Name: β细胞的有丝分裂原持续管理局完整小鼠胰岛离体使用可生物降解的聚（乳酸 - 共 - 乙醇酸）微球 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 31 s
Description: 了解如何使用PLGA微球向完整小鼠胰岛持续递送化合物，以研究β细胞增殖。该方法可用于糖尿病治疗研究，具有体内应用的潜力。

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作者谨此感谢范德堡大学的 Bethany Carboneau 对本文手稿的审阅。我们还感谢范德堡大学医学中心胰岛分离与分析核心实验室的 Anastasia Coldren 提供胰岛分离技术支持，并感谢范德堡大学医学中心的 Alvin C. Powers 博士和范德堡大学的 David Jacobson 博士提供离心机和组织培养设施的使用支持。本研究使用了由美国国立卫生研究院资助（资助号 DK20593）的范德堡糖尿病研究与培训中心下属的胰岛分离与分析核心实验室的资源。本研究工作得到了美国心脏协会博士后奖学金（14POST20380262）对 R.C.P. 的资助，以及青少年糖尿病研究基金会（1-2011-592）和美国退伍军人事务部（1BX00090-01A1）对 M.A.G. 的资助。

所有操作均经范德比尔特大学机构动物护理和使用委员会批准，并遵循其规定执行。
1. 对 COI 进行荧光标记（可选）
<ol>
	<li>选择一种可与游离伯胺发生反应的荧光染料（例如，用于蛋白质）的荧光染料，如琥珀酰亚胺酯或荧光素衍生物，以可视化微球内容物。将过量8倍摩尔量（相对于COI的摩尔数）的荧光染料溶解于200 µl二甲基亚砜（DMSO）中。</li>
	<li>将50 mg的COI用载体溶液重悬至终体积800 µl（终浓度为62.5 ng/µl）。载体溶液的组成取决于COI的来源。 
	注：常用的溶剂包括磷酸盐缓冲液（PBS）或二甲基亚砜（DMSO）。</li>
	<li>从步骤1.1中加入全部荧光染料/DMSO溶液，重悬COI。在4 °C条件下涡旋振荡过夜。或者，可在室温（RT）下涡旋振荡反应混合物4小时。</li>
	<li>标记反应完成后，使用脱盐柱去除多余的荧光染料。
	<ol>
		<li>从脱盐柱中排出储存缓冲液，并用16 ml去离子水冲洗。弃去所有流出液。</li>
		<li>将荧光标记的COI加入脱盐柱中，用1.2 ml去离子水洗脱，并收集流出液。</li>
		<li>重复洗脱步骤四次，每次加入 1.2 ml 去离子水，并将流出液作为单独样品收集。</li>
		<li>将所有收集的穿流样品在 -80 °C 冻存，并根据制造商说明冻干 24 小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. COI负载微球的制备 通过 水包油包水乳液溶剂蒸发法
<ol>
	<li>将1 mg荧光标记的COI加入100 µl去离子水中，形成第一水相（W1）。</li>
	<li>在微量离心管中，将65 mg聚乳酸-羟基乙酸共聚物（50:50 乳酸:羟基乙酸，分子量54,000 - 69,000）溶于750 µl二氯甲烷中。在160 W条件下超声处理10 - 30秒，使PLGA完全溶解，形成油相（O）。</li>
	<li>将步骤2.1中生成的全部W1相逐滴加入O相中。使用手持式匀浆器在20,000 rpm条件下乳化30秒，形成W1/O相。</li>
	<li>将步骤2.3中得到的全部W1/O相逐滴加入15 ml 1%（质量/体积）的聚乙烯醇（PVA）水溶液中，并使用手持式匀浆器在20,000 rpm条件下乳化30秒。</li>
	<li>将步骤2.4中生成的全部乳液转移至200 ml圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在635 mm Hg真空条件下处理1小时，以去除溶剂并形成水相。</li>
	<li>将步骤2.5中得到的水相分装至14个微量离心管中，每管1 ml。在微量离心管中以7,500 × g离心8分钟。 
	注意：此步骤中，微球存在于剩余的水溶液中，并在微量离心管底部沉淀富集。</li>
	<li>使用移液器小心从微量离心管中移除900 µl水溶液，移液时避免扰动管底的微球。
	<ol>
		<li>通过向每个微量离心管中加入1 ml去离子水，洗涤去除微球表面残留的PVA。在7,500 × g条件下离心8分钟，再次使用移液器小心移除900 µl水溶液，避免扰动管底微球。 
