Name: 成像前中期和减数分裂中期的我固定技术果蝇卵母细胞 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: 学习制备黑腹果蝇卵母细胞用于细胞学检查的技术，通过去除卵膜实现抗体渗透，利用免疫荧光成像观察减数第一次分裂中期的纺锤体组装和染色体定向。该方法为研究无中心体情况下的纺锤体双极性和染色体双定向机制提供了可靠的实验方案。

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我们感谢 Christian Lehner 提供 CENP-C 抗体，以及 Eric Joyce 在 FISH 实验方面的建议。McKim 实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号 GM101955）。

注意：除非另有说明，所有操作均在室温下进行。果蝇培养和杂交使用温度控制的培养箱维持温度，除非另有说明。
1. 准备工作
<ol>
	<li>准备果蝇。
	<ol>
		<li>富集早中期分裂相卵母细胞的收集方法
		<ol>
			<li>从健康且年轻的果蝇品系或杂交培养物中清除成虫。在 25 °C 下培养两天。 
			&#8203;注意：通常两个健康的培养瓶已足够，但某些交叉培养可能需要更多。</li>
			<li>两天后，从培养瓶中收集约100至300只雌蝇（此时雌蝇日龄为0至2天），雌蝇无需为处女蝇。在小试管壁一侧添加少量酵母糊，每管放入30只雌蝇和10至15只雄蝇。将加有酵母的试管置于25 °C条件下培养两天。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>中期富集的卵母细胞收集
		<ol>
			<li>从品系或杂交培养物中收集约100至300只雌蝇。在试管壁一侧加入少量酵母糊，将30只雌蝇（不添加雄蝇）分别放入含酵母的试管中。于25 °C条件下培养3至5天。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>配制溶液。 
	&#8203;注意：除非另有说明，溶液可在室温下长期保存。
	<ol>
		<li>制备改良Robb缓冲液（5倍浓度）：500 mM HEPES、500 mM 蔗糖、275 mM 醋酸钠、200 mM 醋酸钾、50 mM 葡萄糖、6 mM 氯化镁和5 mM 氯化钙。使用10 N 氢氧化钠:氢氧化钾（11:8）调节pH至7.4。过滤除菌，勿高压灭菌。于-20 °C保存。根据需要解冻，用于配制每份卵母细胞实验所需的约200 ml 1倍浓度Robb缓冲液。</li>
		<li>固定液溶液。
		<ol>
			<li>选项一：制备甲醛/庚烷固定液。配制固定缓冲液：1×磷酸盐缓冲液（PBS）加150 mM蔗糖。使用时，每份卵母细胞样品需新鲜配制，取687.5 µl固定缓冲液与312.5 µl 16%甲醛混合。 
			警告：在通风橱中使用甲醛溶液时需佩戴手套。废弃物应按照机构规定进行处理。</li>
			<li>选项二：配制甲醛/卡可基酸盐固定液。配制固定混合液（Fix Mix）：250 mM 蔗糖、100 mM 醋酸钾（pH 7.5）、25 mM 醋酸钠（pH 7.0）和 25 mM EGTA（pH 8.0）。使用时每份卵母细胞样品新鲜配制，加入 400 µl 固定混合液、100 µl 二甲胂酸钾（1 M，pH 7.2）和 500 µl 16% 甲醛。 
			&#8203;警告：二甲基亚砷酸钾含有砷。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>配制 PBS/Triton X-100：将 1x PBS 与 1% 或 0.05% Triton X-100 混合。4 °C 保存。</li>
		<li>制备PBS-Tween 20-牛血清白蛋白（BSA）溶液（PTB）：1× PBS，0.5% BSA（w/v），0.1% Tween-20。可在4 °C保存一周。</li>
		<li>荧光 原位 杂交（FISH）溶液
		<ol>
			<li>配制20倍浓度的氯化钠-柠檬酸钠（SSC）溶液：3 M 氯化钠和0.3 M 柠檬酸钠。</li>
			<li>制备2倍浓度SSC-吐温-20（SSCT）：在2× SSC中加入0.1%吐温-20。每次卵母细胞制备前新鲜配制，约20 ml。</li>
			<li>配制甲酰胺溶液：2x SSC、0.1% Tween-20 加甲酰胺。每份卵母细胞样品需新鲜配制 1 ml 20% 甲酰胺、0.5 ml 40% 甲酰胺和 2 ml 50% 甲酰胺。 
			注意：在通风橱中使用甲酰胺溶液时需佩戴手套。废弃物应按照机构规定进行处理。</li>
