对完整小鼠胰岛持续给予β细胞有丝分裂原 离体 使用可生物降解的聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球

本实验方案的主要目标是利用聚乳酸-羟基乙酸共聚物（Poly(lactic-co-glycolic Acid)，简称PLGA）微球，将目标化合物递送至体外培养的完整胰岛，以研究单个化合物对成年胰腺β细胞增殖的影响。该方法可用于在完整胰岛中局部、持续释放多种不同化合物。该方法的主要优势在于，可轻松适配于其他递送用生物材料、目标化合物以及终点检测方法。

该方法还有望在体内胰岛移植过程中，同时递送感兴趣的化合物。接下来，由我实验室的研究生 Taylor Kavanaugh 演示如何制备 PLGA 微球。首先，将一毫克荧光标记的感兴趣化合物加入 100 微升去离子水中，形成第一水相。

接下来，将65毫克PLGA溶解于750微升二氯甲烷中，置于闪烁瓶内，并在160瓦功率下超声处理10至30秒，以完全溶解PLGA。此步骤形成油相。将全部第一水相以滴加方式加入油相中。

然后使用手持式匀浆器在 20,000 rpm 条件下乳化溶液 30 秒，形成第一水-油相。接着将全部第一水-油相逐滴加入 15 毫升 1% PVA 溶液中，并按前述方法进行乳化。随后，将全部乳化液体转移至 200 毫升圆底烧瓶中，使用旋转蒸发仪在 635 毫米汞柱真空度下蒸发溶剂 1 小时，以生成水相。

将1毫升水相等分至14个微量离心管中，通过离心使微球沉淀。离心结束后，使用微量移液器从每管中小心移除900微升水溶液，注意不要扰动沉淀。用1毫升去离子水洗涤微球，随后小心移除900微升上清液。

然后向剩余的100微升上清液中加入900微升去离子水。短暂涡旋振荡并进行超声处理，以重新悬浮沉淀物。从目标实验动物中分离胰岛后，将40个肉眼观察大小匹配的胰岛接种至96孔组织培养板的其中一个孔中，每孔加入200微升胰岛培养基。

次日早晨，将一份微球重悬于预实验培养基中，使试管中目标化合物的终浓度为 10 纳克/微升，并在冰水浴中以 160 瓦功率、4 摄氏度条件下超声处理微球，采用 10 秒脉冲，持续 10 分钟。随后，小心从每个孔中移除 100 微升胰岛培养基，避免扰动胰岛，然后向各培养孔中加入 100 微升含微球的实验培养基进行孵育。三天后，小心弃去所有孔中的实验培养基，避免扰动胰岛，并用 200 微升 PBS 轻柔洗涤胰岛两次。

胰岛仅轻微附着于96孔板上。因此，从每个孔中轻柔地移除培养基和PBS至关重要，以避免胰岛意外脱落并被丢弃。第二次洗涤后，在室温下将胰岛轻轻浸入100微升胰蛋白酶EDTA溶液中孵育3分钟，并在2分钟后轻柔吹打。

将每个孔中的全部液体转移至单独的微量离心管中，每管加入400微升胰岛培养基以终止消化。离心收集微球处理后的胰岛后，用移液器轻轻吸除上清液，并将沉淀物重悬于200微升新鲜胰岛培养基中。随后，使用细胞离心涂片机将消化后的胰岛离心至带电荷的显微镜载玻片上。

空气干燥后，使用疏水性标记笔在胰岛周围画一个方框，然后在室温下用75 µL的4%多聚甲醛固定细胞10分钟，随后用75 µL的PBS洗涤两次。第二次洗涤后，用含0.2% Triton X-100的75 µL PBS对细胞进行透化处理10分钟，再用75 µL PBS单独进行最后一次洗涤。为对胰岛进行免疫标记，首先将载玻片细胞面向上置于湿盒中，并吸除PBS。

接下来，在室温下用 75 微升正常驴血清封闭非特异性结合位点。一小时后，吸除血清，加入 75 微升目标一抗溶液，在室温下继续孵育一小时。孵育结束后，小心吸除一抗溶液，并用 375 微升 PBS 缓冲液洗涤样品。

然后将胰岛与75微升相应的荧光标记二抗在室温下避光孵育一小时。孵育结束后，弃去二抗溶液，加入75微升Dappy染核试剂，孵育三分钟，随后用去离子水漂洗五分钟。漂洗结束后，取100微升含抗荧光淬灭剂的快速封片液滴于玻璃盖玻片上，将一张载玻片的样本面向下倒置在封片液上。

微球的最大比例部分直径在1-10微米之间，尽管部分微球可能更大。在完整PLGA微球处理的胰岛分散并进行后续免疫标记后，通常会观察到样本中细胞之间存在无任何标记的区域，这是由于洗涤步骤中未完全去除的完整微球所致。成像后，可通过软件图像分析或手动计数标记细胞的总数，来量化Ki67胰岛素阳性细胞的百分比。

将完整胰岛用重组人结缔组织生长因子 PLGA 微球处理三天，如上所述，可导致β细胞增殖增加，表明该蛋白质在微球制备过程中未丧失任何功能活性。一旦掌握该技术，若操作得当，可在不到一周的时间内获得结果。在进行此实验时，需注意实验中β细胞增殖的影响程度将取决于目标化合物以及所制备微球的确切释放动力学。

通过该操作流程，还可以开展其他方法，例如将负载化合物的微球与完整的胰岛共同移植，以回答其他科学问题，比如目标化合物是否可在体内诱导β细胞增殖。PLGA 已被用于多种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准的医疗器械和药物递送系统，因此对于希望在较长时间内向特定组织递送治疗性物质的研究人员和临床医生而言，是一种理想的选择。观看本视频后，您应能够充分掌握如何制备负载化合物的 PLGA 微球，并将其应用于培养的完整胰岛。

请注意，使用多聚甲醛可能具有极高危险性，进行本操作时应始终采取预防措施，例如佩戴适当的个人防护装备。