		注意：剩余的100 µl水溶液中含有制备得到的微球。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>将步骤2.7中得到的含微球水溶液在-80 °C条件下冷冻。</li>
	<li>根据冻干机制造商的说明对微球进行冻干，并在-20 °C条件下保存。 
	注意：通过完全溶解PLGA微球，并依据游离蛋白的标准曲线测定蛋白浓度，计算COI的包封率7。</li>
	<li>作为阴性对照，制备一批&#34;空白&#34;微球（以下简称对照微球）。 
	注意：对照微球的制备方法与亲水性COI负载微球完全相同，仅在步骤1.2中不向800 µl载体溶液中添加COI。在β细胞有丝分裂原实验中，对照微球的PLGA质量浓度应与COI负载PLGA微球相匹配。</li>
</ol>
3. 胰岛培养基和预实验培养基的制备
<ol>
	<li>准备200 ml用于培养完整小鼠胰岛的培养基：RPMI 1640培养基，添加11 mM葡萄糖、10%马血清、100 U/ml青霉素G和100 µg/ml链霉素（下文简称胰岛培养基）。 
	注1：与胎牛血清（FBS）不同，马血清不含胎盘催乳素（一种β细胞增殖诱导因子），可避免在增殖检测中干扰分析结果。 
	注2：由于PLGA微球在使用前未经过灭菌处理，因此在培养基中添加抗生素至关重要，以防止微生物污染。</li>
	<li>使用电子移液器移取25 ml胰岛培养基，置于50 ml锥形管中。向该50 ml锥形管中的25 ml胰岛培养基中加入EGTA，使其终浓度为0.2 mM，配制为预处理培养基。 
	注：EGTA的加入可轻微松解胰岛内细胞间的连接，但不破坏胰岛整体结构。这有助于确保COI渗透至胰岛内部细胞，并防止胰岛中心区域发生坏死。</li>
</ol>
4. 小鼠完整胰岛的培养
<ol>
	<li>根据预先选定的小鼠品系、性别、年龄和基因型，通过常规的胶原酶消化胰腺方法分离完整的胰岛8,9。将来源相同的样品胰岛合并在一起。</li>
	<li>将40个胰岛分装至96孔组织培养板的单个孔中，每孔加入200 µl胰岛培养基。通过肉眼观察使各孔中的胰岛大小相匹配（无需在样品间精确评估胰岛当量（IEQ））。在含有胰岛的孔周围紧邻的空孔中立即加入200 µl无菌水，以提供蒸发缓冲。将胰岛置于37 °C、95%空气和5% CO2的气氛中培养过夜。</li>
</ol>
5. COI 负载型与对照 PLGA 微球的重悬
<ol>
	<li>胰岛过夜恢复后，向一份冻干的COI负载PLGA微球中加入预实验培养基，重悬微球，使微量离心管中COI的终浓度为10 ng/µl（所生成微球中COI含量已在步骤2.9中测定）。将重悬的COI负载微球置于冰水浴中，4 °C下以160 W功率、10秒脉冲持续超声处理10分钟。</li>
	<li>向等质量的冻干空白PLGA微球中加入相同体积的预实验培养基，重悬对照组微球。将重悬的空白PLGA微球置于冰水浴中，4 °C下以160 W功率、10秒脉冲持续超声处理10分钟。</li>
	<li>取2 µl重悬微球液滴于两片玻璃盖玻片之间，通过移液观察微球是否分散均匀。使用倒置荧光显微镜或明场显微镜的40倍物镜观察微球形态。</li>
	<li>若仍可见明显微球聚集，需将样品再次置于冰水浴中，4 °C下以160 W功率、10秒脉冲额外超声处理10分钟，并重复微球重悬液的观察步骤。</li>
</ol>
6. 使用COI负载或对照PLGA微球处理胰岛
<ol>
	<li>对于每个需用COI负载微球处理的孔，通过将重悬的COI微球（10 ng/µl）用预处理培养基稀释至终体积100 µl及预设的终浓度，来制备检测培养基。 
	注意：该检测中所用每种COI蛋白的最适终浓度可能不同。理想情况下，应测试一系列不同的终浓度。</li>
	<li>对于每个设为对照的孔，通过将第5.2步制备的重悬对照PLGA微球用与第6.1步中COI负载微球相同的稀释体积进行稀释，来制备对照检测培养基。 
	注意：用对照检测培养基处理的胰岛将作为阴性对照，以检测空白微球可能对实验结果产生的任何影响。</li>
	<li>使用微量移液器小心从每个孔中移除100 µl胰岛培养基，确保不使胰岛脱离孔壁。随后轻柔地向每孔加入100 µl检测培养基或100 µl对照检测培养基。</li>
	<li>将胰岛在37 °C、95%空气和5% CO2的气氛条件下孵育三天。</li>
</ol>
7. 将完整胰岛分散至显微镜载玻片上
<ol>
