Microglia as a Surrogate Biosensor to Determine Nanoparticle Neurotoxicity

该协议的总体目标是描述用于测试小胶质细胞对纳米颗粒的反应的体外替代生物传感器。然后，我们将确定暴露于用纳米颗粒刺激的小胶质细胞的条件培养基后的神经毒性。这种方法可以帮助回答神经科学领域的关键问题，例如如何积极筛选纳米颗粒的神经毒性。

该技术的主要优点是我们的模型提供了直接激活小胶质细胞并确定分泌因子是否为神经毒素的能力，而无需使用昂贵的长期啮齿动物研究。尽管这种方法可以深入了解微粒暴露后小胶质细胞诱导的细胞死亡。在测试潜在神经毒性环境污染物的背景下，它也可以应用于其他神经退行性疾病模型。

通常，刚接触这种方法的人会遇到条件培养基过滤步骤的困难。因为过滤效率可能因纳米颗粒的大小、形状和浓度而异。在制备过程中，将补充有 10% FBS 和 1%PSN 的 DMEM 加热至 37 摄氏度。

然后取从第 18 25 代获得的冷冻 BV2 小胶质细胞，并在 37 摄氏度下快速解冻。接下来，轻轻地将解冻的细胞转移到装有 10 mL 培养基的 75 平方厘米的通气瓶中，并在培养瓶中孵育。24 小时后，更换培养基并继续培养细胞，直到它们达到 70-80% 的汇合度此时，吸出培养基并加入 500 μL 温热的 1 胰蛋白酶 EDTA 溶液。

让培养瓶再孵育几分钟后，使用刮刀将细胞收集到 5 mL 温热的 DMEM 中。然后使用 70 微米过滤器过滤培养瓶中的细胞。使用相同的过滤器重复过滤 3 次，并将细胞收集在 50 毫升试管中。

过滤后，对细胞进行计数，然后在 200 微升补充的 DMEM 中接种每孔 8000 个细胞的黑壁透明底板。孵育 24 小时后，用无血清 DMEM 替换孔中的培养基，以使小胶质细胞饥饿。再孵育 24 小时后，继续激活小胶质细胞。

为此，首先将无血清 DMEM 中的银纳米颗粒稀释至所需的工作浓度。然后用处理化合物替换 100 微升培养基。确保包括不含纳米颗粒的稀释载体溶液的阴性对照。

现在继续孵育 24 小时并继续分析。首先，从每个板孔中收集 200 微升上清液培养基，并将其加载到过滤器上，该过滤器将去除放置在微量离心管上的纳米颗粒。重要的是要记住，在过滤纳米颗粒时，它们的大小、形状和浓度是聚变效率的一个因素。

因此，建议事先测试过滤。现在，在室温下以 14000 g 离心试管 15 分钟。然后丢弃包含纳米颗粒的流通液，并将过滤器倒置放入新的收集管中。

将过滤器以 1000 g 的浓度倒置旋转 2 分钟，以收集含有细胞因子的浓缩条件培养基。接下来，用新鲜制备的补充 DMEM 将收集的体积增加到 400 微升，并将试管储存在冰上。为确保从过滤介质中去除残留的硫纳米颗粒，在无血清 DMEM 中制备浓度范围为空白至 0.2 μg/mL 的未过滤纳米颗粒标准品。

然后将 50 毫升过滤后的样品和每个标准品分装到黑壁透明底板中，并测量 390 至 410 纳米的吸光度。要测量样品中 TNF-α 的浓度，请在市售试剂盒中使用其剩余体积的一半。对于该测定，从冷冻原液中建立下丘脑细胞。

使用描述的用于建立小胶质细胞培养物的相同方法。最终使用它们在 200 微升补充的 DMEM 中以每孔 5000 个细胞接种黑壁透明底板。培养 24 小时后，去除 100 μL 培养基，用从活化的小胶质细胞培养物中收集的 100 μL 过滤和浓缩培养基替换，然后在标准条件下将板孵育 24 小时。

第二天，向每个孔中加入 22 μL 刃天青试剂，并继续孵育 20 分钟。然后，使用多模式分光光度计进行荧光测量，以相对荧光单位估计细胞的活力。根据概述的协议，小胶质细胞功能可以用作大脑对纳米颗粒反应的替代生物传感器。

小胶质细胞分泌的 TNF-alfa 在条纳米颗粒暴露后显著增加。当下丘脑神经元暴露于来自银纳米颗粒活化的小胶质细胞的条件培养基时，神经元的活力显着降低。原则上，暴露于银纳米颗粒会激活小胶质细胞至 M1 促炎状态。

然后释放的促炎细胞因子导致周围细胞死亡。观看此视频后，您应该对如何使用小胶质细胞作为替代生物传感器来测试对纳米颗粒的反应以及这种反应是否具有神经毒性有很好的了解。一旦掌握，如果执行得当，这项技术可以在三到四天内完成。

遵循此程序，可以执行其他方法，例如分析小胶质细胞激活后的其他分泌的细胞因子，以便对小胶质细胞激活状态进行表型分析。