的一半进行市售试剂盒检测。本实验需从冻存细胞中建立下丘脑细胞系。采用建立小胶质细胞培养物所述的相同方法，最终将细胞接种于黑色壁透明底板中，每孔5000个细胞，每孔加入200微升含补充物的DMEM培养基。培养24小时后，移除100微升培养基，替换为100微升来自活化小胶质细胞培养物的过滤浓缩培养基，然后在标准条件下继续孵育24小时。第二天，向每个孔中加入 22 µL 刃天青试剂，继续孵育 20 分钟。然后使用多功能分光光度计测定荧光值，以相对荧光单位评估细胞活力。通过上述方案，小胶质细胞功能可作为大脑对纳米颗粒反应的替代性生物传感器。小胶质细胞在暴露于银纳米颗粒后，TNF-α 的分泌显著增加。当下丘脑神经元暴露于经银纳米颗粒激活的小胶质细胞的条件培养基时，神经元的存活率显著降低。原则上，银纳米颗粒的暴露使小胶质细胞活化为M1型促炎状态。随后，释放的促炎性细胞因子会导致周围细胞死亡。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用小胶质细胞作为替代性生物传感器来检测纳米颗粒的反应性，以及该反应是否具有神经毒性。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四天内完成。通过此操作步骤，还可进一步开展其他方法，例如在小胶质细胞活化后对其分泌的其他细胞因子进行分析，以表征小胶质细胞的活化状态。

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小胶质细胞作为替代生物传感器确定纳米颗粒神经毒性

用于评估纳米颗粒在细胞内生物分布的生物成像方法，适用于纳米制剂化合物的治疗和诊断监测。通过组织学共定位分析，本文所述方法具有高灵敏度和特异性。这些方法为从啮齿类动物到人类的应用提供了转化路径。...

用于诊断与治疗监测的纳米材料注册生物成像

小胶质细胞是中枢神经系统的常驻巨噬细胞，承担着免疫防御和免疫监视的第一道防线。微小RNA（microRNA）是一类调控分子，在包括巨噬细胞的活化与分化在内的多种生理过程中发挥重要作用。本文介绍了在小胶质细胞中检测微小RNA的方法。...

在正常中枢神经系统及神经炎症期间通过实时PCR检测小胶质细胞中的微小RNA

本视频演示了一种利用小胶质细胞评估纳米颗粒神经毒性的方法。该方法包括用纳米颗粒激活小胶质细胞、过滤条件培养基以分离小胶质细胞来源的促炎性细胞因子，以及利用该条件培养基检测下丘脑神经元的毒性。...

利用小胶质细胞作为替代生物传感器评估纳米颗粒对神经元的毒性

成功研究小胶质细胞生物学的一个关键在于，从小胶质细胞从中枢神经系统组织中分离的过程中，保持其免疫功能的 ex vivo 状态。通过旋转振荡法分离小胶质细胞，可获得高纯度且具有免疫功能的细胞培养物，这一点在使用促炎刺激物脂多糖（LPS）和 Pam3CSK4（Pam）激活小胶质细胞后，通过荧光成像、免疫细胞化学和 ELISA...

从新生小鼠中分离保留免疫表型和功能的皮层小胶质细胞

小胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中的常驻免疫细胞，具有高度吞噬或摄取其细胞外环境中物质的能力。本文介绍了一种广泛适用、可靠且高度定量的检测方法，用于可视化并测量小胶质细胞介导的突触组分的吞噬作用。...

一种吞噬作用检测方法：评估中枢神经系统吞噬细胞与神经元相互作用的实验方案

小胶质细胞活化和小胶质细胞增生是慢性神经退行性变的关键反应。本文介绍了相关方法...

体内 神经退行过程中视网膜小胶质细胞活化的动态变化：小鼠青光眼模型中的共聚焦眼底成像与细胞形态测量

小胶质细胞的吞噬作用对于维持组织稳态至关重要，而吞噬功能不足已被认为与多种病理过程相关。然而，评估小胶质细胞功能 体内...

评估视网膜小胶质细胞的吞噬功能 体内 使用基于流式细胞术的检测方法

在此，我们介绍一种从新生小鼠（出生第1天）中分离小胶质细胞的实验方案 体外...

快速且优化的CD11b磁珠分离原代小胶质细胞方法，具有更高纯度与多功能性

本文介绍了一种从小鼠脑组织中分离原代小胶质细胞的实验方案。该技术有助于深入理解神经系统疾病。通过结合密度梯度离心与磁珠分选方法，可获得产量充足且纯度较高的细胞样本。此外，我们还概述了小胶质细胞表征的具体步骤。...

通过密度梯度离心法对小鼠原代小胶质细胞进行表征与分离

本文展示了一种利用转盘共聚焦显微镜对视网膜中小胶质细胞的运动性及其与突触后斑点接触进行可视化和定量分析的方法。...

活体成像与特征分析疾病小鼠视网膜中小胶质细胞动态及其与突触的相互作用

小胶质细胞参数绘图软件（MMPS）是一种用户友好的分析流程，无需编程专业知识，可对免疫荧光图像中的单个小胶质细胞形态进行半自动分析。该软件已在啮齿类动物脂多糖诱导的神经炎症模型中得到验证，能够稳定检测与激活相关的形态学变化，实现标准化、可扩展的小胶质细胞表型分析。...

微胶质细胞参数绘图软件（MMPS）：一种用于定量分析微胶质细胞形态的开源、用户友好型工具

了解利用小胶质细胞作为替代生物传感器检测纳米颗粒神经毒性的体外实验方法。该技术通过激活小胶质细胞并收集条件培养基，评估其对下丘脑神经元的影响，为神经毒理学研究提供经济高效的动物实验替代方案。

小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

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