			<li>制备杂交液：2x SSC、50% 甲酰胺和 10% 硫酸葡聚糖（w/v）。4 °C 保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>FISH 探针
		<ol>
			<li>订购寡核苷酸（参见 表1 用于序列的HPLC纯化及所需的5'荧光修饰（例如，Cy3 或 Cy5）。用 TE 缓冲液重悬至 50 ng/µl。 
			&#8203;注意：务必始终避免寡核苷酸暴露于光照下。</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 晚期阶段的收集 果蝇 卵母细胞
<ol>
	<li>作为 果蝇 细胞膜完整的卵母细胞会黏附于塑料和玻璃表面，因此在每次卵母细胞制备前，需用PTB预包被一个5 ml离心管和一支巴斯德吸管的内表面。</li>
	<li>用二氧化碳麻醉约100至300只酵母喂养的果蝇，加入含有约100 ml 1x Robb's缓冲液的匀浆器中。脉冲搅拌三次（每次约1秒）。将卵母细胞保留在Robb's缓冲液中 &#60;20 分钟，以避免激活。 
	注意：也可通过手工解剖雌性个体获取卵母细胞。该方法的优势在于所需雌性个体数量较少。然而，需注意将二氧化碳暴露时间限制在数分钟内，以避免因缺氧引起的假象7.</li>
	<li>通过大孔径滤网（约 1,500 µm）过滤至 250 ml 烧杯中，以去除大块组织部分。若滤网上仍残留较多完整腹部组织，需使用额外 Robb's 缓冲液重新研磨样品，并再次过滤。静置约 2 分钟，然后吸除上层液体，尽可能去除大块组织部分。</li>
	<li>通过小孔径滤网（约 300 µm）过滤至 250 ml 烧杯中。用额外的 Robb's 液和包被的巴斯德吸管将残留的卵母细胞从第一个烧杯中冲洗出。静置约 3 分钟，卵母细胞将沉淀下来。吸除上清液，仅保留约 10 ml。</li>
	<li>将10 ml液体尽可能倒入已包被的5 ml离心管中。静置后弃去上清，重复处理剩余液体。用额外的Robb's溶液和包被的巴斯德吸管将烧杯中剩余的卵母细胞冲洗出来。在5 ml离心管中静置约3–5分钟。</li>
</ol>
3. 药物处理（可选）
<ol>
	<li>为每份卵母细胞样品准备另一只5 ml离心管，并用PTB包被。向每份卵母细胞样品的1 ml Robb's溶液中加入相应的溶剂（对照）或药物（表2）。</li>
	<li>将卵母细胞分装至第二只已包被的5 ml离心管中。静置后吸除液体，向其中一管加入1 ml Robb's溶液加溶剂，向另一管加入1 ml Robb's溶液加药物。根据药物处理要求孵育适当时间（表2），然后静置。</li>
</ol>
4. 固定
<ol>
	<li>吸去所有液体，并立即加入 1 ml 固定液。</li>
	<li>方案 #1：甲醛/庚烷固定法（固定缓冲液加 5% 甲醛）。
	<ol>
		<li>在振荡器上固定 2.5 分钟。加入 1 ml 庚烷，涡旋振荡 1 分钟。静置约 1 分钟。</li>
		<li>吸去所有液体，然后加入 1 ml 1× PBS。涡旋振荡 30 秒。静置约 1 分钟。</li>
		<li>吸去所有液体，然后用 1× PBS 充满离心管。 
		注意：卵母细胞可立即使用，或在室温下置于振荡器上保存数小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>方案 #2：甲醛/二甲胂酸盐固定法（固定混合液加 8% 甲醛和 100 mM 二甲胂酸盐）。
	<ol>
		<li>在振荡器上固定 6 分钟。静置 2 分钟。吸去液体，然后用 1× PBS 充满离心管。 
		&#8203;注意：卵母细胞可立即使用，或在室温下置于振荡器上保存数小时。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 去除膜结构（&#34;滚动&#34;）
<ol>
	<li>使用包被的巴斯德吸管，将约 500 至 1,000 个卵母细胞加入到玻璃载玻片的磨砂（喷砂）区域。用镊子去除所有身体组织和其他多余物质。切勿让卵母细胞干燥；必要时添加 1× PBS。</li>
	<li>将盖玻片置于卵母细胞上方，轻轻&#34;滚动&#34;卵母细胞，直至所有膜结构被去除（用盖玻片边缘在卵母细胞上拖动效果最佳）。定期在显微镜下检查操作进展，必要时补充更多 1× PBS。注意力度，过大的压力会破坏卵母细胞。 
	&#8203;注意：仅进行免疫荧光染色时，继续执行步骤 6；如需进行 FISH（无论是否联合免疫荧光染色），则继续执行步骤 7。</li>
</ol>
6. 抗体染色 黑腹果蝇 卵母细胞
<ol>
	<li>提取与封闭
	<ol>