	<li>三天后，使用微量移液器小心地从所有孔中移除并弃去检测培养基，注意不要使胰岛脱落。轻轻加入 200 µl PBS 以洗涤胰岛，去除残留的检测培养基。再用微量移液器小心地吸出并弃去 PBS，并用另外 200 µl PBS 再次轻轻洗涤胰岛。</li>
	<li>用微量移液器移除并弃去 PBS，每孔加入 100 µl 含 0.025% 胰蛋白酶和 2 mM EDTA 的溶液。室温孵育 3 分钟。每隔 2 分钟用移液器将胰岛在胰蛋白酶-EDTA 溶液中上下吹打一次，直至在光学显微镜下确认胰岛已分散为单个细胞（注意可能仍存在少量小细胞团）。将每孔的全部液体分别转移至已标记的微量离心管中。</li>
	<li>向每个微量离心管中加入 400 µl 胰岛培养基，以终止胰蛋白酶介导的细胞解离。</li>
	<li>将样品在 4 °C 条件下以 100 × g 离心 5 分钟，使胰岛细胞沉淀至微量离心管底部。</li>
	<li>用微量移液器小心吸除上清液，并将沉淀重悬于 200 µl 新鲜的胰岛培养基中。</li>
	<li>使用细胞离心机，将解离后的胰岛以 140 × g 离心 3 分钟，使其沉降到带电荷的显微镜载玻片上。</li>
	<li>室温下将载玻片空气干燥 10 分钟，然后用疏水性标记笔在解离的胰岛周围画出一个方框。</li>
	<li>用 75 µl 4% 多聚甲醛（PFA）在室温下固定细胞 10 分钟。去除 4% PFA 后，用 75 µl PBS 轻轻洗涤细胞两次。洗涤后，加入含 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液 75 µl，室温透化 10 分钟。随后用 75 µl PBS 洗涤细胞。 
	注意：PFA 已知具有致敏性、致癌性和毒性。</li>
</ol>
8. 胰岛素及细胞增殖标志物Ki67在解离胰岛中的免疫荧光标记
<ol>
	<li>通过在容量为100片的显微镜载玻片盒底部放置两张湿润的纸巾来制备一个湿化室。</li>
	<li>将载玻片平放（细胞面朝上）放入湿化室中。使用移液器吸去前一步洗涤中残留的PBS，并在每张载玻片上加入75 µl封闭液（含5%正常驴血清（NDS）的PBS），以阻断抗体与样本之间的非特异性结合。在室温下将载玻片在封闭液中孵育1小时。</li>
	<li>使用移液器轻轻吸去封闭液，并在每张载玻片上加入75 µl一抗溶液，其中包含豚鼠抗胰岛素抗体和兔抗Ki67抗体，用含5% NDS的PBS将抗体稀释至1 µg/ml。在室温下孵育1小时。 
	注意：其他可用于标记细胞增殖的标志物包括增殖细胞核抗原（PCNA）和磷酸化组蛋白H3（PH3）。</li>
	<li>使用移液器轻轻吸去一抗溶液，用75 µl PBS冲洗细胞。再用移液器吸去PBS，并重复冲洗两次，每次使用75 µl PBS。每份样本中加入75 µl二抗溶液，其中包含抗豚鼠IgG-Cy5和抗兔IgG-Cy3二抗，用封闭液稀释至2 µg/ml，在室温下孵育1小时。 
	注意：请勿使用已用于标记微球的相同或光谱重叠的荧光染料标记的二抗。</li>
	<li>使用移液器吸去二抗溶液，并加入75 µl含300 nM DAPI的PBS溶液，在室温下孵育3分钟。再用移液器吸去DAPI溶液，并用去离子水冲洗5分钟。</li>
	<li>使用移液器轻轻吸去样本上的水分。在玻璃盖玻片上滴加一滴（约100 µl）含抗荧光淬灭剂的快速干燥封片剂。将显微镜载玻片的样本面朝下倒置在封片剂上。用移液器吸头轻轻按压盖玻片以去除气泡，并用柔软的擦拭纸擦去多余的液体。在室温下静置过夜，使盖玻片完全干燥。</li>
</ol>
9. 图像采集与分析
<ol>
	<li>使用配备相机的落射荧光显微镜进行图像采集。针对每种荧光染料，确定最佳曝光时间（DAPI 通常为 20 毫秒，胰岛素为 40–80 毫秒，Ki67 为 250 毫秒）。确保所有样本的图像采集参数保持一致。</li>
	<li>对每个样本，手动计数 3,000 个胰岛素阳性细胞，并统计其中同时为 Ki67 阳性的细胞数量。仅计数具有明确且清晰可见细胞核的胰岛素阳性细胞。通过将 Ki67 阳性/胰岛素阳性细胞数除以胰岛素阳性细胞总数再乘以 100，计算每个样本中增殖性 β 细胞的百分比。</li>
	<li>在确定每个样本中增殖性 β 细胞的百分比后，使用商业统计软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA），以判断对照样本与实验样本之间的 β 细胞增殖率是否存在统计学显著差异。</li>
</ol>

