小胶质细胞作为替代性生物传感器用于评估纳米颗粒的神经毒性

本实验方案的总体目标是描述一种用于检测小胶质细胞对纳米颗粒反应的体外替代生物传感器。随后，我们将测定神经元在暴露于经纳米颗粒刺激的小胶质细胞所分泌的条件培养基后的神经毒性。该方法有助于回答神经科学领域中的关键问题，例如如何主动筛选具有神经毒性的纳米颗粒。

该技术的主要优势在于，我们的模型能够直接激活小胶质细胞，并确定其分泌因子是否为神经毒素，而无需依赖昂贵的长期啮齿类动物实验。尽管该方法可揭示微粒暴露后小胶质细胞诱导的细胞死亡机制，但它也可应用于其他神经退行性疾病模型，用于检测潜在的神经毒性环境污染物。

通常，初次使用该方法的研究人员在条件培养基过滤步骤上会遇到困难，因为过滤效率可能因纳米颗粒的大小、形状和浓度不同而有所差异。在操作前，将添加了10% FBS和1% PSN的DMEM预热至37摄氏度。

然后取来自第18至25代的冻存BV2小胶质细胞，在37摄氏度下快速解冻。接着，将解冻后的细胞轻柔转移至含有10毫升培养基的75平方厘米通气培养瓶中，并进行孵育。24小时后更换培养基，继续培养细胞，直至细胞融合度达到70–80%。此时吸除培养基，加入500微升预热的1×胰蛋白酶-EDTA溶液。

将培养瓶再孵育数分钟后，用细胞刮将细胞收集至5毫升预热的DMEM培养基中。随后使用70微米细胞筛将细胞从培养瓶中过滤。使用同一细胞筛重复过滤三次，并将细胞收集至50毫升离心管中。

过滤后，对细胞进行计数，然后在200微升含补充物的DMEM培养基中，以每孔8000个细胞的密度接种至黑色壁透明底板中。孵育24小时后，将各孔中的培养基更换为无血清DMEM，以饥饿小胶质细胞。再继续孵育24小时后，开始激活小胶质细胞。

为此，首先将银纳米颗粒用无血清的 DMEM 培养基稀释至所需的工作浓度。然后，用 100 微升该处理液替换原有培养基。务必设置不含纳米颗粒的稀释溶剂溶液作为阴性对照。

继续孵育24小时后，进行分析。首先，从每孔板中收集200微升上清液，加载到滤膜上，以去除位于微型离心管上方的纳米颗粒。需要注意的是，在过滤纳米颗粒时，其尺寸、形状和浓度均会影响融合效率。

因此，建议预先测试过滤效果。现在将离心管在室温下以14000g离心15分钟。随后弃去含有纳米颗粒的滤过液，将滤膜倒置放入新的收集管中。

在1000g条件下将滤膜倒置离心两分钟，以收集含有细胞因子的浓缩条件培养基。随后，加入新配制的补充型DMEM，将收集液体积调整至400微升，并将试管置于冰上保存。为确保滤过培养基中残留的硫纳米颗粒被完全去除，需在无血清DMEM中配制一系列浓度梯度的未滤过纳米颗粒标准品，浓度范围从空白至0.2微克/毫升。

然后将过滤后的样品及各标准品分别取 50 毫升加入至黑色壁透明底板中，测定 390 至 410 纳米波长处的吸光度。为测定样品中 TNF-α 的浓度，使用剩余体积的一半进行市售试剂盒检测。本实验需从冻存细胞中建立下丘脑细胞系。

采用建立小胶质细胞培养物所述的相同方法，最终将细胞接种于黑色壁透明底板中，每孔5000个细胞，每孔加入200微升含补充物的DMEM培养基。培养24小时后，移除100微升培养基，替换为100微升来自活化小胶质细胞培养物的过滤浓缩培养基，然后在标准条件下继续孵育24小时。

第二天，向每个孔中加入22微升刃天青试剂，继续孵育20分钟。然后使用多功能分光光度计进行荧光检测，以相对荧光单位评估细胞活力。通过上述方案，小胶质细胞功能可作为大脑对纳米颗粒反应的替代性生物传感器。

小胶质细胞在暴露于银纳米颗粒后，TNF-α 的分泌显著增加。当下丘脑神经元暴露于经银纳米颗粒激活的小胶质细胞的条件培养基时，神经元的存活率显著降低。原则上，银纳米颗粒的暴露使小胶质细胞活化为 M1 型促炎状态。

随后，释放的促炎性细胞因子会导致周围细胞死亡。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用小胶质细胞作为替代性生物传感器来检测纳米颗粒的反应性，并判断该反应是否具有神经毒性。一旦掌握，若操作得当，该技术可在三到四天内完成。

通过此操作步骤，还可进一步开展其他方法，例如在小胶质细胞活化后对其分泌的其他细胞因子进行分析，以表征小胶质细胞的活化状态。