		<li>将卷曲的卵母细胞冲洗至含有约 15 ml PBS/1% Triton X-100 的 15 ml 圆锥形离心管中。在此溶液中轻轻旋转孵育卵母细胞，时间不少于 1.5 小时且不超过 2 小时。此步骤有助于抗体渗透。</li>
		<li>让卵母细胞静置约 2 分钟。吸除液体并尽可能去除细胞膜碎片，然后加入 PBS/0.05% Triton X-100。 
		&#8203;注意：细胞膜碎片的沉降速度比卷曲的卵母细胞更慢。</li>
		<li>让卵母细胞静置约 2 分钟，然后吸除液体，仅保留约 1 ml。将卵母细胞转移至带刻度的 1.5 ml 离心管中，并吸除剩余液体。加入 1 ml PTB 进行封闭，在旋转仪上孵育 1 小时。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>抗体染色
	<ol>
		<li>针对胚胎进行二抗的预吸附处理。 
		&#8203;注意：此步骤可消除二抗与果蝇（Drosophila）蛋白非特异性结合导致的背景染色。
		<ol>
			<li>按照常规方法收集并固定果蝇（Drosophila）胚胎（约 25 µl）8。在 -20 °C 条件下保存于甲醇中。</li>
			<li>去除胚胎中的甲醇，加入 800 µl 甲醇和 200 µl 1x PBS，旋转孵育 15 分钟。吸除 500 µl 上清液，并替换为 500 µl 1x PBS。再次旋转孵育 15 分钟。重复该洗涤步骤两次（总洗涤时间约为 1 小时），最后将胚胎置于 PTB 中。 
			&#8203;注意：胚胎可立即使用，也可在室温下置于旋转仪上保存数小时。</li>
			<li>去除液体，按每份卵母细胞样品加入 200 µl PTB，并加入适当稀释倍数的荧光标记二抗（注意最终体积为 300 µl；参见步骤 7.4）。在 4 °C 条件下旋转孵育过夜（推荐）或在室温下孵育 3 至 4 小时。 
			注意：预吸附后的抗体将在步骤 6.2.4 中使用。 
			&#8203;注意：一旦加入荧光标记抗体，应尽可能将样品避光保存。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>去除卵母细胞中的液体，加入 PTB 至 300 µl，并加入适当稀释倍数的一抗。在 4 °C 条件下旋转孵育过夜（推荐）或在室温下孵育 3 至 4 小时。</li>
		<li>用 1 ml PTB 对卵母细胞洗涤 4 次，每次 15 分钟。</li>
		<li>去除卵母细胞中的液体，加入 200 µl 胚胎上清液（含预吸附的二抗），然后补加 PTB 至总体积 300 µl。在室温下旋转孵育 3 至 4 小时（推荐）或在 4 °C 条件下过夜孵育。</li>
		<li>用 1 ml PTB 洗涤卵母细胞一次，每次 15 分钟，吸除液体。然后加入 0.5 µl Hoechst 33342 和 500 µl PTB，在旋转仪上孵育 7 分钟。</li>
		<li>用 1 ml PTB 洗涤卵母细胞两次，每次 15 分钟。 
		&#8203;注意：卵母细胞可立即封片观察，或在 4 °C 条件下保存于 PTB 中，待成像时再取出使用。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. 荧光原位杂交（从上述第5步继续）
<ol>
	<li>将卷曲的卵母细胞冲洗至含有约15 ml 2x SSCT的15 ml锥形管中。静置约2分钟使卵母细胞沉淀。除去上清液至仅剩约0.5 ml，并尽可能去除所有膜结构。 
	注意：膜的沉降速度比卷曲的卵母细胞慢。</li>
	<li>将卵母细胞转移至0.5 ml离心管中，去除残留液体。依次加入并移除500 µl的20%、40%和50%甲酰胺溶液，每种溶液中均旋转孵育10分钟。 
	注意：甲酰胺浓度越高，卵母细胞沉降速度越慢。</li>
	<li>吸除液体，加入500 µl 50%甲酰胺溶液，37 °C下振荡孵育1至5小时。 
	注意：延长孵育时间可提高探针渗透效果。</li>
	<li>移除液体，残留不超过约100 µl的卵母细胞，加入36 µl杂交溶液、2 µl探针（50 ng/µl）和2 µl水，或2 µl的2nd 探针（表1).</li>
	<li>91 °C 孵育 3 分钟（仅 FISH）或 80 °C 孵育 20 分钟（FISH 结合免疫荧光），随后在 37 °C 水浴中过夜孵育。 
	注意：这些步骤可在热循环仪中进行。</li>
	<li>不要移除液体。加入500 µl 50%甲酰胺溶液，37 °C下振荡孵育1小时。</li>
	<li>静置，弃去上清液，加入500 µl 50%甲酰胺溶液，37 °C下振荡孵育1小时。</li>