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</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

在培养条件下研究β细胞增殖通常面临多种困难。首先，永生化β细胞系的增殖程度高于活体胰岛中内源性β细胞的增殖水平。此外，这些永生化细胞系缺乏维持正常β细胞功能所必需的正常细胞结构。上述两点使得难以判断利用永生化β细胞系获得的研究结果在应用于内源性β细胞时是否依然成立 体内 或整个胰岛中。我们所描述的方案采用新鲜分离的完整小鼠胰岛，可避免上述问题，因为胰岛结构得以维持，且β细胞增殖水平与体内情况相当 体内.
培养完整胰岛时的一个重要问题是胰岛核心内的细胞可能发生缺氧诱导的坏死，或无法充分接触重组人CTGF（rhCTGF）。因此，在培养基中添加终浓度为0.1 mM的EGTA，以松解细胞间连接，同时不破坏胰岛的整体结构。我们此前已发表研究指出，单独添加EGTA即可促进β细胞增殖，这可能是由于培养基中的营养物质和有丝分裂原更易进入胰岛核心12。EGTA诱导的β细胞增殖增加也可能源于细胞间接触减少本身所引发的效应13,14。本实验方案中所述培养基使用马血清替代了更常用的胎牛血清。这一替换的原因在于胎牛血清中含有胎盘...

