表征活体生物膜中的电子传递

本实验方案的总体目标是确定电流在原位条件下通过活体材料的能力，以及活体材料传导电流所采用的机制。该方法有助于回答微生物电化学领域的一些关键问题，例如：某些生物膜如何将电子传递数百微米以支持细胞代谢？该技术的主要优势在于，叉指电极具有极高的信噪比，并可按需缩放以适配多种不同的反应器构型。

这些方法可用于研究生物膜中跨多细胞长度的胞外电子传递过程，也可应用于其他体系，例如导电聚合物薄膜。由于该方法需要使用双恒电位仪分别设置两个电极的电位，并分别测量每个电极上的电流，初学者可能会面临操作上的困难。

首先，获取 commercially available IDA 电极（其已图案化于非导电基底上），或使用标准光刻方法自行制备。按照制造商说明，用搅拌棒或移液器吸头配制导电银环氧树脂。然后，将导线放置于每个金焊盘上，并用实验室胶带固定。

使用混合棒或移液器吸头将银环氧树脂覆盖在导线和焊盘上。小心地将装置移至80°C的烘箱中，加热一小时以固化环氧树脂。环氧树脂固化后，使用万用表检测导线末端与焊盘之间的电导通性。

导线与焊盘之间的电阻应小于五欧姆。同时，使用万用表检查是否有导电环氧树脂将多个电极焊盘连接在一起，因为这可能导致阵列短路。如果发现导电环氧树脂连接了多个引线，请使用划线工具将引线隔离。

接下来，切下15毫升锥形离心管的管尖，用作绝缘材料的模具。使用21号针头在模具底部钻两个小孔，以便导线穿过。将IDA插入模具中，并将导线从模具底部的小孔中穿出。

接下来，准备一种热电及防水绝缘材料。阻燃型聚氨酯树脂通常较为合适。用移液器将绝缘材料加入模具中，确保完全覆盖银环氧树脂，并根据制造商的说明让绝缘材料干燥。

构建电化学池时，将叉指阵列电极（IDA）、对电极和参比电极插入电化学池中。向电化学池中加入适合生物膜生长的无菌培养基。对于地杆菌（Geobacter sulfurreducens），使用不含反丁烯二酸的淡水培养基。

接下来，将电极连接至双恒电位仪。将一个叉指阵列（IDA）电极连接至工作电极导线一，另一个IDA电极连接至工作电极导线二，参比电极连接至参比电极导线，对电极连接至对电极导线。通过在电极一上进行循环伏安法测试，同时将电极二保持在开路电位，开展对照实验，以确认电极之间未发生连接。

为了培养相应的电活性生物膜，使用标准的无菌微生物技术，从储备培养物或所需电化学活性微生物的富集培养物中接种电化学反应器。对于标准测试，接种量按接种物体积与反应器体积的1至20的比例进行。根据目标生物膜的生长条件，将反应器内的搅拌速度调节至所需水平，并将培养箱或水浴温度设定至所需温度。

根据目标微生物的具体需求孵育系统，直至生物膜连接两个电极之间的间隙。对于静止状态的硫还原地杆菌（Geobacter sulfurreducens）生物膜，在30摄氏度下孵育七至十天。同时开始设置实验参数，用于测定门控测量中的电流-电位依赖关系，具体步骤详见文本方案。

设置双恒电位仪软件，在选定的源漏电压和扫描速率下，对选定范围进行门控测量。此外，按照文本方案所述进行基线测量。在存在可溶性电子供体或受体的 turnover 条件下，以及在不存在可溶性电子供体或受体的非 turnover 条件下，使用相同条件进行门控测量。

获取一个对照反应器，以确保培养基的设定温度与实际温度一致。将温度计或热电偶置于对照反应器中原本放置IDA的位置。然后，使用双恒电位仪，在选定的温度范围内，分别在 turnover 和非 turnover 条件下对源菌株进行电流测量。

为此，使用双恒电位仪将IDA设定并保持在产生最大传导电流的门电位。在使用水浴或培养箱的板载控制将温度在选定的温度范围内循环的同时，利用双恒电位仪记录最大传导电流。通过培养箱或水浴的板载控制，将温度从一个设定点循环至另一设定点，然后再返回。

这可以确定反应的可逆性，以确保温度循环不会对生物膜造成损害。最后，将温度重置回正常的生长温度，并让系统达到稳定状态。此处展示的是在淡水培养基中正常发挥作用的IDA的代表性结果。

与电极发生短路的情况相对。在非周转条件下，对硫还原地杆菌（Geobacter sulfurreducens）生物膜进行的代表性电化学门控测量显示，当源极电压为10毫伏时，传导电流随门电位变化呈现典型的峰形曲线，这是氧化还原电导的特征。此处，代表性原始数据展示了传导电流对反应器培养基温度的依赖性。

随着温度降低，传导电流减小是氧化还原导体的另一个特征。只要掌握该技术，若操作得当，大约可在两天内完成。在进行该操作时，需注意确保在接种反应器之前，叉指电极（IDA）的电极带未发生短路。

该技术在研究如何破坏形成生物膜的病原体的细胞代谢时，可进一步拓展至治疗领域的应用。此方法可应用于任何能够传递电子的活体材料，以探讨其他科学问题，例如生物膜流变学特性与导电性之间的关联。