	<li>静置，弃去上清液，加入500 µl 20%甲酰胺溶液，室温下振荡孵育10分钟。</li>
	<li>用500 µl 2x SSCT快速洗涤三次（静置，弃上清，加入液体，颠倒混匀数次，重复操作）。静置后弃去液体，加入500 µl PTB，4小时内进行振荡孵育。</li>
</ol>
8. FISH 后的抗体染色
<ol>
	<li>移除卵母细胞中的液体，加入PTB补足至300 µl，再加入10 µl与FITC偶联的抗α-微管蛋白抗体。也可根据上述方案使用其他抗体。室温下振荡孵育过夜。</li>
	<li>用500 µl PTB洗涤卵母细胞一次，每次15分钟，移除液体后，加入0.5 µl Hoechst 33342和500 µl PTB，振荡孵育7分钟。</li>
	<li>用500 µl PTB洗涤卵母细胞两次，每次15分钟。 
	注意：卵母细胞可立即封片观察，或暂时保存在4 °C的PTB中，待成像时取出。一旦加入荧光抗体，应尽可能将卵母细胞避光保存。</li>
</ol>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td fo:width="1in">重复名称</td>
			<td fo:width="1in">染色体</td>
			<td>寡核苷酸序列*</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>359</td>
			<td>X</td>
			<td>GGGATCGTTAGCACTGGTAATTAGCTGC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AACAC</td>
			<td>2</td>
			<td>AACACAACACAACACAACACAACACAACACAACACAACAC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dodeca</td>
			<td>3</td>
			<td>CCCGTACTGGTCCCGTACTCGGTCCCGTACTCGGT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.686</td>
			<td>2+3</td>
			<td>AATAACATAGAATAACATAGAATAACATAG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AATAT</td>
			<td>4(+Y)</td>
			<td>AATATAATATAATATAATATAATATAATAT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="3">*359序列来自Eric Joyce的个人交流，其他序列来自Sullivan 等8</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：用于黑腹果蝇着丝粒重复序列的FISH探针。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>药物</td>
			<td>溶剂</td>
			<td>储存浓度</td>
			<td>终浓度</td>
			<td>处理时间</td>
			<td>效应</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>colchicine</td>
			<td>ethanol</td>
			<td>125 mM</td>
			<td>150 µM</td>
			<td>10 分钟或 30 分钟</td>
			<td>破坏动粒外微管（10 分钟）9 或全部微管（30 分钟）</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paclitaxel</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>10 mM</td>
			<td>10 µM</td>
			<td>10 分钟</td>
			<td>稳定微管</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binucleine 2</td>
			<td>DMSO</td>
			<td>25 mM</td>
			<td>25 µM</td>
			<td>20 分钟</td>
			<td>抑制 Aurora B 激酶10</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2：药物处理。