胰腺β细胞是体内唯一产生胰岛素的细胞，对维持血糖稳态至关重要。健康个体具有足够的β细胞质量和功能，以适当调节血糖水平；而糖尿病患者则表现为β细胞质量不足和/或功能缺陷。1,2有研究提出，诱导β细胞增殖最终可增加β细胞质量，并恢复糖尿病患者的葡萄糖稳态3然而，在开发有效的治疗方法之前，必须在完整的胰岛中对潜在的β细胞增殖化合物进行评估和验证。将尸体来源的人胰岛移植给糖尿病患者可在一段时间内恢复血糖稳态，但该实验性手术的可用性和成功率受到可用于移植的人胰岛数量不足以及移植后胰岛内β细胞死亡的限制。4即使发现了能够诱导胰岛素生成细胞增殖的因子，如何将这些因子递送至靶部位仍然是一个重大挑战 体内一种实现β细胞增殖化合物持续局部递送的策略是使用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）。由于PLGA具有高安全性、可生物降解性以及长效释放动力学，已被广泛应用于美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物递送产品中。5具体而言，PLGA 是乳酸和乙醇酸的共聚物，可通过水解反应在水的作用下降解 体内 或在培养中降解为乳酸和乙醇酸，二者均为体内天然存在的代谢物。包封的药物化合物可通过扩散和/或降解控制释放机制在周围环境中释放。COI 的包封可防止其发生酶解降解，与未包封的 COI 相比，提高了试剂的生物利用度5我们建议，PLGA微球可用于向培养中的完整胰岛递送候选化合物，并最终 体内测试PLGA向胰岛递送β细胞有丝分裂原的有效性 离体 在探索移植方案之前，这一点至关重要。
目前尚无技术可在活体动物中测量β细胞增殖。为评估潜在促增殖化合物的有效性而开展的实验 体内 因此需要将这些化合物施用于活体动物，随后解剖并处理胰腺组织以进行免疫标记。这类方案成本高昂且耗时费力，同时要求化合物通过全身给药，无法确保其有效到达胰岛。相比之下，目前已有多种永生化β细胞系可用于体外培养中胰岛素分泌细胞的研究，但这些细胞系缺乏活体中胰岛所具备的组织结构与微环境6永生化β细胞系的特征之一是其复制能力远高于内源性β细胞 体内，从而增加了对诱导增殖化合物分析的复杂性。在本研究中，我们描述了一种利用从成年小鼠分离的完整胰岛的实验方案。与β细胞系不同，完整的胰岛保留了正常的胰岛结构。同样，与以往开展的实验相比 体内向培养的完整胰岛直接施加促增殖化合物可显著减少准确测量β细胞增殖所需的试剂用量。
本研究利用PLGA递送一种COI，在此示例中为重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）。该方法相较于直接向培养的胰岛中添加原始化合物具有显著优势，因其可实现化合物在培养基中的持续释放。值得注意的是，该检测方法可经修改后用于向完整的胰岛递送多种感兴趣的蛋白质和抗体。此外，还可分析其对其他内分泌细胞类型（包括α细胞）的影响。

<table><tbody><tr><td>俄勒冈绿 488 乙酸，琥珀酰亚胺酯，6-异构体</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>O6149</td><td>用于用荧光染料标记待测化合物</td></tr><tr><td>DMSO 二甲基亚砜</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-1</td><td>用于第1步中溶解荧光染料</td></tr><tr><td>一次性 PD-10 脱盐柱</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01</td><td>步骤1中使用的脱盐柱</td></tr><tr><td>Resomer RG 505，聚(D,L-丙交酯-共-乙交酯)，酯端基，分子量 54,000 - 69,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>739960</td><td>用于第2步微球制备</td></tr><tr><td>聚乙烯醇分子量 89,000 - 98,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341584</td><td>用于第2步中微球的制备</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>11879-020</td><td>用于胰岛培养</td></tr><tr><td>无水右旋糖</td><td>Fisher BioReagents</td><td>200-075-1</td><td>胰岛培养基补充剂</td></tr><tr><td>青霉素-链霉素</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4333</td><td>胰岛培养基用抗生素</td></tr><tr><td>正常马血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>008-000-121</td><td>胰岛培养基补充剂</td></tr><tr><td>96孔组织培养板</td><td>康宁</td><td>3603</td><td>用于胰岛培养</td></tr><tr><td>乙二醇双(2-氨基乙基醚)-&lt;em&gt;N,N,N',N&#039;&lt;/em&gt;四乙酸</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>预实验用胰岛培养基补充剂</td></tr><tr><td>Cytospin 4 细胞离心涂片机</td><td>赛默飞世尔科技</td><td>A78300003</td><td>用于将细胞离心至显微镜载玻片上</td></tr><tr><td>EZ单细胞进样器</td><td>Thermo Scientific</td><td>A78710020</td><td>用于将细胞离心至显微镜载玻片</td></tr><tr><td>乙二胺四乙酸</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP118-500</td><td>用于解离胰岛</td></tr><tr><td>多聚甲醛</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>用于固定细胞</td></tr><tr><td>曲拉通&amp;nbsp; X-100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP151</td><td>用于细胞透化</td></tr><tr><td>正常驴血清</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td>免疫荧光封闭试剂</td></tr><tr><td>抗Ki67抗体</td><td>abcam</td><td>ab15580</td><td>Ki67 免疫荧光检测</td></tr><tr><td>多克隆豚鼠抗胰岛素</td><td>Dako</td><td>A0564</td><td>胰岛素免疫荧光检测</td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure 驴抗兔</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td>Ki67 免疫荧光检测</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure 驴抗豚鼠</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>706-175-148</td><td>胰岛素免疫荧光检测</td></tr><tr><td>DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐）</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>D1306</td><td>用于免疫荧光中的细胞核可视化</td></tr><tr><td>Aqua-Mount</td><td>Lerner Laboratories</td><td>13800</td><td>快速干燥封片介质</td></tr><tr><td>FreeZone -105 &amp;deg;C 4.5 升级联台式冷冻干燥系统</td><td>Labconco</td><td>7382020</td><td>用于微球的冻干</td></tr></tbody></table>