<ol><li>Bridges, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-disjunction+as+proof+of+the+chromosome+theory+of+heredity%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Non-disjunction as proof of the chromosome theory of heredity.</a> Genetics. 1 (1), 1-52 (1916).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Theurkauf, W. E., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meiotic+spindle+assembly+in+Drosophila+females%3A+behavior+of+nonexchange+chromosomes+and+the+effects+of+mutations+in+the+nod+kinesin-like+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Meiotic spindle assembly in Drosophila females: behavior of nonexchange chromosomes and the effects of mutations in the nod kinesin-like protein.</a> J Cell Biol. 116 (5), 1167-1180 (1992).</li>
<li>Zou, J., Hallen, M. A., Yankel, C. D., Endow, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtubule-destabilizing+kinesin+motor+regulates+spindle+length+and+anchoring+in+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A microtubule-destabilizing kinesin motor regulates spindle length and anchoring in oocytes.</a> J Cell Biol. 180 (3), 459-466 (2008).</li>
<li>Dernburg, A. F., Sedat, J. W., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+evidence+of+a+role+for+heterochromatin+in+meiotic+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Direct evidence of a role for heterochromatin in meiotic chromosome segregation.</a> Cell. 86 (1), 135-146 (1996).</li>
<li>Gilliland, W. D., Hughes, S. F., Vietti, D. R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Congression+of+achiasmate+chromosomes+to+the+metaphase+plate+in+Drosophila+melanogaster+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Congression of achiasmate chromosomes to the metaphase plate in Drosophila melanogaster oocytes.</a> Dev Biol. 325 (1), 122-128 (2009).</li>
<li>Gilliland, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+transiently+sequesters+mps1+and+polo+to+collagenase-sensitive+filaments+in+Drosophila+prometaphase+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoxia transiently sequesters mps1 and polo to collagenase-sensitive filaments in Drosophila prometaphase oocytes.</a> PLoS One. 4 (10), e7544(2009).</li>
<li>Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSullivan%2C+W+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Radford, S. J., Hoang, T. L., Głuszek, A. A., Ohkura, H., McKim, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+and+End-On+Kinetochore+Attachments+Are+Coordinated+to+Achieve+Bi-orientation+in+Drosophila+Oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Lateral and End-On Kinetochore Attachments Are Coordinated to Achieve Bi-orientation in Drosophila Oocytes.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005605(2015).</li>
<li>Smurnyy, Y., Toms, A. V., Hickson, G. R., Eck, M. J., Eggert, U. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binucleine+2%2C+an+isoform-specific+inhibitor+of+Drosophila+Aurora+B+kinase%2C+provides+insights+into+the+mechanism+of+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Binucleine 2, an isoform-specific inhibitor of Drosophila Aurora B kinase, provides insights into the mechanism of cytokinesis.</a> ACS Chem Biol. 5 (11), 1015-1020 (2010).</li>
<li>Mahowald, A. P., Goralski, T. J., Caulton, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+activation+of+Drosophila+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro activation of Drosophila eggs.</a> Dev Biol. 98 (2), 437-445 (1983).</li>
<li>Page, A. W., Orr-Weaver, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+meiotic+divisions+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of the meiotic divisions in Drosophila oocytes.</a> Dev Biol. 183 (2), 195-207 (1997).</li>
<li>Tavosanis, G., Llamazares, S., Goulielmos, G., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+for+gamma-tubulin+in+the+acentriolar+female+meiotic+spindle+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Essential role for gamma-tubulin in the acentriolar female meiotic spindle of Drosophila.</a> EMBO J. 16 (8), 1809-1819 (1997).</li>
<li>Endow, S. A., Komma, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+dynamics+during+meiosis+in+Drosophila+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spindle dynamics during meiosis in Drosophila oocytes.</a> J Cell Biol. 137 (6), 1321-1336 (1997).</li>
<li>Matthies, H. J., Clarkson, M., Saint, R. B., Namba, R., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMatthies%2C+HJ+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 67-85 (2000).</li>
<li>Colombié, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+roles+of+Incenp+crucial+to+the+assembly+of+the+acentrosomal+metaphase+spindle+in+female+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dual roles of Incenp crucial to the assembly of the acentrosomal metaphase spindle in female meiosis.</a> Development. 135 (19), 3239-3246 (2008).</li>
</ol>

作者无任何利益冲突需要披露。

分期 果蝇 卵母细胞
尽管在前中期卵母细胞中经常观察到拉长的核体，但使用核体形状来区分前中期和中期卵母细胞可能存在困难。在前中期过程中，核体最初呈圆形，随后拉长，接着在卵母细胞接近中期阻滞时又回缩为圆形。这意味着许多前中期卵母细胞并不具有拉长的核体。此外，如果检测的是突变体或药物处理的卵母细胞，核体形状可能受到影响，从而无法使用该方法对卵母细胞进行分期。由于目前尚无其他可用于区分这两个阶段的标记物，我们采用上述方法调控雌性Drosophila产卵速度，以富集处于前中期或中期的卵母细胞。其原理在于：如果卵母细胞在前中期停留的时间相对固定，而在中期则进入不确定时长的阻滞状态，直至产卵为止，那么较快的产卵速度将导致前中期卵母细胞的比例更高，而较慢的产卵速度则有利于中期卵母细胞的富集。正如Gilliland et al.6，所述，收集处女雌蝇或在短于2天的时间段内收集雌蝇所需付出的额外努力，并不能显著提高前中期卵母细胞的数量。此外，使用本方案制备的卵母细胞无法利用...

减数分裂的研究有时被称为“遗传学中的遗传学”。这是因为在配子形成过程中，染色体的分离实现了染色体遗传和自由组合的基本特性。1916年，卡尔文·布里奇斯（Calvin Bridges）的工作为染色体遗传理论提供了重要证据 黑腹果蝇1。这一研究及其他经典遗传学研究在 果蝇 极大地促进了我们对遗传学的理解。减数分裂染色体的细胞学检查在 果蝇 卵母细胞的免疫荧光检测一直具有挑战性，这主要是因为晚期阶段的 果蝇 卵母细胞在纺锤体组装和染色体定向分离时，由于膜结构的存在，导致抗体无法穿透卵母细胞，从而阻碍了相关研究。
尽管存在这一挑战，Drosophila 卵母细胞仍是研究染色体行为和纺锤体组装的优良模型。这不仅得益于 Drosophila 中强大的遗传学工具，还因为其卵母细胞在减数分裂 I 期的中期发生停滞，此时染色体已定向排列，纺锤体也已完全形成。这使得研究人员能够在此细胞分裂的关键阶段收集并检测大量卵母细胞。此外，一种易于进行遗传操作的简单模式生物，可用于研究卵母细胞中染色体的分离过程，从而为理解人类生殖健康提供重要贡献。染色体数目异常是人类流产和出生缺陷最主要的遗传学原因2。大多数此类错误起源于卵母细胞，并与母亲年龄的增长呈正相关。美国女性的平均生育年龄持续上升，使这一问题成为重要的公共卫生挑战。
我们在此描述用于细胞学检查的方法 果蝇 卵母细胞，包括去除卵母细胞膜的操作演示。这些方法是对Theurkauf和Hawley首次描述的实验方案的改进3，邹 等4，以及 Dernburg 等5我们还包含了基于Gilliland首次描述的方案对不同发育阶段卵母细胞进行富集的方法 等6. 最后，我们添加药物治疗的说明 果蝇 卵母细胞。这些方法共同实现了对卵母细胞染色体分离和纺锤体组装的细胞学研究 果蝇.

<table><tbody><tr><td>15 ml 锥形管</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% 甲醛</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>18505</td><td>危险品；开启后一个月内丢弃</td></tr><tr><td>250 ml 烧杯</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 ml 管</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>活性干酵母</td><td>Various</td><td></td><td>与水混合制成类似花生酱稠度的糊状物</td></tr><tr><td>与 FITC 偶联的抗&amp;alpha;-微管蛋白抗体</td><td>Sigma</td><td>F2168</td><td>克隆株 DM1A</td></tr><tr><td>Binucleine 2</td><td>Sigma</td><td>B1186</td><td>危险品</td></tr><tr><td>搅拌器</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>牛血清白蛋白</td><td>Sigma</td><td>A4161</td><td></td></tr><tr><td>氯化钙</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>秋水仙素</td><td>Sigma</td><td>C-9754</td><td>危险品</td></tr><tr><td>盖玻片</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>No. 1 1/2</td></tr><tr><td>硫酸葡聚糖</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙醇</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>镊子</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>5622</td><td>Dumont 高精度 5 号镊</td></tr><tr><td>甲酰胺</td><td>Sigma</td><td>47670-250ML-F</td><td></td></tr><tr><td>载玻片</td><td>VWR</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>葡萄糖</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>带刻度的 1.5 ml 管</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>VWR</td><td>EM-5330</td><td>可从多家供应商获得</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化镁</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>甲醇</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>大孔筛网（~1,500 &amp;micro;m）</td><td>VWR</td><td>AA43657-NK</td><td>多种规格及其他供应商，12 或 14 目</td></tr><tr><td>小孔筛网（~300 &amp;micro;m）</td><td>Spectrum labs</td><td>146 424</td><td>多种规格，&lt;em&gt;例如&lt;/em&gt;，146 422 或 146 486</td></tr><tr><td>旋转混合仪</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>巴斯德吸管</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸钾</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>二甲胂酸</td><td>Sigma</td><td>C0125</td><td>危险品；也可用二甲胂酸钠替代</td></tr><tr><td>氢氧化钾</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>乙酸钠</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氯化钠</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>柠檬酸钠</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>氢氧化钠</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>蔗糖</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>紫杉醇（paclitaxel）</td><td>Sigma</td><td>T1912</td><td>危险品</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>PI-28314</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher</td><td>PI-28320</td><td></td></tr><tr><td>涡旋振荡器</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