对完整小鼠胰岛持续给予β细胞有丝分裂原 离体 使用可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球

Sustained Administration of &#946;-cell Mitogens to Intact Mouse Islets Ex Vivo Using Biodegradable Poly(lactic-co-glycolic acid) Microspheres

生物材料的发展显著提升了将药物靶向递送至多种细胞和组织类型（包括胰腺β细胞）的潜力。此外，生物材料颗粒、水凝胶和支架还为在培养体系及移植组织模型中向β细胞进行持续、可控的药物递送提供了独特的机会。这些技术使得研究人员能够在保持胰岛完整性的前提下，利用具有转化医学相关性的系统来研究候选的β细胞增殖因子。而且，在推进到后续研究之前，确定这些候选因子在培养体系中促进β细胞增殖的有效性和可行性至关重要。 体内 模型。本文描述了一种将完整的小鼠胰岛与负载待测化合物（COI）的可生物降解聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球共培养的方法，旨在评估持续释放的COI对胰岛功能的影响。 原位 促有丝分裂因子对β细胞增殖的影响。本技术详细描述了如何使用市售试剂制备包含特定负载物的PLGA微球。尽管本方法以重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）为例，但可轻松适用于多种其他货物分子（COI）。此外，该方法采用96孔板以最大限度减少评估β细胞增殖所需的试剂用量。本方案可便捷地拓展应用于其他生物材料，以及评估其他内分泌细胞特性，如细胞存活率和分化状态。

图1 是采用上述方案制备的微球的可视化图示。本方案可制备出不同尺寸的重组人结缔组织生长因子（rhCTGF）负载微球。大多数微球的直径范围在1至10 µm之间，但部分微球可能更大（图2）。如有需要，可通过调节制备参数（如均质速度与时间、所用表面活性剂浓度以及各水/油/水相的相对体积）来优化和调控微球的尺寸10。
在将经PLGA微球处理的完整胰岛分散并进行免疫标记后，通常会在细胞之间的样本区域观察到无任何标记的空白区域（图3）。尽管在培养处理期结束后，大多数仍保持完整的微球会在洗涤步骤中被去除，但在胰岛被离心至显微镜载玻片后，仍有部分微球残留。这些微球在成像过程中会形成类似孔洞的结构。这些残留的微球通常不会干扰后续的定量分析。
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本文介绍了一种方法，用于制备并施加负载目标化合物的聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）微球至体外培养的完整小鼠胰岛，并随后进行β细胞增殖的免疫荧光分析。该方法适用于评估候选β细胞有丝分裂原的有效性。