固定样品中减数分裂i期前中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

人类卵母细胞中的染色体分离容易出错，导致非整倍体，这是流产和出生缺陷最主要的遗传原因。通过对模式生物卵母细胞中染色体行为的研究，有望揭示人类卵母细胞易发生非整倍体的分子基础。 黑腹果蝇 适用于遗传操作，已有超过一百年的研究历史，在群体和技术创新方面积累了丰富经验。可视化染色体行为和纺锤体组装 黑腹果蝇 卵母细胞具有特殊的挑战，主要由于包围卵母细胞的膜结构对抗体不可渗透。本文描述了减数分裂Ⅰ期纺锤体组装及染色体行为的卵母细胞采集、制备与成像实验方案 果蝇 卵母细胞，可借此对该重要模式生物中的染色体分离过程进行分子机制解析。

我们在此所述的方法将能够收集到晚期阶段的 果蝇 代表减数分裂三个阶段的卵母细胞（图1）。减数分裂前期的卵母细胞可通过核膜的存在加以区分，核膜表现为核周体周围区域无微管蛋白信号。图1A）。前中期是核膜破裂后纺锤体组装的时期。在前中期，核质体呈现独特的形态，通常变得细长，并具有4个th 除主核仁染色体团外的染色体（图1B）。前中期以中期结束，此时 果蝇 卵母细胞在自然状态下会停滞直至排卵。在中期卵母细胞中，核质收缩成圆形图1C).
我们在此介绍调控产卵速度的方法 果蝇 雌性个体以富集处于早中期或中期的卵母细胞。来自早中期富集样本的卵母细胞常显示出拉长的核体结构（图2A）而富含中期的细胞群体或来自未交配 果蝇...

我们介绍了成熟 Drosophila 卵母细胞的收集、制备和成像的实验方案。这些方法可用于观察减数分裂过程中染色体的行为以及纺锤体的组装与功能。

固定样品中减数分裂I期前中期和中期的成像技术 果蝇 卵母细胞

人类卵母细胞中的染色体分离容易出错，导致非整倍体，这是流产和出生缺陷最主要的遗传学原因。

本实验的总体目标是制备果蝇卵母细胞，以便在减数分裂 I 期间对纺锤体组装和染色体定向进行细胞学观察。该方法有助于回答减数分裂领域中的关键问题，例如双极纺锤体如何建立，以及在无中心粒的情况下染色体如何实现双取向。该技术的主要优势在于可有效去除阻碍抗体渗透的卵母细胞膜，从而实现免疫荧光染色。首先，用 PTB 预处理 5 毫米试管和移液管内壁，以防止卵母细胞粘附在器皿表面。向搅拌器中加入 100 毫升 ROB 缓冲液，然后加入 100 至 300 只麻醉的果蝇，脉冲搅拌三次，每次一秒钟。将所得匀浆液通过孔径约 1,500 微米的大孔滤网过滤至 250 毫升烧杯中。静置滤液约两分钟，然后吸除上层液体，尽可能去除较大的组织碎片。将悬液再次过滤至一个250毫升烧杯中，使用孔径为300微米的较小滤网。用包被过的移液管中的额外缓冲液冲洗第一个烧杯，以收集残留的卵母细胞。让悬液静置3分钟，然后吸除上清液，仅保留底部10毫升。将10毫升液体尽可能多地倒入已包被的5毫升离心管中。静置约2分钟后，小心移除上清液。加入剩余的10毫升悬液，再次静置后移除液体。使用包被移液管中的额外缓冲液冲洗烧杯中残留的卵母细胞。将冲洗液静置于5毫升离心管中3至5分钟。固定卵巢时，首先吸除组织中的所有液体，然后立即加入1毫升固定液（Fix Mix）。将组织置于振荡器上振荡2分30秒。随后加入1毫升正庚烷，涡旋振荡1分钟，再静置1分钟使卵母细胞沉降。移除沉降后的组织上清液，加入1毫升1×PBS。将离心管涡旋振荡30秒，然后静置卵母细胞1分钟。随后，吸除管内所有液体，并加入5毫升1×PBS。使用包被的移液管，将大约500至1,000个卵母细胞加到磨砂玻璃载片上。使用镊子去除多余的组织或杂质。将盖玻片置于组织上方，轻轻滚动卵母细胞，直至所有膜结构被去除。用盖玻片边缘轻轻刮过卵母细胞表面，效果良好。定期在显微镜下检查膜去除的进展情况。过大的压力会破坏卵母细胞。最有效的卵母细胞去膜方法是将卵母细胞最大程度的移动与最小程度的压力相结合。用轻柔的触碰和快速的动作将盖玻片边缘在卵母细胞上拖过。开始提取和封闭步骤时，向一个50毫升离心管中加入15毫升PBS 1%Triton X-100。将卷起的卵母细胞冲洗入该管中，并在旋转仪上孵育1.5至2小时。静置卵母细胞两分钟后，吸除液体并尽可能去除所有膜结构，加入50毫升含0.05%Triton X-100的PBS。再静置两分钟，随后吸除除约1毫升外的全部液体。将卵母细胞转移至一支带刻度的1.5毫升离心管中，并吸除剩余液体。加入1毫升PTB用于封闭，轻轻振荡孵育1小时。移除卵母细胞中的液体，然后加入300微升PTB。接着加入适当稀释倍数的目标一抗，若使用荧光标记抗体，需注意避光处理样品。在4摄氏度下孵育过夜。用1毫升PTB洗涤卵母细胞，每次15分钟，共洗涤四次。弃去液体，加入200微升经二抗处理的胚胎的上清液。用PTB将体积调至300微升，然后在室温下旋转孵育三到四小时。用1毫升PTB将卵母细胞洗涤一次，持续15分钟。接着，吸去液体，加入0.5微升Hoechst 33342和500微升PTB。以七分钟时间进行水平摇动孵育。用一毫升 PTB 溶液清洗卵母细胞，每次十五分钟，共清洗两次。样品可立即采用标准共聚焦显微镜技术进行封片与成像，或于四摄氏度条件下在 PTB 中保存，待需要时使用。利用本演示技术生成的晚期卵母细胞图像如图所示，捕捉到了减数分裂的三个不同阶段。处于前期的卵母细胞可通过核膜的存在加以区分，由于核周区域缺乏微管蛋白信号，核膜清晰可见。在前中期，核周质呈现出明显的伸长形态，第四条染色体与核周质主体分离。 中期也被捕获，可见核仁收缩成圆形。此处使用不同抗体进行免疫染色，显示了经甲醛和庚烷固定的卵母细胞中的纺锤体、着丝粒和中心纺锤体。用秋水仙碱处理的卵母细胞表现出非标准表型，大多数非动粒微管被消除，导致所有微管均与着丝粒标记为 Phocyde 的 DNA 接触。使用紫杉醇处理后，卵母细胞胞质中出现过多的微管。最后，用Binucleine 2处理以抑制Aurora B激酶的卵母细胞，则表现出纺锤体微管的完全丧失。在尝试该操作时，需注意去除卵母细胞膜时切勿操之过急，因为该步骤的成功与否直接决定了整个实验方案的成败。初学者通常会遇到困难，因为去除膜结构需要耐心和练习。因此，最好通过观察他人成功操作来学习该技术。一旦掌握，卵母细胞的剥离可在5到10分钟内完成。但耗时长达30分钟也不会影响结果的质量。观看本视频后，您应充分掌握如何制备晚期果蝇卵母细胞，以用于观察生物纺锤体的组装、纺锤体的组织结构、染色体运动以及染色体的双取向。感谢观看，祝您的实验顺利。

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科研

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生物学

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