生物材料的发展极大地提升了将药物靶向递送至多种细胞和组织类型的潜力，包括……

本实验方案的主要目标是利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic Acid)，简称PLGA）微球，将目标化合物递送至体外培养的完整胰岛，以研究单个化合物对成年胰腺β细胞增殖的影响。该方法可用于在完整胰岛中局部、持续释放多种不同化合物。该方法的主要优势在于，可轻松适配于其他递送用生物材料、目标化合物以及终点检测方法。该方法还有望在体内胰岛移植过程中，同时递送感兴趣的化合物。接下来，由我实验室的研究生 Taylor Kavanaugh 演示如何制备 PLGA 微球。首先，将一毫克荧光标记的感兴趣化合物加入 100 微升去离子水中，形成第一水相。接下来，将65毫克PLGA溶解于750微升二氯甲烷中，置于闪烁瓶内，并在160瓦功率下超声处理10至30秒，以完全溶解PLGA。此步骤形成油相。将全部第一水相以滴加方式加入油相中。然后使用手持式匀浆器在 20,000 rpm 条件下乳化溶液 30 秒，形成第一水-油相。接着将全部第一水-油相逐滴加入 15 毫升 1% PVA 溶液中，并按前述方法进行乳化。随后，将全部乳化液体转移至 200 毫升圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在 635 毫米汞柱真空度下蒸发溶剂 1 小时，以生成水相。将1毫升水相等分至14个微量离心管中，通过离心使微球沉淀。离心结束后，使用微量移液器从每管中小心移除900微升水溶液，注意不要扰动沉淀。用1毫升去离子水洗涤微球，随后小心移除900微升上清液。然后向剩余的100微升上清液中加入900微升去离子水。短暂涡旋振荡并进行超声处理，以重新悬浮沉淀物。从目标实验动物中分离胰岛后，将40个肉眼观察大小匹配的胰岛接种至96孔组织培养板的其中一个孔中，每孔加入200微升胰岛培养基。次日早晨，将一份微球重悬于预实验培养基中，使试管中目标化合物的终浓度为 10 纳克/微升，并在冰水浴中以 160 瓦功率、4 摄氏度条件下超声处理微球，采用 10 秒脉冲，持续 10 分钟。随后，小心从每个孔中移除 100 微升胰岛培养基，避免扰动胰岛，然后向各培养孔中加入 100 微升含微球的实验培养基进行孵育。三天后，小心弃去所有孔中的实验培养基，避免扰动胰岛，并用 200 微升 PBS 轻柔洗涤胰岛两次。胰岛仅轻微附着于96孔板上。因此，从每个孔中轻柔地移除培养基和PBS至关重要，以避免胰岛意外脱落并被丢弃。第二次洗涤后，在室温下将胰岛轻轻浸入100微升胰蛋白酶EDTA溶液中孵育3分钟，并在2分钟后轻柔吹打。将每个孔中的全部液体转移至单独的微量离心管中，每管加入400微升胰岛培养基以终止消化。离心收集微球处理后的胰岛后，用移液器轻轻吸除上清液，并将沉淀物重悬于200微升新鲜胰岛培养基中。随后，使用细胞离心涂片机将消化后的胰岛离心至带电荷的显微镜载玻片上。空气干燥后，使用疏水性标记笔在胰岛周围画一个方框，然后在室温下用75 µL的4%多聚甲醛固定细胞10分钟，随后用75 µL的PBS洗涤两次。第二次洗涤后，用含0.2% Triton X-100的75 µL PBS对细胞进行透化处理10分钟，再用75 µL PBS单独进行最后一次洗涤。为对胰岛进行免疫标记，首先将载玻片细胞面向上置于湿盒中，并吸除PBS。接下来，在室温下用 75 微升正常驴血清封闭非特异性结合位点。一小时后，吸除血清，加入 75 微升目标一抗溶液，在室温下继续孵育一小时。孵育结束后，小心吸除一抗溶液，并用 375 微升 PBS 缓冲液洗涤样品。然后将胰岛与75微升相应的荧光标记二抗在室温下避光孵育一小时。孵育结束后，弃去二抗溶液，加入75微升Dappy染核试剂，孵育三分钟，随后用去离子水漂洗五分钟。漂洗结束后，取100微升含抗荧光淬灭剂的快速封片液滴于玻璃盖玻片上，将一张载玻片的样本面向下倒置在封片液上。微球的最大比例部分直径在1-10微米之间，尽管部分微球可能更大。在完整PLGA微球处理的胰岛分散并进行后续免疫标记后，通常会观察到样本中细胞之间存在无任何标记的区域，这是由于洗涤步骤中未完全去除的完整微球所致。成像后，可通过软件图像分析或手动计数标记细胞的总数，来量化Ki67胰岛素阳性细胞的百分比。将完整胰岛用重组人结缔组织生长因子 PLGA 微球处理三天，如上所述，可导致β细胞增殖增加，表明该蛋白质在微球制备过程中未丧失任何功能活性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在不到一周的时间内获得结果。在进行此实验时，需注意实验中β细胞增殖的影响程度将取决于目标化合物以及所制备微球的确切释放动力学。通过该操作流程，还可以开展其他方法，例如将负载化合物的微球与完整的胰岛共同移植，以回答其他科学问题，比如目标化合物是否可在体内诱导β细胞增殖。PLGA 已被用于多种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的医疗器械和药物递送系统，因此对于希望在较长时间内向特定组织递送治疗性物质的研究人员和临床医生而言，是一种理想的选择。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备负载化合物的 PLGA 微球，并将其应用于培养的完整胰岛。请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行本操作时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备。

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